WO2016108446A1 - 락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물 Download PDF

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김환묵
정근영
심재준
장영수
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    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
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    • A61N2005/1098—Enhancing the effect of the particle by an injected agent or implanted device

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a lactate metal salt. More specifically, the present invention relates to a lactate which can effectively inhibit the action of cancer cells, such as proliferation, invasion and metastasis by disturbing metabolic processes of cancer cells.
  • Cancer treatment pharmaceutical composition comprising a lactate metal salt that can dissociate in cancer cells as an active ingredient, pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis and food composition for cancer improvement, cancer treatment method comprising the step of administering the lactate metal salt And a method for inhibiting cancer metastasis.
  • the age standardization rate in Korea adjusted to the world standard population, was 295.1 per 100,000 population, lower than the US (318.0) or Australia (323.0), but higher than the OECD average (271.5).
  • the mortality rate is estimated to be 75,334, 28.3% of all deaths in Korea, based on 2013 data (statistics agency), and the mortality rate is expected to increase at an increase rate of 8.8% in 2 ⁇ 3 years. Therefore, various treatment methods have been tried around the world to treat cancers with high incidence and mortality rates. However, as the active cancer treatment, surgical treatment, chemotherapy or radiation therapy that is possible in early and mid-term cancers is considered as the top priority.
  • the diagnosis and classification of tumors are first known, and most of them are diagnosed through biopsy.
  • Curative resection is the preferred treatment because it belongs to and is cured.
  • the mortality rate of resection has been reduced to less than 1 ⁇ 3% and the survival rate has increased to more than 50% over 5 years.
  • the surgical method is an acute side effect. Complications may include bleeding, intestinal obstruction, vascular injury, ureteral injury, rectal rupture, and pneumonia pulmonary embolism, which may require reoperation.
  • Chemotherapy is a treatment method that works on cancer cells spread throughout the body by treating cancer using drugs, that is, anticancer drugs.
  • anticancer drugs are designed to inhibit the rapid growth of most cancer cells, so they are less damaging than normal cancer cells.
  • normal cells rapidly dividing or proliferating blood cells or epithelial cells of the gastrointestinal tract including the oral cavity, hair cells, germ cells, etc. are affected a lot, and there are side effects causing anemia, hair loss, and reproductive function.
  • the bone marrow is impaired, causing infection within two to three weeks of treatment, and death from sepsis.
  • Radiation treatment refers to a treatment method that induces the death process of cancer tissue by using energy of radiation. It is one of the treatments to be treated while living a normal life, but it causes side effects due to the high energy of radiation, which induces damage to the normal skin of the local area. It has a disadvantage.
  • Korean Patent Publication No. 2002-0042606 discloses a radiotherapy enhancer composition comprising an N-acetyl phytosphingosine derivative and a dimethyl phytosphingosine derivative
  • Korean Patent Publication No. 2003-0055878 discloses ceramides and derivatives thereof.
  • a radiation sensitizer including dimethylsphingosine, a sphingosine kinase inhibitor are disclosed.
  • Korean Patent No. 617571 discloses a peonol and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Radiation therapy-sensitive composition is disclosed.
  • the anticancer agents used to enhance the radiotherapy effect are combined with side effects such as inflammation, gastrointestinal disorders, nausea, vomiting, diarrhea, etc., when used in combination with radiation therapy. It is known that there is a limit to use because it may appear, and because the environment itself is immunosuppressive, it is difficult to completely eradicate tumors and there is a high risk of recurrence.
  • cancer cells have inherent characteristics, maintain their characteristics, and are capable of sustained growth. Firstly, there is a characteristic of continuously maintaining differentiation signal, which is well known for cell differentiation and survival by maintaining beta-catenin signal. Normal cells inhibit beta-catenin signaling through protein ubiquitination, but tumors maintain growth signals by avoiding beta-catenin degradation. Secondly, in terms of cell energy, cancer cells produce high-efficiency energy with a system that produces excessive amounts of lactic acid through glycolysis. Thirdly, it has a characteristic of avoiding cell death process.
  • PARP poly ADP ribose polymerase
  • the inventors of the present invention in order to develop a method for treating cancer by effectively inhibiting the proliferation of cancer cells, as a result of intensive research, it is possible to dissociate lactate in cancer cells that can effectively inhibit the action of cancer cells proliferation, invasion, metastasis It was confirmed that the lactate metal salt can be used as an active ingredient of an anticancer agent, and completed the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating cancer comprising lactate metal salt as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising lactate metal salt as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a food composition for cancer improvement comprising a lactate metal salt as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating cancer comprising the step of administering a lactate metal salt.
  • the lactate metal salt of the present invention without adverse side effects, disrupts metabolic processes of cancer's main energy production pathway, inhibits the growth of cancer cells, induces death, and induces expression of factors that induce resistance to irradiation. Inhibition may be widely used for more effective chemotherapy.
  • 1 is a schematic diagram and a diagram comparing the structure and binding energy of sodium lactate and potassium lactate having a structure similar to the molecular structure of calcium lactate.
  • Figure 2 is a fluorescence picture showing the result of comparing the level of calcium in the cancer cells, depending on the treatment of calcium lactate (CaLa).
  • Figure 3 is a graph showing the results of comparing the levels of lactate in cancer cells, depending on the treatment of calcium lactate (CaLa).
  • Figure 4 is a graph showing the change in pH in the internal and external environment of the cancer cells treated with calcium lactate, the left side shows the pH change of the extracellular environment, the right side shows the pH change of the intracellular environment.
  • 5 is an electrophoresis photograph showing the result of comparing the mRNA expression level of ⁇ -catenin in human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29 and DLD-1) treated with various concentrations of calcium lactate
  • 5 is a Western blot analysis showing the results of comparing the protein expression levels of ⁇ -catenin in human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29 and DLD-1) treated with various concentrations of calcium lactate.
  • Figure 7 is a graph showing the effect of calcium lactate on the mRNA expression levels of GLUT 1 and HK2 acting early in glycolysis in the cell line cultured in hypoxic conditions and Western showing the effect of calcium lactate on protein expression levels Blot analysis picture.
  • Figure 10 is a Western blot analysis picture showing the results of comparing the expression levels of PARP protein expressed in human melanoma cell lines (SKMEL-02 and SKMEL-28) treated with various concentrations of calcium lactate.
  • Figure 11a is a fluorescence micrograph showing the change in the protein expression level of LDH-B in cancer cell lines following treatment with calcium lactate.
  • Figure 11b is a fluorescence microscope picture showing the fluorescence absorbance of the cancer cell line itself according to the treatment of calcium lactate.
  • 11c is a graph quantitatively analyzing the color development level of fluorescence according to the protein expression level of LDH-B.
  • 12 is a graph showing changes in the concentration of pyruvic acid in cancer cell lines following treatment with calcium lactate.
  • Figure 13a is a fluorescence micrograph showing the change in the protein expression level of PDH in cancer cell lines following treatment with calcium lactate.
  • Figure 13b is a graph quantitative analysis of changes in protein expression levels of PDH in cancer cell lines following treatment with calcium lactate.
  • Figure 14a is a graph showing the change in the concentration of ⁇ -KG in each cell treated with calcium lactate in cancer cell cultured in normal medium.
  • Figure 14b is a graph showing the change in the concentration of ⁇ -KG in each cell treated with calcium lactate in a cancer cell line cultured in a glutamine-free medium.
  • FIG. 15 shows human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) cultured for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate under normal oxygen supply (normoxia) or oxygen deficiency (hypoxia).
  • Western blot analysis picture showing the expression level of HIF-1 ⁇ protein expressed in the lower part of Figure 15 is treated with 0.5, 1.5 and 2.5mM calcium lactate in hypoxia (hypoxia) and incubated for 24 hours
  • Western blot analysis showing the expression level of HIF-1 ⁇ protein expressed in cancer cell lines (HCT-116 and HT-29).
  • FIG. 16A shows human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) cultured for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate under normal oxygenation (normoxia) or hypoxia (hypoxia). It is a graph showing the result of measuring the mRNA expression level of VEGF to be expressed.
  • FIG. 16B shows human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) cultured for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate under normal or normoxia or hypoxia. It is a graph showing the result of measuring the protein expression level of the expressed VEGF.
  • 17 is a tube forming level of the HUVEC according to the treatment concentration of calcium lactate in human vascular endothelial cells (HUVEC) cultured using a culture supernatant of cancer cell lines cultured by treating various concentrations of calcium lactate. It is a fluorescence photograph showing the result of comparing.
  • HUVEC human vascular endothelial cells
  • Figure 18 is a photograph showing the result of confirming whether the mobility of the colon cancer cell line metastasis according to the treatment of calcium lactate.
  • 19 is a photograph showing the results of confirming whether the mobility of the breast cancer cell line metastasis according to the treatment of calcium lactate.
  • 20 is a photograph showing the results of confirming whether or not the mobility of the melanoma cell line metastasis according to the treatment of calcium lactate.
  • Figure 21a is a photograph showing the result of confirming the mobility according to the treatment of calcium lactate in breast cancer cell line (MCF-7).
  • 21B is a flow cytometry graph showing cell viability when calcium lactate was not treated in breast cancer cell line (MCF-7).
  • 21C is a flow cytometry graph showing cell viability when calcium lactate was treated in breast cancer cell line (MCF-7).
  • Figure 21d is a photograph showing the result of confirming the motility according to the treatment of calcium lactate in breast cancer cell line (MDA-MB231).
  • 21E is a flow cytometry graph showing cell viability when calcium lactate was not treated in breast cancer cell line (MDA-MB231).
  • 21F is a flow cytometry graph showing cell viability when calcium lactate was treated in breast cancer cell line (MDA-MB231).
  • Figure 22 is a micrograph showing the change in the shape of the globular spheroids in the treatment of calcium lactate in colon cancer stem cell lines.
  • Figure 23 is a photograph and graph (left: HCT-116, center: HT-29, right: DLD-1) showing the results of comparing the colonization ability of colorectal cancer cell lines according to the treatment concentration of calcium lactate.
  • Figure 24a is a graph and chart showing the results of comparing the colony forming ability of human melanoma cell line (SKMEL-02) according to the treatment concentration of calcium lactate.
  • Figure 24b is a graph and chart showing the results of comparing the colony forming ability of human melanoma cell line (SKMEL-28) according to the treatment concentration of calcium lactate.
  • 25a compares the survival rate of colorectal cancer cell lines individually treated with calcium lactate and 5-indane sulfornamide (IS) inhibitors of carbonic anhydrase or cinnamic acid (CA) inhibitors of MCT-4, the route of lactate migration. A graph showing the results.
  • IS 5-indane sulfornamide
  • CA cinnamic acid
  • FIG. 25B shows the survival rate of colon cancer cell lines treated with a combination of calcium lactate and 5-indane sulfornamide (IS), an inhibitor of carbonic anhydrase, or cinnamic acid (CA), an inhibitor of MCT-4, a route of lactate.
  • IS 5-indane sulfornamide
  • CA cinnamic acid
  • MCT-4 a route of lactate.
  • Figure 26 is a graph showing the results of comparing the effect of calcium lactate on the survival rate of colorectal cancer cell line cultured in a culture vessel showing low adhesion capacity.
  • Figure 27 is a schematic diagram showing the experimental schedule of calcium lactate using an animal model.
  • Figure 28 is a photograph showing the change in the expression level of PARP according to the treatment of calcium lactate in the protein extracted from the tumor tissue of the animal model and the treatment method.
  • Figure 29 is a photograph showing the change in the expression level of HIF-1 ⁇ or GAPDH according to the treatment of calcium lactate in the protein extracted from the tumor tissue of the animal model orally administered calcium lactate.
  • Figure 30 is a graph showing the change in tumor volume according to the treatment of calcium lactate in the animal model orally administered 2.5Mm calcium lactate.
  • Figure 31 is a Western blot photograph showing the change in the expression level of HIF-1 ⁇ or GAPDH according to the treatment of calcium lactate in the protein extracted from the tumor tissue of the animal model injected with calcium lactate around the cancer tissue.
  • 32 is a graph showing changes in tumor volume according to whether calcium lactate is treated in an animal model injected with 2.5 mM calcium lactate in the vicinity of cancer tissues.
  • Figure 33 is a photograph showing the change in tumor morphology following treatment of 2.5mM calcium lactate in the animal model.
  • 34 is a graph showing the change in tumor volume according to whether calcium lactate was treated in an animal model in which 25 mM calcium lactate was directly injected subcutaneously around the nape of the neck.
  • Figure 35 is a photograph showing the change in tumor morphology according to the treatment of 25mM calcium lactate in the animal model.
  • 36 is a schematic diagram showing an experimental schedule of irradiation and calcium lactate using an animal model.
  • FIG. 37A is a graph showing changes in tumor volume over time when irradiation and calcium lactate were individually or in combination in a cancer-causing animal model prepared by transplanting a HT-29 colon cancer cell line into the flank.
  • FIG. 37B is a graph showing changes in tumor volume over time when irradiation and calcium lactate were individually or in combination with a cancer-causing animal model prepared by transplanting an HCT-116 colorectal cancer cell line into the flank.
  • FIG. 38A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with a human colorectal cancer cell line (HT-29). .
  • 38B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). to be.
  • FIG. 39A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with a human colorectal cancer cell line (HCT-116). .
  • 39B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with a human colorectal cancer cell line (HCT-116). to be.
  • 40a is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and 5-FU at concentrations of 2.5, 5, and 10 ⁇ M alone or in combination with a human colorectal cancer cell line (HT-29). to be.
  • 40b shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and 5-FU at a concentration of 2.5, 5, and 10 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). It is a photograph.
  • Figure 41a is a graph showing the results of comparing the reduction in the number of colonies by treating the human lactate cancer cell line (HCT-116) alone or in combination with 2.5 mM calcium lactate and 2.5, 5 and 10 ⁇ M concentration of 5-FU to be.
  • 41B shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at 2.5 mM concentration and 5-FU at 2.5, 5, and 10 ⁇ M concentrations alone or in combination with human colon cancer cell line (HCT-116). It is a photograph.
  • FIG. 42A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3 and 2.5 nM, alone or in combination with human breast cancer cell lines (MCF-7).
  • 42B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual populations by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3, and 2.5 nM alone or in combination with human breast cancer cell lines (MCF-7). .
  • FIG. 43A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3, and 2.5 nM, alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • FIG. 43B is a photograph showing the results of comparing the degree of inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3, and 2.5 nM, alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • FIG. 44A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of clusters by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and zephytinib at a concentration of 1.3, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • 44B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and zephytinib at a concentration of 1.3, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • FIG. 45A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sorafenib at concentrations of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human liver cancer cell lines (Hep3B).
  • 45B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sorafenib at concentrations of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human liver cancer cell lines (Hep3B).
  • FIG. 46A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and irinotecan at 0.5, 1, and 2 ⁇ M concentrations alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29).
  • 46b is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and irinotecan at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). .
  • FIG. 47A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and erlotinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with a human lung cancer cell line (A549).
  • 47B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lungtate at a concentration of 2.5 mM and erlotinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • FIG. 48A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sunnyinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). to be.
  • FIG. 48B shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sunnyinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). It is a photograph.
  • FIG. 49A is a graph showing a result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and methotrexate at concentrations of 5, 10, and 20 nM alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • 49B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual populations by treating calcium lungtate at a concentration of 2.5 mM and methotrexate at concentrations of 5, 10, and 20 nM alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • Figure 50a is a graph showing the results of comparing the reduction in the number of colonies by treating either alone or in combination with 2.5 mM calcium lactate and 2.5, 5 and 10 ⁇ M carboplatin concentration in human lung cancer cell line (A549).
  • 50B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lungtate at 2.5 mM concentration and carboplatin at 2.5, 5, and 10 ⁇ M concentrations alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • FIG. 51A is a graph showing a result of comparing the reduction of cluster numbers by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and docetaxel at a concentration of 0.6, 1.3, and 2.5 nM alone or in combination with a human lung cancer cell line (A549).
  • 51B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and docetaxel at a concentration of 0.6, 1.3, and 2.5 nM, alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • Figure 52a is a graph showing the results of comparing the reduction in the number of population by treating calcium lactate of 2.5mM concentration and lapatinib of 2, 4 and 8 ⁇ M concentration alone or in combination with human breast cancer cell line (MCF-7).
  • 52B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual populations by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and lapatinib at a concentration of 2, 4, and 8 ⁇ M alone or in combination with human breast cancer cell lines (MCF-7).
  • FIG. 53A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and everolimus at concentrations of 0.3, 0.5, and 1 nM, alone or in combination with human kidney cancer cell line (Caki-1). to be.
  • 53B shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM with everolimus at concentrations of 0.3, 0.5, and 1 nM, alone or in combination with human kidney cancer cell line (Caki-1). It is a photograph.
  • FIG. 54A shows a decrease in the number of colonies by treatment of calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and trastuzumab at concentrations of 0.23, 0.45 and 1.8 ug / ml, alone or in combination with human breast cancer cell line (MCF-7) showing strong resistance to trastuzumab. It is a graph showing the result of comparing the degree.
  • FIG. 54B shows the formation of individual colonies either alone or in combination with 2.5 mM calcium lactate and 0.23, 0.45 and 1.8 ug / ml trastuzumab in human breast cancer cell line (MCF-7) showing strong resistance to trastuzumab. It is a photograph showing the result of comparing a suppression degree.
  • FIG. 55A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and oxaliplatin at a concentration of 1.3, 2.5, and 5 ⁇ M, alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29).
  • 55B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and oxaliplatin at a concentration of 1.3, 2.5, and 5 ⁇ M, alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). .
  • Cancer cells use energy-free glycolytic processes to generate energy from glucose, rather than through the mitochondrial respiratory chain using large amounts of oxygen. Lactate is produced in large amounts in the metabolism of cancer, but due to the inefficiency of cancer cell survival due to the acidity of lactate, except for the proper concentration of lactate, it shows the characteristic of sending out of the cell. Therefore, by artificially administering lactate metal salts to cancer patients to accumulate lactate in cancer cells, the accumulated lactate in cancer cells may cause disturbance of cancer metabolism or constitute a cancer microenvironment unfavorable to cancer survival. As a result, it was assumed that fatal damage could be caused.
  • lactate metal salt was selected as a substance for disturbing the metabolic process of the cancer cells. This is because glucose is converted into pyruvic acid through glycolysis and lactate is formed. Therefore, if the concentration of lactate in cancer cells is accumulated in advance, glycolysis is expected to be slowed or stopped. However, since lactate itself is easily decomposed in the body and difficult to be effectively delivered to cancer cells, it would be effective to use lactate metal salts that are not easily degraded in the extracellular environment and can be degraded after being introduced into cells. Expected.
  • lactate metal salts such as sodium lactate, potassium lactate and calcium lactate, which are not easily metabolized in vivo, among various lactate metal salts, binding to lactate and cancer cells
  • lactate metal salts having excellent tate delivery efficiency calcium lactate not only exhibits the highest level of binding ability to lactate but also shows the highest lactate transfer efficiency to cancer cells. Selected.
  • lactate, lactate dehydrogenase B which affects the metabolism of lactate
  • pyruvate dehydrogenase (PDH) and ⁇ - which affect the metabolism of pyruvate and pyruvate
  • KG ⁇ -ketoglutarate
  • PARP a cancer growth factor
  • HIF-1 ⁇ hypoxia inducible factor 1 ⁇
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • lactate metal salts that exhibit such anticancer activity can be metabolized in vivo in most cases, they are known to have no side effects. Therefore, the lactate metal salts can be used as an active ingredient of cancer treatments or health foods showing safety and excellent anticancer activity.
  • the anticancer effect of such lactate metal salts is not known at all, and was first identified by the present inventors.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising lactate metal salt as an active ingredient as one embodiment.
  • lactate metallic salts refers to compounds that can be produced or synthesized in the form of metal ions bonded to lactic acid.
  • the lactate metal salt is used as a means for increasing the concentration of lactate in the cancer cells by dissociating the lactate, when administered in cancer cells, which can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating cancer of the present invention
  • the lactate metal salt is not particularly limited as long as it can disrupt metabolism of cancer cells, but as an example, it forms a stable form of the compound extracellularly, and dissociates lactate in cancer cells to increase the concentration of intracellular lactate.
  • a compound in a stable form extracellularly it is possible to form a compound in a stable form extracellularly, to dissociate lactate in cancer cells to increase the concentration of intracellular lactate, and to prevent metals from being easily metabolized in the body.
  • Calcium lactate, sodium lactate, potassium lactate, and the like, which are not included, can be used individually or in combination, and as another example, the compound is formed extracellularly in a stable form, and the lactate is dissociated in cancer cells.
  • Calcium lactate can be used which can increase the concentration of intracellular lactate, does not contain metal components that cannot be easily metabolized in the body, and has excellent delivery efficiency to cancer cells.
  • lactate metal salt calcium lactate, sodium lactate and potassium lactate were synthesized, and they were found to be able to dissociate lactate in cancer cells, and among these, the most excellent lactate delivery efficiency calcium lactate. Tate was used to verify various anticancer activities.
  • the calcium lactate is only one example of the lactate metal salt provided in the present invention
  • the lactate metal salt provided in the present invention is not limited to calcium lactate, and various other lactate metal salts of the present invention. Obviously, it can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating cancer.
  • the lactate metal salt may exhibit improved anticancer activity when used in combination with a conventional anticancer agent, since the conventional anticancer agent does not have a mechanism to participate in glycolysis of cancer cells. Therefore, the anticancer agent that may be co-administered with the pharmaceutical composition for treating cancer provided by the present invention is not particularly limited so long as it does not directly act on glycolysis of cancer cells, but as an example, a known anticancer agent Imatinib 5-FU (5-Florouracil), Irinotecan, Sunnytinib, Sunitinib, Oxaliplatin, Paclitaxel, Lapatinib, Trastuzumab, Herceptin, Zefitinib ) Erlotinib, Erlotinib, Methotrexate, Carboplatin, Carboplatin, Docetaxel, Everolimus, Sorafenib, as well as carbonic enzymes known to exhibit anticancer activity 5-indane sulfonamide (IS), an inhibitor of carbonic an
  • the lactate metal salt reduces the expression of PARP, HIF-1 ⁇ and VEGF, which imparts radiation resistance to cancer cells upon irradiation, thereby enhancing the anticancer activity of radiation in combination with irradiation.
  • the radiation dose that can be used is not particularly limited to 2 to 10Gy per day, the radiation may be irradiated once a day, or may be irradiated over several days by dividing the dose.
  • calcium lactate of the present invention is also referred to as calcium lactate or calcium lactate, and is represented by the chemical formula (C 6 H 10 O 6 Ca.5H 2 O) in the form of calcium ions bonded to lactate. It means a kind of lactate metal salt.
  • the calcium lactate has a white powder or granule at room temperature, has a solubility of 5% (w / v), forms anhydrides when heated to 120 ° C, has good utilization and absorption rate in the body, and no side effects are known. It is mainly used as a calcium fortification or acidity regulator of food.
  • the calcium lactate may be used as an example of the lactate metal salt which is an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating cancer provided by the present invention, wherein the calcium bound to the lactate is more available in cancer cells than in normal cells. Because of this high, calcium lactate has an advantage that the lactate transfer efficiency to cancer cells is relatively superior to other types of lactate metal salts.
  • Cancer that can be treated by the pharmaceutical composition for cancer treatment provided by the present invention is not particularly limited as long as proliferation, infiltration, metastasis, etc. can be suppressed by disturbance of metabolic process, for example, disturbance of the corresponding process Lung cancer, breast cancer, colon cancer, gastric cancer, brain cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, uterine cancer, cervical cancer, kidney cancer, melanoma, etc.
  • it may be colon cancer, breast cancer, melanoma, etc., in which proliferation, infiltration, metastasis, and the like can be suppressed by the treatment of the lactate metal salt.
  • calcium lactate, sodium lactate and potassium lactate which are lactate metal salts, which do not contain metals which may be harmful in vivo, among various lactate metal salts.
  • calcium lactate not only showed the highest level of binding force to lactate but also the lactate transfer efficiency to cancer cells was the best.
  • the calcium lactate was finally selected (FIG. 1).
  • FIG. 17 Inhibit cell mobility of colorectal cancer cell line (FIG. 18), breast cancer cell line (FIG. 19) and melanoma cell line (FIG. 20); Increase apoptosis of breast cancer cell lines (FIGS. 21A-21F) and colorectal cancer cell lines (FIG. 22); Inhibits the colonizing ability of colorectal cancer cell lines (FIG. 23) and melanoma cell lines (FIG. 24); When administered in combination with conventional anticancer agents, it was confirmed that increases the anticancer efficiency (Figs. 25a and 25b).
  • the anticancer activity of the calcium lactate was tested using an animal model, and PARP degrading activity was increased in an animal model prepared by transplanting a colon cancer cell line into a mouse (FIG. 28), and expression of HIF-1 ⁇ and VEGF This was confirmed (FIGS. 29 and 31), tumor growth was inhibited (FIGS. 30, 32 and 34), tumor size was reduced and angiogenesis was also reduced (FIGS. 33 and 35).
  • the combination of irradiation and calcium lactate as a result it was confirmed that the tumor growth can be more effectively reduced (Fig. 37).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in the form of a pharmaceutical composition for cancer treatment further comprising a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition.
  • a suitable carrier excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral dosage forms, external preparations, external patches, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • Formulated in the form of can be used.
  • carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, depots, pills, powders, granules, capsules, oral patches, and the like, which may contain at least one excipient in the extract and its fractions, for example, Starch, calcium carbonate (calcium carbonate), sucrose (sucrose) or lactose (lactose), gelatin and the like can be prepared by mixing.
  • lubricants such as magnesium styrate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used in suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, external patches, suppositories, and the like.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the content of the lactate metal salt included in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be included in an amount of 0.0001 to 50% by weight, more preferably 0.01 to 20% by weight based on the total weight of the final composition.
  • the concentration of the lactate metal salt in one dose of the pharmaceutical composition may be 2.5 to 25 mM.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention to treat or prevent a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention
  • Sufficient amount means an effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and the rate of excretion treatment Period of time, factors including drugs used in combination or coincidental with the compositions of the invention used, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with known anticancer agents or ingredients known to exhibit anticancer activity. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the age, weight, sex, history, or type of substance used as an active ingredient of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at about 0.1 ng to about 1,000 mg / kg, preferably 1 ng to about 100 mg / kg, per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention is specifically Although not limited, it can be administered once a day or several times in divided doses.
  • the dose or frequency of administration is not intended to limit the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention provides a method of treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject having cancer in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "individual” of the present invention may include without limitation mammals, farmed fish, and the like, including rats, livestock, humans, and the like with cancer.
  • treatment refers to any action of administering a pharmaceutical composition comprising the lactate metal salt of the present invention as an active ingredient to a subject having cancer to improve or benefit from cancer.
  • the kind of cancer to be treated is the same as described above.
  • composition may be administered in single or multiple amounts in a pharmaceutically effective amount.
  • the composition may be administered in the form of a liquid, powder, aerosol, injection, infusion (ring gel), capsule, pill, tablet, suppository or patch.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition for treating cancer of the present invention may be administered via any general route as long as the target tissue can be reached.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but as desired, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, transdermal patch administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration It can be administered via such a route.
  • oral administration may be administered in an unformulated form, and since the lactate metal salt may be denatured or degraded by gastric acid, the oral composition is formulated to coat the active agent or to protect it from decomposition in the stomach. It can also be administered orally in the form of oral patches.
  • the composition may be administered by any device in which the active substance may migrate to the target cell.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising lactate metal salt and an anticancer agent as an active ingredient.
  • the lactate metal salt provided in the present invention may exhibit improved anticancer activity when used in combination with a conventional anticancer agent, since the conventional anticancer agent does not have a mechanism to participate in glycolysis of cancer cells. to be. Therefore, the anticancer agent which contains the lactate metal salt provided by this invention and the active ingredient of a well-known anticancer agent simultaneously can be used for the more effective cancer treatment.
  • the lactate metal salt, a known anticancer agent, cancer disease to which the pharmaceutical composition for treating cancer can be applied, dosage, administration method and the like are the same as described above.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising lactate metal salt as an active ingredient.
  • the lactate metal salt provided by the present invention can inhibit various properties that can induce cancer cell metastasis, such as cancer cell metastasis, invasion, neovascularization, tube formation, cell mobility, and colonization ability, thereby inhibiting cancer metastasis. It can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • the target cancer of the metastasis is the same as defined above, for example, the pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis is metastatic lung cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, brain cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, It can be used to inhibit the development of one or more metastatic cancers selected from the group consisting of uterine cancer, cervical cancer, kidney cancer and melanoma.
  • treatment of calcium lactate which is a type of lactate metal salt provided by the present invention
  • HIF-1 ⁇ hypooxia inducible
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FIG. 17 tube forming level of HUVEC
  • Increase the apoptosis rate of breast cancer cell line FIG. 21) and colon cancer cell line (FIG. 22); It was confirmed that colon cancer cell line (Fig. 23) and melanoma cell line (Fig. 24) inhibits the colonization ability.
  • the present invention provides a method of inhibiting metastasis of cancer, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in anticipated metastasis of cancer.
  • cancer refers to a condition in which cancer or a malignant tumor has spread to other tissues away from the organ.
  • the lactate metal salt provided by the present invention When the lactate metal salt provided by the present invention is administered, the metastasis can be suppressed.
  • the kind of cancer to be metastasis suppressed, the type of drug to be administered, the route of drug administration and the like are the same as described above.
  • the present invention provides a food composition for cancer improvement comprising lactate metal salt as an active ingredient.
  • the lactate metal salt Since the lactate metal salt has been generally used for metabolism in vivo, and calcium lactate has been recognized as having no side effects, and has been used as an official food additive, the lactate metal salt can improve cancer even though it is common sense. It can be prepared and consumed in the form of food.
  • the content of the lactate metal salt included in the food is not particularly limited, but may be included as an example of 0.001 to 10% by weight, and other examples 0.1 to 1% by weight based on the total weight of the food composition.
  • the food When the food is a beverage, it may be included in a ratio of 1 to 10g, and 2 to 7g as another example based on 100ml.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • additional ingredients may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu). It may also contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • preservatives potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.
  • fungicides bleaching powder and highly bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.
  • antioxidants butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluene ( BHT), etc.
  • colorants such as tar pigments
  • colorants such as sodium nitrite, sodium nitrite
  • bleach sodium sulfite
  • seasonings such as MSG glutamate
  • sweeteners ducin, cyclate, saccharin, sodium, etc.
  • Food additives such as flavors (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium D-tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (pigments), coatings, gum herbicides, foam inhibitors, solvents, improvers, etc.
  • the additive is selected according to the type of food and used in an appropriate amount
  • the lactate metal salt may be prepared for cancer improvement functional food using the food composition for cancer improvement.
  • the food composition can be used to produce processed foods that can improve cancer, for example, confectionery, beverages, alcoholic beverages, fermented foods, canned food, milk processed foods, meat processed foods or noodles processed foods. It can be prepared as a dietary supplement.
  • the confectionery includes biscuits, pies, cakes, breads, candy, jelly, gum, cereals (including meal substitutes such as grain flour).
  • Beverages include drinking water, carbonated drinks, functional hot drinks, juices (eg, apples, pears, grapes, aloes, citrus fruits, peaches, carrots, tomato juices, and the like), sikhye, and the like.
  • Alcoholic beverages include sake, whiskey, shochu, beer, liquor, fruit wine, and the like.
  • Fermented foods include soy sauce, miso, and red pepper paste.
  • Canned food includes canned seafood (eg, canned tuna, mackerel, saury, canned seashells, etc.), canned livestock (eg beef, pork, chicken, turkey canned, etc.), canned produce (corn, peaches, canned apples, etc.).
  • Milk processed foods include cheese, butter, yogurt, and the like.
  • Processed meat products include pork cutlet, beef cutlet, chicken cutlet and sausage. Includes sweet and sour pork, nuggets, breadfruits and more.
  • Noodle-processed foods include dried noodles, noodles, ramen noodles, udon noodles, cold noodles, sealed raw noodles, and the like.
  • the composition may be used in retort food, soups and the like.
  • the term "functional food” of the present invention is the same term as a food for special health use (FOSHU), the medicine, medical effect processed to appear efficiently in addition to nutritional control function It means a high food, the food can be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquid, pill to obtain a useful effect in improving cancer.
  • FOSHU special health use
  • lactate metal salt calcium carbonate, sodium carbonate or potassium carbonate and lactate
  • lactate metal salt solutions each of which is filtered, dried and pulverized to give a powdered lac Tate metal salts (calcium lactate, sodium lactate or potassium lactate) were obtained.
  • lactate metal salt calcium lactate, sodium lactate or potassium lactate
  • FIG. 1 the structure and binding energy of each lactate metal salt (calcium lactate, sodium lactate or potassium lactate) obtained above were analyzed (FIG. 1).
  • FIG. 1 is a schematic diagram and a diagram comparing the structure and binding energy of sodium lactate and potassium lactate having a structure similar to the molecular structure of calcium lactate. As shown in Figure 1, calcium lactate was confirmed to exhibit a relatively high level of binding energy compared to sodium lactate and potassium lactate.
  • Figure 2 is a fluorescence picture showing the result of comparing the level of calcium in the cancer cells, depending on the treatment of calcium lactate (CaLa). As shown in Figure 2, it was confirmed that the concentration of calcium increases in cancer cells treated with calcium lactate.
  • Example 2-1 The cells cultured in Example 2-1 were further cultured in a medium containing 3 mM (low) or 11 mM (normal) glucose, and the cells were cultured and crushed by sonication, and the lactate contained in the lysate. The concentration of was measured using a lactate analysis kit (AbCam, Cambridge, MA) (Fig. 3). In this case, cancer cells not treated with calcium lactate were used as a control.
  • Figure 3 is a graph showing the results of comparing the levels of lactate in cancer cells, depending on the treatment of calcium lactate (CaLa). As shown in Figure 3, irrespective of the concentration of glucose in the medium, the concentration of lactate in the cancer cells treated with calcium lactate increased, which is more clearly seen when cultured in a medium containing a high concentration of glucose. Confirmed.
  • the extracellular pH is measured by using a pH measuring device for the medium of the cultured cells treated with calcium lactate
  • the intracellular pH is calcium Cells cultured by treatment with lactate were measured using pH detection kits (life technologies, CA) (FIG. 4). In this case, cancer cells not treated with calcium lactate were used as a control.
  • Figure 4 is a graph showing the change in pH in the internal and external environment of the cancer cells treated with calcium lactate, the left side shows the pH change of the extracellular environment, the right side shows the pH change of the intracellular environment.
  • FIG. 4 when calcium lactate was treated, the pH of the extracellular medium did not change, but the intracellular pH was lowered to show acidity.
  • the calcium lactate itself did not change the pH outside the cancer cells, but when the calcium lactate flowed into the cancer cells, the pH was lowered. Due to the change in the cancer cell environment was found to be acidic.
  • Example 2 From the results of Example 2, it was confirmed that the calcium lactate can change the internal environment of the cancer cells, in order to determine whether the growth of cancer cells due to this change, calcium rock in the colorectal cancer or breast cancer cell line Changes in the expression level of ⁇ -catenin, one of the cancer growth factors following treatment of tate, were confirmed in gene and protein expression levels.
  • Example 3-1 ⁇ - in Colorectal Cancer Cell Lines catenin Affecting expression levels Calcium lactate effect
  • Human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29 and DLD-1) were cultured in the same manner as in Example 2-1, except that 0, 1.5 or 2.5 mM calcium lactate was treated. Each cultured cancer cell was obtained, and then the expression levels of ⁇ -catenin according to the concentration of calcium lactate were compared at the mRNA expression level or protein expression level contained therein.
  • each of the cancer cells were extracted with total RNA using the RNeasy® mini kit, and then cDNA was synthesized using reverse transcriptase. Using the synthesized cDNA as a template, PCR was performed using the following primers to obtain ⁇ -catenin gene, and the levels thereof were compared by electrophoresis (top of FIG. 5). At this time, actin was used as the internal control group.
  • ⁇ -catenin F 5'-AAAATGGCAGTGCGTTTAG-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • ⁇ -catenin R 5'-TTTGAAGGCAGTCTGTCGTA-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • ACTIN F 5'-AAC-TGGAACGGTGAAGGT-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • ACTIN R 5'-CCTGTAACAACGCATCTCAT-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of comparing the mRNA expression levels of ⁇ -catenin in human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29 and DLD-1) treated with various concentrations of calcium lactate. As seen from the top of Figure 5, the mRNA expression level of ⁇ -catenin did not show a difference depending on the treatment concentration of calcium lactate.
  • each of the cancer cells was crushed, electrophoresed, and then anti- ⁇ -catenin antibody was used as the primary antibody, and anti-rabbit IgG conjugate was used as the secondary antibody.
  • Western blot analysis was performed using the Image-J program as the analysis program (bottom of FIG. 5). At this time, actin was used as the internal control group.
  • FIG. 5 is a Western blot analysis showing the results of comparing the protein expression levels of ⁇ -catenin in human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29 and DLD-1) treated with various concentrations of calcium lactate. .
  • HCT-116, HT-29 and DLD-1 human colon cancer cell lines
  • DLD-1 calcium lactate
  • calcium lactate introduced into the cancer cells changes the internal environment of the cancer cells, thereby inhibiting the expression of the ⁇ -catenin, a cancer growth factor, at the level of gene translation.
  • Example 3-2 ⁇ - in Breast Cancer Cell Lines catenin Affecting expression levels Calcium lactate effect
  • Example 3-7 Human breast cancer cell lines (MCF-7) and other cancer cell culture media (10% FBS) cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions in cancer cell culture media (RPM1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin) And DMEM medium containing 1% penicillin / streptomycin)
  • RPM1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin
  • DMEM medium containing 1% penicillin / streptomycin
  • the method was performed to compare the expression levels of ⁇ -catenin and activated ⁇ -catenin according to the concentration of calcium lactate at the protein expression level (FIG. 6).
  • FIG. 6 is a Western blot analysis showing the results of comparing the protein expression level of total ⁇ -catenin and activated ⁇ -catenin in human breast cancer cell lines treated with various concentrations of calcium lactate (MCF-7 and MDA-MB-231). It is a photograph. As shown in Figure 6, both ⁇ -catenin and activated ⁇ -catenin was confirmed that the protein expression level decreases as the concentration of calcium lactate increases.
  • Example 2 treated calcium lactate in the cancer cell line, it was confirmed that the concentration of lactate in the cancer cell line is increased, and therefore, whether the change in the glycolysis synthesis process occurs due to the increased lactate. Was to check whether or not.
  • human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) were cultured in normal oxygen conditions (normoxia) or hypoxia conditions (hypoxia), and treated with calcium lactate in the cell lines cultured in the hypoxic conditions, these Expression levels of GLUT 1 and HK2 expressed in each cultured cell line were compared at mRNA expression level and protein expression level (FIG. 7).
  • Figure 7 is a graph showing the effect of calcium lactate on the mRNA expression levels of GLUT 1 and HK2 acting early in glycolysis in the cell line cultured in hypoxic conditions and Western showing the effect of calcium lactate on protein expression levels Blot analysis picture. As shown in Figure 7, under hypoxic conditions, the expression level of GLUT 1 and HK2 acting at the beginning of the glycolysis is increased to activate the glycolysis, but this activated glycolysis was confirmed to be reduced by the treatment of calcium lactate.
  • PRP poly (ADP-ribose) polymerase
  • Example 5-1 in breast cancer cell lines Of PARP Affecting expression levels Calcium lactate effect
  • Human breast cancer cell lines (MCF-7 and MDA-MB-231) were cultured in the same manner as in Example 2-1, except that 0, 2.5 or 5.0 mM calcium lactate was treated, After obtaining the cancer cells, the change in the expression level according to the treatment concentration of calcium lactate in the protein expression level of PARP contained therein was analyzed (FIG. 8). At this time, the change of the expression level was analyzed by Western blot analysis using an anti-PARP antibody as a primary antibody, anti-rabbit IgG conjugate as a secondary antibody, Image-J program as an analysis program, GAPDH was used as the internal control.
  • FIG. 8 is a Western blot analysis picture showing the effect of calcium lactate on the protein expression levels of PARP and truncated PARP expressed in human breast cancer cell lines (MCF-7 and MDA-MB-231).
  • MCF-7 and MDA-MB-231 the protein expression level of PARP in each breast cancer cell line
  • MCF-7 and MDA-MB-231 decreases, in particular, the cleaved PARP in MCF-7 cell line. It was confirmed that the protein expression level of increased.
  • This does not affect calcium lactate to a level that simply stops glycolysis in cancer cell lines, and can be used as an anticancer agent because it can play a role in inducing apoptosis in cancer cells by stopping the glycolysis process. And it was found.
  • Example 5-2 In colorectal cancer cell lines Of PARP Affecting expression levels Calcium lactate effect
  • HCT-116 human colon cancer cell line
  • IS 5-indane sulfornamide
  • CA cinnamic acid
  • FIG. 9 shows PARP in colon cancer cell lines treated with calcium lactate, 5-indane sulfornamide (IS), an inhibitor of carbonic anhydrase, or cinnamic acid (CA), an inhibitor of MCT-4, a route of lactate.
  • Western blot analysis picture and graph showing the result of comparing the protein expression level of the.
  • FIG 9 when treated with the material alone, only when the calcium lactate treatment, PARP protein expression level was reduced, but when combined with them, even when not treated with calcium lactate, PARP protein expression The level was reduced, and when combined with calcium lactate, the PARP protein was shown to be lower, and when the combination of the three substances was confirmed, no PARP protein was detected in the cells.
  • Example 5-3 in melanoma cell lines Of PARP Affecting expression levels Calcium lactate effect
  • Figure 10 is a Western blot analysis picture showing the results of comparing the expression levels of PARP protein expressed in human melanoma cell lines (SKMEL-02 and SKMEL-28) treated with various concentrations of calcium lactate. As shown in Figure 10, melanoma cell line also confirmed that as the treatment concentration of calcium lactate increased, the protein expression level of PARP decreased.
  • Example 6-1 LDH -B (lactate dehydrogenase Effect of Calcium Lactate on Protein Expression Levels in B)
  • LDH-B lactate dehydrogenase B
  • human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) were treated with 2.5 mM calcium lactate and incubated for 24 hours.
  • the cultured cancer cell lines were treated with 4% paraformaldehyde and fixed, and anti-rabbit LDHB antibodies were treated for 15 hours.
  • the cells were washed with PBS, treated with a biotin-bound secondary antibody, and then reacted at room temperature for 2 hours.
  • treated with streptavidin conjugated with FITC, fluorescein was performed, and then photographed by fluorescence microscopy (FIGS. 11A to 11C).
  • a cancer cell line (N-control) under normal oxygen supply condition or a cancer cell line (H-control) under oxygen deficiency condition was used as a control group.
  • the nuclei of each cell were stained using DAPI, and the photographed image was Xenogen. Analysis was performed using In Vivo Imaging System 100 series and Living imaging software (Xenogen).
  • Figure 11a is a fluorescence micrograph showing the change in the level of protein expression of LDH-B in cancer cell line following the treatment with calcium lactate
  • Figure 11b is a fluorescence microscope showing the fluorescence absorbance of the cancer cell line itself according to the treatment with calcium lactate
  • 11c is a graph quantitatively analyzing the color development level of fluorescence according to the protein expression level of LDH-B. As shown in Figures 11a to 11c, it was confirmed that the protein expression level of LDH-B is rapidly increased in the cells treated with calcium lactate.
  • Example 6-2 Effect on the level of pyruvic acid Calcium lactate effect
  • Example 6-1 From the results of Example 6-1, it was confirmed that the protein expression level of LDH-B in cancer cells was increased by the treatment of calcium lactate, and thus the effect on the intracellular expression level of pyruvate produced by the LDH-B. To determine the effect of calcium lactate.
  • the human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) of 5 x 10 5 cell number were treated with 2.5 mM calcium lactate for 24 hours, and the cells were crushed by ultrasonication and filtered by a 10 kDa filter. To give a filtrate.
  • the obtained filtrate was applied to a pyruvic acid analysis kit (Abcam, Cambridge, MA) to measure the concentration of pyruvic acid contained in the filtrate (FIG. 12).
  • FIG. 12 is a graph showing changes in the concentration of pyruvic acid in cancer cell lines following treatment with calcium lactate. As shown in Figure 12, it was confirmed that the level of pyruvic acid increased rapidly in the cells treated with calcium lactate.
  • Example 6-3 PDH ( pyruvate dehydrogenase Of protein expression levels Calcium lactate effect
  • Example 6-2 From the results of Example 6-2, it was confirmed that the level of pyruvate in cancer cells was increased by the treatment of calcium lactate, and thus the effect of pyruvate dehydrogenase (PDH) on the protein expression level of the enzyme that transfers the pyruvate to the TCA cycle To determine the effect of calcium lactate.
  • PDH pyruvate dehydrogenase
  • Example 6-1 the human colon cancer cell line treated with calcium lactate (HCT-116 and HT) was subjected to the method of Example 6-1, except that anti-rabbit PDH antibody was used instead of the anti-rabbit LDHB antibody. PDH protein expression levels were measured (-29) (FIGS. 13A and 13B).
  • Figure 13a is a fluorescence micrograph showing the change in the protein expression level of PDH in cancer cell line following the treatment of calcium lactate
  • Figure 13b is a quantitative analysis of the change in the protein expression level of PDH in cancer cell line following the treatment of calcium lactate One graph. As shown in Figure 13a and 13b, it was confirmed that the protein expression level of PDH sharply increased in the cells treated with calcium lactate.
  • Example 6-4 ⁇ -KG ( ⁇ - ketoglutarate On the level of Calcium lactate effect
  • Example 6-3 From the results of Example 6-3, it was confirmed that the expression level of PDH protein in cancer cells was increased by the treatment of calcium lactate, and thus ⁇ -KG ( ⁇ -ketoglutarate) generated in the TCA circuit activated by the PDH protein.
  • ⁇ -KG ⁇ -ketoglutarate
  • Figure 14a is a graph showing the change in the concentration of ⁇ -KG in each cell as treated with calcium lactate in cancer cell cultured in normal medium
  • Figure 14b is a graph showing the change in the concentration of ⁇ -KG in each cell treated with calcium lactate in a cancer cell line cultured in a glutamine-free medium.
  • the treatment of calcium lactate in all of the cancer cell lines cultured in normal medium or glutamine-deficient medium it was confirmed that the level of ⁇ -KG in these cells increased dramatically.
  • Example 7 Cancer cell On the expression levels of metastasis, invasion and angiogenesis factors Calcium lactate effect
  • Example 6 As a result of Example 6, it can be seen that the level of ⁇ -KG is increased in the cancer cells treated with calcium lactate, so that metastasis, infiltration, and angiogenesis of cancer cells in which the expression level of the protein is controlled by the ⁇ -KG.
  • the purpose of this study was to determine the effect of calcium lactate on the expression level of factors on angiogenesis.
  • Example 7-1 HIF - 1 ⁇ ( hypoxia inducible factor 1 ⁇ Of protein expression levels Calcium lactate effect
  • HIF-1 ⁇ hypoxia inducible factor 1 ⁇
  • HIF-1 ⁇ hypoxia inducible factor 1 ⁇
  • human colon cancer cell lines HCT-116 and HT-29 were incubated for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate under normal oxygen supply conditions (normoxia) or oxygen deficiency conditions (hypoxia).
  • normal oxygen supply conditions nodecoxia
  • hypooxia oxygen deficiency conditions
  • Western blot analysis using an anti-HIF-1 ⁇ antibody was performed (top of FIG. 15).
  • HIF-1 ⁇ human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) cultured for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate under normal oxygen supply (normoxia) or oxygen deficiency (hypoxia).
  • Western blot analysis showing the expression level of HIF-1 ⁇ protein expressed in As seen from the top of Figure 15, HIF-1 ⁇ is expressed in the oxygen deficient condition (hypoxia), it was confirmed that even in this oxygen deficient condition is not expressed when calcium lactate is treated.
  • HIF in the nucleus of cancer cells.
  • the change in the expression level of ⁇ 1 ⁇ was measured (bottom of FIG. 15).
  • HIF-1 ⁇ protein expressed in human colon cancer cell lines HCT-116 and HT-29
  • HCT-116 and HT-29 treated with 0.5, 1.5 and 2.5 mM calcium lactate in hypoxia and cultured for 24 hours.
  • Western blot analysis showing the expression level.
  • the calcium lactate was confirmed to inhibit the expression level of HIF-1 ⁇ in a concentration-dependent manner.
  • Example 7-2 VEGF on the expression level of vascular endothelial growth factor Calcium lactate effect
  • Example 7-1 it was confirmed that calcium lactate inhibits the expression level of HIF-1 ⁇ in a concentration-dependent manner.
  • VEGF vascular endothelial growth factor known as cancer cell invasion factor whose expression is controlled by HIF-1 ⁇ . To determine the effect of calcium lactate on the level of expression.
  • VEGF mRNA expression levels and protein expression levels were analyzed in each cancer cell line after the culture was terminated (FIGS. 16A and 16B).
  • human colon cancer cell line cultured without calcium lactate treatment under normal oxygen supply condition (normoxia) or oxygen deficiency condition (hypoxia) was used.
  • FIG. 16A shows human colon cancer cell lines (HCT-116 and HT-29) cultured for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate under normal oxygenation (normoxia) or hypoxia (hypoxia). It is a graph showing the result of measuring the mRNA expression level of the expressed VEGF
  • Figure 16b is a human colorectal cancer cell line cultured for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate in normal oxygen supply conditions or oxygen deficiency conditions
  • the oxygen deficiency condition hypooxia
  • the level of VEGF sharply increased, when treated with calcium lactate, it was confirmed that the increased level of VEGF is reduced.
  • Example 7-3 Human vascular endothelial cells ( HUVEC Of cancer cell-derived factors that cause tube formation Calcium lactate effect
  • cancer cell lines cultured in RPMI-1640 medium to which 1% FBS was added were incubated for 24 hours with 0.5, 1, 1.5, and 2.5 mM calcium lactate, and each culture supernatant was obtained therefrom. .
  • Each culture supernatant obtained above was inoculated and cultured with human vascular endothelial cells (HUVEC), and the morphological changes of the cells were analyzed (FIG. 17).
  • the control group was HUVEC cultured using a culture of cancer cell line cultured without calcium lactate, and the control group was HUVEC cultured by treatment with Sulforaphane, a growth inhibitor of HUVEC.
  • FIG. 17 is a tube forming level of the HUVEC according to the treatment concentration of calcium lactate in human vascular endothelial cells (HUVEC) cultured using a culture supernatant of cancer cell lines cultured by treating various concentrations of calcium lactate. It is a fluorescence photograph showing the result of comparing.
  • HUVECs cultured using the culture supernatant of a cancer cell line treated with calcium lactate were reduced in tube formation ability as the concentration of calcium lactate increased, compared to the control group showing excellent tube formation ability.
  • HUVECs cultured in culture supernatants of cancer cell lines treated with mM calcium lactate were found to have reduced tube-forming ability to a level comparable to that of the comparison group treated with sulforaphane. Since the angiogenesis is induced by a factor secreted from cancer cells, the HUVEC has a concentration-dependent effect of inhibiting the action of a factor inducing angiogenesis.
  • Example 8 Effects on metastasis and invasion of cancer cell lines Calcium lactate effect
  • Example 8-1 Effect on Metastasis and Invasion of Colorectal Cancer Cell Lines Calcium lactate effect
  • Figure 18 is a photograph showing the result of confirming whether the mobility of the colon cancer cell line metastasis according to the treatment of calcium lactate. As shown in FIG. 18, the colorectal cancer cell line treated with calcium lactate was reduced, but the colorectal cancer cell line of the control group not treated with calcium lactate was confirmed to be maintained.
  • Example 8-2 Effect on metastasis and infiltration of breast cancer cell lines Calcium lactate effect
  • Example 8-1 Except for using breast cancer cell lines (MCF-7 and MDA-MB231) instead of colon cancer cell lines, the same method as in Example 8-1 was carried out to confirm the effect of calcium lactate on the mobility of breast cancer cell lines (FIG. 19).
  • FIG. 19 is a photograph showing the results of confirming whether the mobility of the breast cancer cell line metastasis according to the treatment of calcium lactate. As shown in Figure 19, compared with the breast cancer cell line of the control group not treated with calcium lactate, it was confirmed that the breast cancer cell line treated with calcium lactate showed a relatively low level of cell line metastasis capacity.
  • Example 8-3 Effect on metastasis and infiltration of melanoma cell lines Calcium lactate effect
  • FIG. 20 is a photograph showing the results of confirming whether or not the mobility of the melanoma cell line metastasis according to the treatment of calcium lactate. As shown in FIG. 20, it was confirmed that the melanoma cell line treated with calcium lactate showed a relatively low level of cell line metastasis capacity, compared to the melanoma cell line of the control group not treated with calcium lactate.
  • Example 9-1 Effect on the viability of breast cancer cell lines Calcium lactate effect
  • MCF-7 and MDA-MB231 were incubated for 24 hours with or without 2.5 mM calcium lactate.
  • Each breast cancer cell line before the culture and each breast cancer cell line in which the culture was terminated were treated with 5 ⁇ l of FITC Annexin V and 5 ⁇ l of PI and reacted at room temperature for 15 minutes, followed by FACS Calibur (BD Bioscience, USA).
  • FACS Calibur BD Bioscience, USA.
  • Flow cytometry was performed to evaluate their staining levels, thereby measuring the killing rate of cancer cells (FIGS. 21A-21F).
  • Figure 21a is a photograph showing the result of confirming whether the mobility of the calcium lactate in the breast cancer cell line (MCF-7),
  • Figure 21b is a cell when the calcium lactate is not treated in the breast cancer cell line (MCF-7)
  • Flow cytometry graph showing the survival rate
  • Figure 21c is a flow cytometry graph showing the cell survival rate when treated with calcium lactate in breast cancer cell line (MCF-7)
  • Figure 21d is calcium in the breast cancer cell line (MDA-MB231)
  • FIG. 21E is a flow cytometry graph showing cell viability when calcium lactate was not treated in breast cancer cell line (MDA-MB231)
  • FIG. 21F Flow cytometry graph showing cell survival rate when calcium lactate was treated in breast cancer cell line (MDA-MB231).
  • MCF-7 cell line exhibited a 9.63% apoptosis rate before calcium lactate treatment, but after the calcium lactate treatment 33.8% cell death rate
  • Figure 21d As shown in 21f, the MDA-MB231 cell line exhibited apoptosis rate of 10.17% before treatment with calcium lactate, but 13.05% after treatment with calcium lactate.
  • Example 9-2 Colorectal Cancer Stem cell Affecting morphological changes Calcium lactate effect
  • Human colon cancer stem cell lines were inoculated into stem cell culture medium (media containing 1% penicillin / streptomycin and 50-fold B27, mixed with DMEM medium and F12 medium in a 1: 1 ratio), and 37 ° C. and 5% CO Incubated under 2 conditions.
  • the cultured colorectal cancer stem cell line was treated with calcium lactate and it was confirmed whether the shape of the spheres formed by the stem cells was changed (FIG. 22). At this time, the control group was treated with DMSO without calcium lactate.
  • Figure 22 is a micrograph showing the change in the shape of the globular spheroids in the treatment of calcium lactate in colon cancer stem cell lines. As shown in FIG. 22, the glomerular was maintained in the control group not treated with calcium lactate, but when calcium lactate was treated, it was confirmed that the morphology of the globular body was destroyed to decrease the viability of colon cancer stem cells.
  • human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29 and DLD-1) were inoculated into solid medium containing calcium lactate at various concentrations (0, 0.5, 1.5 or 2.5 mM), and cultured for 10 days. After the incubation was completed, the cells were fixed, and then stained with hematoxylin to count the number of colony-formed cancer cells (FIG. 23).
  • Figure 23 is a photograph and graph (left: HCT-116, center: HT-29, right: DLD-1) showing the results of comparing the colonization ability of colorectal cancer cell lines according to the treatment concentration of calcium lactate. As shown in FIG. 23, all colon cancer cell lines not treated with calcium lactate formed 260 to 360 colonies, but the number of colonies decreased as the concentration of calcium lactate increased, resulting in 2.5 mM calcium lactate. In the case of treatment, it was confirmed that 100 to 120 colonies were formed.
  • Figure 24a is a graph and chart showing the results of comparing the colony forming ability of the human melanoma cell line (SKMEL-02) according to the treatment concentration of calcium lactate
  • Figure 24b is a human melanoma cell line according to the treatment concentration of calcium lactate (Graphs and charts showing the results of comparing the clustering ability of SKMEL-28).
  • human melanoma cell lines not treated with calcium lactate formed 105 to 168 colonies, but as the concentration of calcium lactate increased, the number of colonies decreased, and 5 mM calcium lactate.
  • calcium lactate has an effect of inhibiting the colonizing ability of colorectal cancer and melanoma cell lines.
  • Example 9-4 Impact on the viability of cancer cell lines Calcium lactate and Combination treatment of substances showing anticancer activity
  • a solid medium containing 5 mM calcium lactate or a substance known to exhibit anticancer activity (1 mM 5-indane sulfonamide (IS) or 5 mM CA (cinnamic acid)) individually or in combination, respectively.
  • the solid medium was inoculated with HCT-116, a human colorectal cancer cell line, and cultured for 10 days, and then cell viability was compared (FIGS. 25A and 25B).
  • 25a compares the survival rate of colorectal cancer cell lines individually treated with calcium lactate and 5-indane sulfornamide (IS) inhibitors of carbonic anhydrase or cinnamic acid (CA) inhibitors of MCT-4, the route of lactate migration.
  • 25B shows colorectal cancer treated with a combination of calcium lactate and 5-indane sulfornamide (IS), an inhibitor of carbonic anhydrase, or cinnamic acid (CA), an inhibitor of MCT-4, a route of lactate. It is a graph which shows the result of comparing the survival rate of a cell line. As shown in FIGS.
  • colorectal cancer cell lines individually treated with calcium lactate or a substance known to exhibit anticancer activity decreased their survival to about 60%, and the calcium lactate and anticancer activity
  • Example 9-5 Cell adhesion Reduced On the viability of cancer cell lines Calcium lactate effect
  • Figure 26 is a graph showing the results of comparing the effect of calcium lactate on the survival rate of colorectal cancer cell line cultured in a culture vessel showing low adhesion capacity. As shown in FIG. 26, even when cultured in a culture container showing low adhesion, if calcium lactate was not treated, the cell death rate was very low (about 5%). It was confirmed that the mortality rate increased sharply (about 90%).
  • colon cancer cells (HT-29) diluted in PBS were transplanted subcutaneously under the flanks of Balb / c mice, and grown until colon cancer cells grew to about 5 mm in the mice.
  • Experimental group 1 peroral, P.O
  • Experimental groups 2 intra tumor, I.T
  • Experimental groups 3 subcutaneous, S.C subcutaneously injected with 25 mM calcium lactate were respectively set (FIG. 27).
  • Figure 27 is a schematic diagram showing the experimental schedule of calcium lactate using an animal model.
  • Each colon cancer tissue was extracted from the mice of the control group, experimental group 1 or experimental group set in Example 10-1, and the expression levels of PARP and truncated PARP, which contribute to stabilization of the cancer gene expressed therefrom, were compared ( Figure 28).
  • Figure 28 is a photograph showing the change in the expression level of PARP according to the treatment of calcium lactate in the protein extracted from the tumor tissue of the animal model and the treatment method. As shown in FIG. 28, it was confirmed that the decomposition activity of PARP was increased in the experimental group treated with calcium lactate in a different method compared to the control group not treated with calcium lactate.
  • Example 10-3 HIF - 1 ⁇ and VEGF in Animal Models Orally Administered with Calcium Lactate Change in expression levels
  • Colon cancer tissues were extracted from the mice of the control group or the experimental group 1 set in Example 10-1, and the expression levels of HIF-1 ⁇ and VEGF involved in metastasis, invasion and neovascularization of tumors expressed therefrom were compared. (FIG. 29). At this time, GAPDH was used as the internal control group.
  • Figure 29 is a photograph showing the change in the expression level of HIF-1 ⁇ or GAPDH according to the treatment of calcium lactate in the protein extracted from the tumor tissue of the animal model orally administered calcium lactate. As shown in FIG. 29, it was confirmed that in the experimental group 1 treated with calcium lactate, the expression of HIF-1 ⁇ and VEGF was suppressed compared to the control group not treated with calcium lactate.
  • Example 10-4 Calcium lactate Changes in tumor size in oral animal models
  • the volume of colorectal cancer tissues was measured and compared with time from mice of the control group or the experimental group 1 set in Example 10-1 (FIG. 30).
  • Figure 30 is a graph showing the change in tumor volume according to the treatment of calcium lactate in the animal model orally administered 2.5Mm calcium lactate. As shown in Figure 30, the control group without calcium lactate finally showed a tumor volume of about 1200 mm3 x 10 3 , the experimental group 1 treated with calcium lactate finally 480 mm3 x 10 3 tumor volume It was confirmed that it represents.
  • calcium lactate was found to have an effect of inhibiting the growth of tumors.
  • Example 10-5 Calcium lactate In the injected animal model HIF - 1 ⁇ And Of VEGF Change in expression levels
  • Each colon cancer tissue was extracted from the mice of the control group or the experimental group 2 set in Example 10-1, and the expression levels of HIF-1 ⁇ and VEGF involved in metastasis, invasion, and neovascularization of the tumors expressed therefrom were compared. (FIG. 31). At this time, GAPDH was used as the internal control group.
  • Figure 31 is a Western blot photograph showing the change in the expression level of HIF-1 ⁇ or GAPDH according to the treatment of calcium lactate in the protein extracted from the tumor tissue of the animal model injected with calcium lactate around the cancer tissue. As shown in FIG. 31, it was confirmed that in the experimental group 2 treated with calcium lactate, the expression of HIF-1 ⁇ and VEGF was suppressed compared to the control group not treated with calcium lactate.
  • Example 10-6 Calcium lactate Tumor size changes in injected animal models
  • the volume of colorectal cancer tissues was measured and compared with time from mice of the control group or the experimental group 2 set in Example 10-1 (FIG. 32).
  • FIG. 32 is a graph showing changes in tumor volume depending on whether calcium lactate was treated in an animal model in which 2.5 mM calcium lactate was injected directly into cancer tissues. As shown in FIG. 32, the control group without calcium lactate finally showed a tumor volume of about 1200 mm x 10 3 , but the experimental group 2 treated with calcium lactate finally showed a tumor volume of about 490 mm x 10 3. It was confirmed that it represents.
  • calcium lactate was found to have an effect of inhibiting the growth of tumors.
  • Example 10-7 In animal models Calcium lactate Changes in tumor morphology following treatment
  • Figure 33 is a photograph showing the change in tumor morphology following treatment of 2.5mM calcium lactate in the animal model. As shown in FIG. 33, tumors photographed in the control group not treated with 2.5 mM calcium lactate had a much larger size and increased blood vessel formation on the tumor surface, and tumors photographed in the experimental group had very reduced size and blood vessels. It was confirmed that the formation was also reduced.
  • Example 10-8 Calcium lactate Tumor size changes in subcutaneous injected animal models
  • the volume of colorectal cancer tissues was measured over time from the mice of the control group or the experimental group 3 set in Example 10-1, and compared with them (FIG. 34).
  • FIG. 34 is a graph showing the change in tumor volume according to whether calcium lactate was treated in an animal model in which 25 mM calcium lactate was directly injected subcutaneously around the nape of the neck. As shown in Figure 34, the control group was not treated with calcium lactate finally showed a tumor volume of about 2,300mm3, Experimental group 3 treated with calcium lactate confirmed that the tumor volume finally shows about 80mm3.
  • Example 10-9 In animal models Calcium lactate Changes in tumor morphology following treatment
  • Figure 35 is a photograph showing the change in tumor morphology according to the treatment of 25mM calcium lactate in the animal model. As shown in FIG. 35, tumors photographed in the control group not treated with 25 mM calcium lactate were much larger in size and increased blood vessel formation on the tumor surface, and tumors photographed in Experimental Group 3 were significantly reduced in size. Angiogenesis was also confirmed to be reduced.
  • Example 11 irradiation and Calcium lactate Colorectal Cancer Treatment through Combination Administration
  • Colon cancer cells (HT-29 or HCT-116) were implanted in the flank subcutaneous of the mouse, and raised until colon cancer cells grew to a size of about 5 mm in each mouse, and then treated with calcium lactate for 30 days.
  • Control Experimental group 11 (intra tumor, IT) injected with 2.5 mM calcium lactate, X-RAD 320 X-ray irradiator (300 kVp) equipped with 2.0 mm aluminum filter, irradiated with 2Gy of radiation five times, group 12 ( IR) or 2Gy of irradiation 5 times and at the same time experimental group 13 (CaLa + IR) injected with 2.5 mM calcium lactate was set (Fig. 36).
  • 36 is a schematic diagram showing an experimental schedule of irradiation and calcium lactate using an animal model.
  • Example 11-2 Irradiation and Calcium lactate Changes in tumor size in a combination animal model
  • the volume of colorectal cancer tissue was measured and compared with time from mice of the control group or each experimental group set in Example 11-1 (Figs. 37A and 37B).
  • FIG. 37A is a graph showing changes in tumor volume over time when radiation and calcium lactate were individually or in combination in a cancer-causing animal model prepared by transplanting a HT-29 colon cancer cell line into the flank
  • FIG. 37B is a graph showing changes in tumor volume over time when irradiation and calcium lactate were individually or in combination with a cancer-causing animal model prepared by transplanting an HCT-116 colorectal cancer cell line into the flank.
  • calcium lactate may be treated alone, but the combination of irradiation and calcium lactate was found to show an improved anti-cancer treatment effect.
  • Example 12 known anticancer agents Calcium lactate Combined treatment
  • Example 9-4 it was confirmed that the viability of cancer cells was reduced by the combination treatment of calcium lactate and a substance showing anticancer activity, compared to the single treatment, based on the results of the known anticancer agent and calcium lactate. The therapeutic effect of the combination treatment on various cancer cell lines was verified.
  • Example 12-1 Imatinib and Calcium lactate Combined treatment
  • Human colon cancer cell lines (HT-29 and HCT-116) were dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced with new medium after 2.5 mM calcium lactate or 1, The colonization capacity of the cells was compared after 2.5 and 5 ⁇ M imatinib alone or in combination with various concentrations (1, 2.5 and 5 ⁇ M) of Imatinib and 2.5 mM calcium lactate.
  • human colorectal cancer cell lines (HT-29 and HCT-116) treated with no drugs were used (FIGS. 38A, 38B, 39A and 39B).
  • FIG. 38A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with a human colorectal cancer cell line (HT-29).
  • 38B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). Is; FIG.
  • 39A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with a human colon cancer cell line (HCT-116).
  • FIG. ; 39B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and imatinib at a concentration of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with a human colorectal cancer cell line (HCT-116). to be.
  • Example 12- 2 5 -FU (5- Fluorourasil )Wow Calcium lactate Combined treatment
  • Human colon cancer cell lines (HT-29 and HCT-116) were dispensed with 1 X 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced with new medium after 2.5 mM calcium lactate or 2.5, After 5 and 10 ⁇ M of 5-FU alone or in combination with various concentrations (2.5, 5 and 10 ⁇ M) of 5-FU and 2.5 mM calcium lactate, the cell population capacity was compared. As a control, human colorectal cancer cell lines (HT-29 and HCT-116) treated with no drugs were used (FIGS. 40A, 40B, 41A and 41B).
  • 40a is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and 5-FU at concentrations of 2.5, 5, and 10 ⁇ M alone or in combination with a human colorectal cancer cell line (HT-29). ego; 40b shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and 5-FU at a concentration of 2.5, 5, and 10 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29).
  • Figure 41a is a graph showing the results of comparing the reduction in the number of colonies by treating the human lactate cancer cell line (HCT-116) alone or in combination with 2.5 mM calcium lactate and 2.5, 5 and 10 ⁇ M concentration of 5-FU ego; 41B shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at 2.5 mM concentration and 5-FU at 2.5, 5, and 10 ⁇ M concentrations alone or in combination with human colon cancer cell line (HCT-116). It is a photograph.
  • Example 12-3 Paclitaxel and Calcium lactate Combined treatment
  • the human breast cancer cell line (MCF-7) and the human lung cancer cell line (A549) were dispensed with 1 X 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and after one day, fresh medium was replaced and 2.5mM calcium lactate or The colonization ability of the cells was compared after treatment with 0.63, 1.3 and 2.5 nM of paclitaxel alone or with various concentrations of (0.63, 1.3 and 2.5 nM) paclitaxel and 2.5 mM calcium lactate.
  • human breast cancer (MCF-7) and lung cancer cell lines (A549) treated with no drugs were used (FIGS. 42A, 42B, 43A and 43B).
  • FIG. 42A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of clusters by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3 and 2.5 nM, alone or in combination with human breast cancer cell lines (MCF-7);
  • FIG. 42B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual populations by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3, and 2.5 nM alone or in combination with human breast cancer cell lines (MCF-7). .
  • the group treated with calcium lactate alone and the group treated with low concentrations of paclitaxel (0.63, 1.3 and 2.5 nM) alone confirmed that the cancer cell colonization ability was inhibited compared to the control group.
  • paclitaxel and calcium lactate were used in combination, it was confirmed that the ability of colonization was more suppressed than the group treated with paclitaxel alone.
  • FIG. 43A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of clusters by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3, and 2.5 nM, alone or in combination with human lung cancer cell lines (A549);
  • FIG. 43B is a photograph showing the results of comparing the degree of inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and paclitaxel at a concentration of 0.63, 1.3, and 2.5 nM, alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • the group treated with calcium lactate alone and the group treated with low concentrations (0.63, 1.3 and 2.5 nM) of paclitaxel alone showed that the cancer cell colonization ability was suppressed compared to the control group.
  • paclitaxel and calcium lactate were used in combination, it was confirmed that the ability of colonization was more suppressed than the group treated with paclitaxel alone.
  • Example 12-4 Gefitinib and Calcium lactate Combined treatment
  • Human lung cancer cell line (A549) was dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced anew and then replaced with 2.5 mM calcium lactate or 1.3, 2.5 and 5 ⁇ M zefitinib. Was treated alone or in combination with various concentrations (1.3, 2.5 and 5 ⁇ M) of zephytinib and 2.5 mM calcium lactate, and then the cell colonization ability of the cells was compared. As a control, a human lung cancer cell line (A549) treated with no drug was used (FIGS. 44A and 44B).
  • FIG. 44A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of clusters by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and zephytinib at a concentration of 1.3, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human lung cancer cell line (A549);
  • FIG. 44B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and zephytinib at a concentration of 1.3, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human lung cancer cell line (A549). As shown in FIGS.
  • Hep3B Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line
  • 1 X 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium and fresh medium was replaced with 2.5 mM calcium lactate or 1, 2.5 and 5 ⁇ M sorafenib.
  • the cell colonization ability of the cells was compared.
  • human liver cancer cell line (Hep3B) which was not treated with any drug was used (FIGS. 45A and 45B).
  • FIG. 45A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sorafenib at concentrations of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human liver cancer cell lines (Hep3B); 45B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sorafenib at concentrations of 1, 2.5, and 5 ⁇ M alone or in combination with human liver cancer cell lines (Hep3B). As shown in FIGS.
  • Example 12-6 Irinotecan and Calcium lactate Combined treatment
  • Human colon cancer cell line (HT-29) was dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced anew and then replaced with 2.5 mM calcium lactate or 0.5, 1 and 2 ⁇ M. After irinotecan alone or in combination with various concentrations (0.5, 1 and 2 ⁇ M) of irinotecan and 2.5 mM calcium lactate, the cell colonization ability of the cells was compared. As a control, human colorectal cancer cell line (HT-29) not treated with any drug was used (FIGS. 46A and 46B).
  • 46A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and irinotecan at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29); 46b is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and irinotecan at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). .
  • the group treated with calcium lactate alone and the group treated with low concentrations (0.5, 1 and 2 ⁇ M) of irinotecan alone were found to inhibit cancer cell colonization ability as compared to the control group.
  • the combination treatment of irinotecan and calcium lactate it was confirmed that the ability to form colonies was more suppressed than the group treated with irinotecan alone.
  • Example 12-7 Erlotinib and Calcium lactate Combined treatment
  • Human lung cancer cell line (A549) was dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium and fresh medium was replaced after 2.5m calcium lactate or 0.5, 1 and 2 ⁇ M erlotinib. was treated alone or in combination with various concentrations (0.5, 1 and 2 ⁇ M) of erlotinib and 2.5mM calcium lactate, and then compared the cell colonization ability of the cells.
  • a human lung cancer cell line (A549) not treated with any drug was used (FIGS. 47A and 47B).
  • FIG. 47A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and erlotinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with a human lung cancer cell line (A549); 47B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lungtate at a concentration of 2.5 mM and erlotinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • Example 12-8 Sunnytinib and Calcium lactate Combined treatment
  • Human colon cancer cell line (HT-29) was dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced anew and then replaced with 2.5 mM calcium lactate or 0.5, 1 and 2 ⁇ M. After treatment with sunitinib alone or a combination of various concentrations (0.5, 1 and 2 ⁇ M) of sunitinib and 2.5mM calcium lactate, the cell population capacity was compared. As a control, human colorectal cancer cell line (HT-29) not treated with any drug was used (FIGS. 48A and 48B).
  • FIG. 48A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sunnyinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). ego; FIG. 48B shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and sunnyinib at concentrations of 0.5, 1, and 2 ⁇ M alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). It is a photograph. As shown in FIGS.
  • the grouping ability of cancer cells was suppressed in the group treated with calcium lactate alone and the group treated with low concentration (0.5, 1 and 2 ⁇ M) of sunnyinib alone compared to the control group.
  • the combination of suntinib and calcium lactate was treated, it was confirmed that the grouping ability was more suppressed than the group treated with sunitinib alone.
  • Example 12-9 Methotrexate and Calcium lactate Combined treatment
  • the human lung cancer cell line (A549) was dispensed with 1 X 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced anew and then replaced with 2.5 mM calcium lactate or 5, 10 and 20 nM methotrexate alone. After treatment with or in combination with various concentrations of (5, 10 and 20 nM) methotrexate and 2.5 mM calcium lactate were compared with the colonization capacity of the cells. As a control, a human lung cancer cell line (A549) not treated with any drug was used (FIGS. 49A and 49B).
  • FIG. 49A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and methotrexate at concentrations of 5, 10, and 20 nM alone or in combination with human lung cancer cell line (A549); 49B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual populations by treating calcium lungtate at a concentration of 2.5 mM and methotrexate at concentrations of 5, 10, and 20 nM alone or in combination with human lung cancer cell line (A549). 49A and 49B, the group treated with calcium lactate alone and the group treated with low concentrations (5, 10 and 20 nM) of methotrexate alone were found to inhibit the colonization ability of cancer cells compared to the control group. In the combination treatment with methotrexate and calcium lactate, it was confirmed that the ability of colonization was more suppressed than the group treated with methotrexate alone.
  • Example 12-10 Carboplatin and Calcium lactate Combined treatment
  • a human lung cancer cell line (A549) was dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced anew and then replaced with 2.5 mM calcium lactate or 2.5, 5 and 10 ⁇ M carboplatin.
  • a human lung cancer cell line (A549) not treated with any drug was used (FIGS. 50A and 50B).
  • Figure 50a is a graph showing the results of comparing the reduction in the number of colonies by treating the human lung cancer cell line (A549) alone or in combination with calcium lactate of 2.5mM concentration and carboplatin concentration of 2.5, 5 and 10 ⁇ M; 50B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lungtate at 2.5 mM concentration and carboplatin at 2.5, 5, and 10 ⁇ M concentrations alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • the colonization ability of cancer cells was suppressed compared to the control group.
  • the combination of carboplatin and calcium lactate was treated, it was confirmed that the ability of colonization was more suppressed than the group treated with carboplatin alone.
  • Example 12-11 Docetaxel and Calcium lactate Combined treatment
  • a human lung cancer cell line (A549) was dispensed with 1 X 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and after one day fresh medium was replaced with 2.5 mM calcium lactate or 0.6, 1.3 and 2.5 nM docetaxel. After treatment alone or in combination with various concentrations of (0.6, 1.3 and 2.5nM) docetaxel and 2.5mM calcium lactate, the cell colonization ability of the cells was compared. As a control, a human lung cancer cell line (A549) not treated with any drug was used (FIGS. 51A and 51B).
  • FIG. 51A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of clusters by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and docetaxel at a concentration of 0.6, 1.3, and 2.5 nM alone or in combination with human lung cancer cell line (A549);
  • 51B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and docetaxel at a concentration of 0.6, 1.3, and 2.5 nM, alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • FIGS. 51A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of clusters by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and docetaxel at a concentration of 0.6, 1.3, and 2.5 nM alone or in combination with human lung cancer cell line (A549).
  • Example 12-12 Lapatinib and Calcium lactate Combined treatment
  • the human breast cancer cell line (MCF-7) was dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium and fresh media changed after one day, followed by 2.5 mM calcium lactate or 2, 4 and 8 ⁇ M lapatinib. Was treated alone or in combination with various concentrations of (2, 4 and 8 ⁇ M) lapatinib and 2.5mM calcium lactate, and then the cell colonization ability was compared.
  • human breast cancer cell line (MCF-7) which was not treated with any drug was used (FIGS. 52A and 52B).
  • FIG. 52A is a graph showing the results of comparing the reduction in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and lapatinib at a concentration of 2, 4, and 8 ⁇ M alone or in combination with human breast cancer cell lines (MCF-7); 52B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual populations by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and lapatinib at a concentration of 2, 4, and 8 ⁇ M alone or in combination with human breast cancer cell lines (MCF-7).
  • the group treated with calcium lactate alone and the group treated with low concentrations (2, 4 and 8 ⁇ M) of lapatinib was confirmed that the cancer cell colonization ability is inhibited compared to the control group.
  • the ability of colonization was more inhibited than the group treated with lapatinib alone.
  • Example 12-13 Everolimus and Calcium lactate Combined treatment
  • FIG. 53A is a graph showing the result of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and everolimus at concentrations of 0.3, 0.5, and 1 nM, alone or in combination with human kidney cancer cell line (Caki-1).
  • ego shows the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM with everolimus at concentrations of 0.3, 0.5, and 1 nM, alone or in combination with human kidney cancer cell line (Caki-1). It is a photograph. As shown in FIGS.
  • Example 12-14 Trast State Map ( Trastuzumab , Herceptin )and Calcium lactate Combined treatment
  • a human breast cancer cell line (MCF-7) showing anti-cancer drug resistance to trastuzumab was dispensed with 1 X 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium (1% fetal bovine serum + 500 ng / ul epithelial growth factor). After this, the medium is replaced and treated with 2.5 mM calcium lactate or 0.23, 0.45 and 18 ⁇ g / ml trastuzumab alone or with various concentrations of (0.23, 0.45 and 18 ⁇ g / ml) trastuzumab and 2.5 mM calcium lactate. Tate was co-treated and the cell colonization ability was compared. As a control, human breast cancer cell line (MCF-7) which was not treated with any drug was used (FIGS. 54A and 54B).
  • FIG. 54A shows a decrease in the number of colonies by treatment of calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and trastuzumab at concentrations of 0.23, 0.45 and 1.8 ug / ml, alone or in combination with human breast cancer cell line (MCF-7) showing strong resistance to trastuzumab.
  • FIG. 54B shows the formation of individual colonies either alone or in combination with 2.5 mM calcium lactate and 0.23, 0.45 and 1.8 ug / ml trastuzumab in human breast cancer cell line (MCF-7) showing strong resistance to trastuzumab. It is a photograph showing the result of comparing a suppression degree. As shown in FIGS.
  • Example 12-15 Oxaliplatin and Calcium lactate Combined treatment
  • Human colon cancer cell line (HT-29) was dispensed with 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates each containing RPMI1640 medium, and the medium was replaced anew and then replaced with 2.5 mM calcium lactate or 1.3, 2.5 and 5 ⁇ M. Oxaliplatin alone or in combination with various concentrations (1.3, 2.5 and 5 ⁇ M) of oxaliplatin and 2.5 mM calcium lactate were used to compare the colonization capacity of the cells. As a control, human colorectal cancer cell line (HT-29) not treated with any drug was used (FIGS. 55A and 55B).
  • 55A is a graph showing the results of comparing the decrease in the number of colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and oxaliplatin at concentrations of 1.3, 2.5 and 5 ⁇ M, alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29); 55B is a photograph showing the results of comparing the inhibition of formation of individual colonies by treating calcium lactate at a concentration of 2.5 mM and oxaliplatin at a concentration of 1.3, 2.5, and 5 ⁇ M, alone or in combination with human colon cancer cell line (HT-29). .
  • lactate metal salts alone may show anticancer activity.
  • the combination of lactate metal salts and known anticancer agents may result in more improved anti-cancer therapeutic effects, as shown in the results of Trastuzumab. This, it was found that the sensitivity of cancer cells to known anticancer agents can be further improved.

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Abstract

본 발명은 암세포의 대사과정을 교란함으로써, 암세포의 증식, 침윤, 전이 등의 작용을 효과적으로 억제할 수 있는 락테이트를 암세포내에서 해리시킬 수 있는 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물, 암 전이억제용 약학 조성물 및 암 개선용 식품 조성물, 상기 락테이트 금속염을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법 및 암 전이 억제방법에 관한 것이다. 본 발명의 락테이트 금속염은 부작용이 없으면서도, 암의 주된 에너지 생산경로의 대사과정을 교란시켜서, 암세포의 성장을 억제하고, 사멸을 유도할 뿐만 아니라 방사선 조사에 대하여 내성을 유도하는 인자의 발현을 억제하므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물
본 발명은 락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포의 대사과정을 교란함으로써, 암세포의 증식, 침윤, 전이 등의 작용을 효과적으로 억제할 수 있는 락테이트를 암세포내에서 해리시킬 수 있는 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물, 암 전이억제용 약학 조성물 및 암 개선용 식품 조성물, 상기 락테이트 금속염을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법 및 암 전이 억제방법에 관한 것이다.
2011년에 발표 된 자료에 의하면 2011년 우리나라에서는 연간 218,017건의 암이 발생되었는데 모든 암의 조 발생률은 인구 10만 명당 남자 439.2명 여자 431.0명 이었다. 그리고 발병 분위로는 위암, 대장암, 폐암, 간암, 유방암 순으로 많이 발병 하였는데 위 5대 암의 발병률은 모든 암의 발병률의 50% 이상을 차지 할 정도로 발생 빈도가 높다. 남자의 경우는 위암 대장암, 폐암, 간암 순으로 발병되었으며, 여자의 경우는 갑상선을 제외하고 유방암, 대장암, 위암, 폐암 순으로 발병 되었다. 우리나라 국민들이 평균수명 까지 생존할 경우 암에 걸릴 확률은 36.9%이고 남자는 5명 중 2명(38.1%) 여자는 3명 중 1명(33.8%)에서 암이 발생할 것으로 추정되고 있다. 세계 표준인구로 보정한 우리나라의 연령표준화발생률은 인구 10만 명당 295.1명으로 미국(318.0명)이나 호주(323.0명)보다는 낮았으나 OECD 평균(271.5명) 보다는 높은 수치를 나타내고 있다. 이에 따른 사망률은 2013년 자료를 기준으로(통계청) 대한민국 전체 사망자 중 28.3%인 75,334명이 암으로 사망하고 있으며 약 2~3년 기준으로 8.8%의 증가율로 사망률은 증가할 것으로 예측되고 있다. 따라서 높은 발병률과 사망률을 보이는 암을 치료하기 위해 전 세계적으로 다양한 치료방법이 시도되고 있지만, 아직까지는 적극적인 암 치료법으로 조기와 중기 암에서 가능한 수술치료, 항암제 요법 또는 방사선 치료법이 최우선으로 손꼽힌다.
수술을 통한 치료법의 과정을 진행하기 위해서 우선 진단을 통해 종양의 분류와 유형을 알게 되는데 대부분 생체검진을 통해 진단을 한다. 근치적 치료방법으로써 수술은 종양을 둘러싼 림프절과 원발병소 모두를 제거하는 것으로, 근치적 절제술이 이에 속하고 완치가 목표기 때문에 우선적으로 수행하게 된다. 절제술의 사망률은 1~3% 이하로 감소하였고 5년간 생존율은 50% 이상으로 높아졌지만 수술 받은 환자에서 재발하는 위험이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 그리고 수술방법은 급성 부작용으로써 합병증으로 인한 출혈, 장폐색, 혈관손상, 요관손상, 직장파열, 폐렴 폐색전증이 일어날 수 있으며 이에 따라 재수술을 해야 하기도 한다. 항암화학요법은 약물, 즉 항암제를 사용하여 암을 치료하는 것으로 전신에 퍼져 있는 암 세포에 작용하는 치료방법이다. 하지만 항암제는 대부분 암 세포의 빠른 성장을 억제하도록 만들어졌기 때문에 암 세포 보다는 덜 하지만 정상세포도 손상을 받게 된다. 정상세포 중에서도 빠르게 분열하거나 증식하는 혈액세포나 구강을 포함한 위장관의 상피세포, 머리카락세포, 생식세포 등이 영향을 많이 받게 되어 빈혈, 탈모, 생식기능의 장애를 일으키는 부작용이 존재한다. 심한 경우 골수의 기능을 떨어뜨려 치료 2~3주 이내 감염을 일으키고 패혈증으로 사망에 이르기도 한다. 방사선 조사를 이용한 치료방법은 방사선이 가진 에너지를 활용하여 암 조직의 사멸과정을 유도하는 치료방법을 일컫는다. 정상적인 생활을 영위하면서 치료받는 치료법 중에 하나지만 방사선의 고 에너지에 의한 부작용으로 국소 부위의 정상피부에 손상을 유도하기도 하고 전이성 암의 경우 암 줄기세포가 방사선에 내성을 보이면서 추후에 재발이나 전이가 발생하는 단점을 가지고 있다.
이러한 단점을 해결하기 위하여, 방사선조사를 이용한 치료를 수행할 때 화학치료나 유전자 치료를 병행하는 치료방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2002-0042606호에는 N-아세틸 파이토스핑고신 유도체와 다이메틸 파이토스핑고신 유도체를 함께 포함하는 방사선 치료 증진제 조성물이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2003-0055878호에는 세라마이드류 및 그 유도체와 스핑고신 인산화효소 억제제(sphingosine kinase inhibitor)인 다이메틸스핑고신을 함께 포함하는 방사선 민감제가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제620751호에는 페오놀(paeonol)및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 방사선 치료 민감용 조성물이 개시되어 있다. 그러나 상기와 같이 방사선 치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들은 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료 시 나타나는 방사선 치료부의의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등의 부작용과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있고, 환경 자체가 면역 억제성 이므로 종양의 완전 근절이 어렵고, 재발 가능성이 높다는 위험성이 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, 암 질환의 치료에 쉽게 적용가능하고 정상 조직에 적게 영향을 주면서 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다. 최근 연구결과에 의하면, 암 세포는 고유의 특징을 가지고 있으며 그 특징을 잘 유지하며 지속적인 성장이 가능한 것으로 알려져 있다. 첫 번째로 분화신호를 지속적으로 유지하는 특징이 있는데 그 특징은 베타카테닌 신호의 유지에 의한 세포 분화, 생존이 잘 알려져 있다. 정상 세포는 베타카테닌 신호를 단백질 유비퀴티네이션 과정을 통해 과 생성을 억제하고 있지만 종양은 베타카테닌 분해과정을 회피하여 지속적으로 성장 신호를 유지한다. 두 번째로 세포의 에너지측면에서 암 세포는 글루코즈를 이용한 해당과정을 통해 젖산을 과량으로 생산하는 시스템을 가지고 고 효율의 에너지를 생산한다. 세 번째로 세포 사멸과정을 회피하는 특성을 가지고 있는데 관련 분자인 poly ADP ribose polymerase(PARP)가 활성화 되면 다양한 유전자 표적치료에 내성을 갖고 세포 사멸 기전을 회피하여 종양형성을 지속적으로 유지할 수 있다. 네 번째로 암은 침투나 전이 능력이 뛰어나고 신생혈관생성을 통해 스스로 살아가는 환경을 만들 수 있는 특징이 있다. 암이 성장을 지속하다 보면 종양 중심부위를 바탕으로 괴사가 일어나며 산소공급이 적어지게 되는데 이 때 증가하는 hypoxia inducible factor(HIF)-1α 가 상기 현상에 직접 또는 간접적으로 관여한다고 알려져 있다.
암을 치료하기 위해 이러한 암 특징들을 표적으로 하여 세포증식 및 전이억제 조절에 기반을 둔 많은 항암제가 개발되어 왔지만 성장신호를 매개하는 티로신키나아제나 저해제 등의 치료성적이 만족스럽지 못했고 약에 대한 내성의 문제도 나타났다. 복잡한 신호전달 경로의 네트워크에 의해 조절되는 암세포의 증식을 효과적으로 억제하는 방법을 찾아내는 것은 항암제 개발에 있어서 상당히 어려운 과제로 남아있다.
본 발명자들은 암세포의 증식을 효과적으로 억제하여 암을 치료하는 방법을 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, 암세포의 증식, 침윤, 전이 등의 작용을 효과적으로 억제할 수 있는 락테이트를 암세포내에서 해리시킬 수 있는 락테이트 금속염이 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 전이억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락테이트 금속염을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락테이트 금속염을 투여하는 단계를 포함하는 암 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 락테이트 금속염은 부작용이 없으면서도, 암의 주된 에너지 생산경로의 대사과정을 교란시켜서, 암세포의 성장을 억제하고, 사멸을 유도할 뿐만 아니라 방사선 조사에 대하여 내성을 유도하는 인자의 발현을 억제하므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 칼슘락테이트의 분자구조와 유사한 구조를 갖는 소듐락테이트 및 칼륨락테이트의 구조와 결합에너지를 비교한 개략도 및 도표이다.
도 2는 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 칼슘의 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다.
도 3은 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 락테이트의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 칼슘락테이트가 처리된 암세포의 내외환경에서 pH의 변화를 나타내는 그래프로서, 좌측은 세포외 환경의 pH 변화를 나타내고, 우측은 세포내 환경의 pH 변화를 나타낸다.
도 5의 상단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 mRNA 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이고, 도 5의 하단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 총 β-catenin과 활성화된 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7은 저산소조건에서 배양된 세포주에서, 해당과정의 초기에 작용하는 GLUT 1과 HK2의 mRNA 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 그래프 및 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 8은 사람의 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 발현되는 PARP 및 절단된 PARP의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 9는 칼슘락테이트, carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 처리한 대장암 세포주에서 PARP의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 10은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)에서 발현된 PARP 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 11a는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 LDH-B의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 11b는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주 자체의 형광흡광도를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 11c는 LDH-B의 단백질 발현 수준에 따른 형광의 발색수준을 정량분석한 그래프이다.
도 12는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 피루브산의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 PDH의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 13b는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 PDH의 단백질 발현 수준의 변화를 정량분석한 그래프이다.
도 14a는 정상배지에서 배양된 암 세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른 각 세포내의 α-KG의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 14b는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른 각 세포내의 α-KG의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 15의 상단은 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이고, 도 15의 하단은 산소결핍조건(hypoxia)에서 0.5, 1.5 및 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 16a는 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 VEGF의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16b는 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 VEGF의 단백질 발현 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 다양한 농도의 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 암 세포주의 배양상층액을 이용하여 배양된 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)에서, 상기 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 상기 HUVEC의 튜브형성 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다.
도 18은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 대장암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 19는 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 유방암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 20은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 흑색종 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 21a는 유방암 세포주(MCF-7)에 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 운동성여부를 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 21b는 유방암 세포주(MCF-7)에 칼슘락테이트를 처리하지 않은 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이다.
도 21c는 유방암 세포주(MCF-7)에 칼슘락테이트를 처리한 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이다.
도 21d는 유방암 세포주(MDA-MB231)에 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 운동성여부를 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 21e는 유방암 세포주(MDA-MB231)에 칼슘락테이트를 처리하지 않은 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이다.
도 21f는 유방암 세포주(MDA-MB231)에 칼슘락테이트를 처리한 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이다.
도 22는 구상체를 형성하는 대장암 줄기세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른, 구상체의 형태변화를 나타내는 현미경사진이다.
도 23은 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 대장암 세포주의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프(좌측:HCT-116, 중앙:HT-29, 우측:DLD-1)이다.
도 24a는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02)의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 24b는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 사람 흑색종 세포주(SKMEL-28)의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 25a는 칼슘락테이트와 carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 처리한 대장암 세포주의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 25b는 칼슘락테이트와 carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 조합하여 처리한 대장암 세포주의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 26은 저부착능을 나타내는 배양용기에서 배양된 대장암 세포주의 생존율에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 27은 동물모델을 이용한 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
도 28은 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부 및 처리방법에 따른 PARP의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다.
도 29는 칼슘락테이트를 경구투여시킨 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다.
도 30은 2.5Mm 칼슘락테이트를 경구투여시킨 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 31은 칼슘락테이트를 암조직 주변에 주사한 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 웨스턴블럿 사진이다.
도 32는 2.5mM 칼슘락테이트를 암조직 주변에 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 33은 동물모델에서 2.5mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다.
도 34는 25mM 칼슘락테이트를 목덜미 주변 피하에 직접 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 35는 동물모델에서 25mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다.
도 36은 동물모델을 이용한 방사선 조사 및 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
도 37a는 HT-29 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 37b는 HCT-116 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 38a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 38b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 39a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 39b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 40a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 40b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 41a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 41b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 42a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 42b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 43a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 43b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 44a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 제피티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 44b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 제피티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 45a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 소라페닙을 사람 간암 세포주(Hep3B)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 45b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 소라페닙을 사람 간암 세포주(Hep3B)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 46a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 이리노테칸을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 46b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 이리노테칸을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 47a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 에를로티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 47b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 에를로티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 48a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 서니티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 48b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 서니티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 49a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 5, 10 및 20nM 농도의 메토트렉세이트를 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 49b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 5, 10 및 20nM 농도의 메토트렉세이트를 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 50a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 카보플라틴을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 50b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 카보플라틴을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 51a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.6, 1.3 및 2.5nM 농도의 도세탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 51b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.6, 1.3 및 2.5nM 농도의 도세탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 52a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2, 4 및 8μM 농도의 라파티닙을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 52b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2, 4 및 8μM 농도의 라파티닙을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 53a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.3, 0.5 및 1nM 농도의 에버롤리무스를 사람 신장암 세포주(Caki-1)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 53b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.3, 0.5 및 1nM 농도의 에버롤리무스를 사람 신장암 세포주(Caki-1)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 54a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.23, 0.45 및 1.8ug/ml 농도의 트라스트주맵을 트라스트주맵에 강한 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 54b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.23, 0.45 및 1.8ug/ml 농도의 트라스트주맵을 트라스트주맵에 강한 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 55a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 옥살리플라틴을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 55b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 옥살리플라틴을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
발명자들은 암세포의 증식 및 전이를 효과적으로 억제하여 암을 치료하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 암 세포의 대사경로에 주목하게 되었다. 암 세포에서는 포도당으로부터 에너지를 생성함에 있어, 다량의 산소를 사용하는 미토콘드리아 호흡연쇄를 통하지 않고, 산소를 사용하지 않는 해당과정을 활용한다. 락테이트는 암 대사과정에서 다량으로 생산되지만 락테이트의 산성으로 인한 암세포 생존의 비효율성 때문에 적정 농도의 락테이트를 제외한 나머지는 세포밖으로 보내는 특징을 보인다. 때문에, 암 환자에게 인위적으로 락테이트 금속염을 투여하여 암 세포내에 락테이트를 축적시킴으로써 암세포에게는 축적된 락테이트에 의하여 암 대사의 교란이 일어나거나, 암 생존에 호의적이지 않은 암 미세환경을 구성하게 되어 결과적으로는 치명적인 손상을 유발시킬 수 있을 것으로 가정하였다.
이에, 상기 암 세포의 대사과정을 교란시키기 위한 물질로서 락테이트 금속염을 선택하였다. 이는 해당과정을 통하여 포도당이 피루브산으로 전환된 후 락테이트를 형성하기 때문에, 암세포내 락테이트의 농도를 미리 축적시키면, 해당과정이 둔화 또는 정지될 것이라고 예상하였기 때문이다. 그러나, 락테이트 자체는 체내에서 쉽게 분해될 수 있어 암세포에 효과적으로 전달되기 어려우므로, 세포외 환경에서는 쉽게 분해되지 않고, 세포내로 잘 유입된 후 분해될 수 있는 락테이트 금속염을 사용하는 것이 효과적일 것으로 예상하였다.
한편, 본 발명자들은 빈번하게 다량으로 투여될 수 있는 항암제의 특성상 체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분이 포함된 락테이트 금속염을 사용할 경우에는 상기 금속성분으로 인하여 부작용이 발생할 가능성이 있음을 고려하여, 다양한 락테이트 금속염 중에서 생체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분이 포함되지 않은 나트륨락테이트, 칼륨락테이트, 칼슘락테이트 등의 락테이트 금속염을 대상으로 락테이트에 대한 결합력과 암세포로의 락테이트 전달효율이 우수한 락테이트 금속염을 선발한 결과, 칼슘락테이트가 가장 높은 수준의 락테이트에 대한 결합력을 나타낼 뿐만 아니라 암세포로의 락테이트 전달효율이 가장 우수함을 확인하고, 상기 칼슘락테이트를 최종 선발하였다.
상기 선발된 칼슘락테이트를 암세포에 투여한 결과, 락테이트, 락테이트의 대사에 영향을 미치는 LDH-B(lactate dehydrogenase B), 피루브산 및 피루브산의 대사에 영향을 미치는 PDH(pyruvate dehydrogenase) 및 α-KG(α-ketoglutarate)의 세포내 수준이 증가하고; 암성장인자인 β-catenin, 세포내 DNA 손상을 억제하는 PARP, 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 영향을 미치는 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 세포내 수준이 감소하며; 암세포의 증식수준, 전이(운동)성 및 튜브형성 수준이 감소됨을 확인하였다.
아울러, 동물모델을 사용하여 상기 칼슘락테이트의 항암활성을 검증한 결과, 동물모델에서도 칼슘락테이트의 투여에 의하여 암세포의 성장이 억제됨을 확인하였다.
뿐만 아니라, 종래의 방사선 조사와 함께 병용투여될 경우에는, 종래에 사용된 방사선의 조사량을 감소시키면서도 동등한 수준의 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 또한, 기존에 잘 알려진 다양한 항암제와 병용하여 관련된 암 세포주에 투여 하였을 경우에도 단독처리에 의한 항암효과에 비해 병용투여될 경우, 기존에 사용되는 항암제의 농도를 감소시키면서도 더 높은 수준의 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이러한 항암활성을 나타내는 락테이트 금속염은 대부분 생체내에서 대사될 수 있기 때문에, 이들은 부작용이 없는 것으로 알려져 있으므로, 상기 락테이트 금속염은 안전성과 우수한 항암활성을 나타내는 암치료제 또는 건강식품의 유효성분으로서 사용될 수 있으며, 이러한 락테이트 금속염의 항암효과는 종래에 전혀 공지되어 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "락테이트 금속염(lactate metallic salts)"이란, 젖산(lactic acid)에 금속이온이 결합된 형태로 생성 또는 합성될 수 있는 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 락테이트 금속염은 암세포내에 투여될 경우, 락테이트가 해리되어 암세포내 락테이트의 농도를 증가시키는 수단으로 사용되는데, 본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는 락테이트 금속염은 암세포의 대사과정을 교란시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 세포외에서는 안정된 형태의 화합물을 형성하고, 암세포내에서 락테이트를 해리하여 세포내 락테이트의 농도를 증가시킬 수 있는 칼슘락테이트(calcium lactate), 아연락테이트(zinc lactate), 마그네슘락테이트(magnesium lactate), 나트륨락테이트(sodium lactate), 칼륨락테이트(potassium lactate), 철락테이트(ferrous lactate), 크롬락테이트(Chromium lactate), 구리락테이트(copper lactate), 망간락테이트(manganese lactate) 등을 각각 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있고, 다른 예로서, 세포외에서는 안정된 형태의 화합물을 형성하고, 암세포내에서 락테이트를 해리하여 세포내 락테이트의 농도를 증가시킬 수 있으며, 체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분을 포함하지 않는 칼슘락테이트, 나트륨락테이트, 칼륨락테이트 등을 각각 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있고, 또 다른 예로서, 세포외에서는 안정된 형태의 화합물을 형성하며, 암세포내에서 락테이트를 해리하여 세포내 락테이트의 농도를 증가시킬 수 있고, 체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분을 포함하지 않으며, 암세포에 대한 전달효율이 우수한 칼슘락테이트를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기 락테이트 금속염으로서 칼슘락테이트, 나트륨락테이트 및 칼륨락테이트를 모두 합성하고, 이들이 암세포내에서 락테이트를 해리시킬 수 있음을 확인하였으며, 이중에서도 가장 락테이트 전달효율이 우수한 칼슘락테이트를 사용하여 다양한 항암활성을 검증하였다.
그러나, 상기 칼슘락테이트는 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염의 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염이 칼슘락테이트로 제한되지는 않으며, 그 외의 다양한 락테이트 금속염이 본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있음은 자명하다.
상기 락테이트 금속염은 종래의 항암제와도 병용투여할 경우, 향상된 항암활성을 나타낼 수 있는데, 이는 종래의 항암제가 암 세포의 해당과정에 관여하는 기작을 갖지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 암 치료용 약학 조성물과 병용투여될 수 있는 항암제는 암 세포의 해당과정에 직접 작용하지 않는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 공지된 항암제인 이매티닙(Imatinib), 5-FU(5-Florouracil), 이리노테칸(Irinotecan), 서니티닙(Sunitinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 라파티닙(Lapatinib), 트라스트주맵(Trastuzumab, Herceptin), 제피티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Erlotinib), 메토트렉세이트(Methotrexate), 카보플라틴(Carboplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 에버롤리무스(Everolimus), 소라페닙(Sorafenib) 뿐만 아니라, 항암활성을 나타낸다고 알려진 카르보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase)의 억제제인 5-인단 설 폰아미드(5-indane sulfonamide, IS), 모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter)의 억제제인 신남산(cinnamic acid, CA) 등이 될 수 있다.
또한, 상기 락테이트 금속염은 방사선 조사시에 암세포에 방사선에 대한 내성을 부여하는 PARP, HIF-1α 및 VEGF의 발현을 감소시키므로, 방사선 조사와 병용투여할 경우에는 방사선의 항암활성을 증진시켜서, 종래보다도 방사선의 조사량을 감소시키면서도, 동등한 수준의 항암활성을 나타내도록 할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 방사선의 조사량은 특별히 이에 제한되지 않으나 1일 2 내지 10Gy가 될 수 있는데, 상기 방사선은 1일 1회 조사될 수도 있고, 상기 선량을 나누어 여러 일에 걸쳐 조사될 수도 있다.
본 발명의 용어 "칼슘락테이트(calcium lactate)"란, 젖산칼슘 또는 유산칼슘이라고도 호칭되고, 칼슘이온이 락테이트에 결합된 형태의 화학식(C6H10O6Ca·5H2O)으로 표시되는 락테이트 금속염의 일종을 의미한다. 상기 칼슘락테이트는 상온에서 백색분말 또는 입상을 나타내고, 5%(w/v)의 용해도를 나타내며, 120℃로 가열할 경우 무수물을 형성하고, 체내의 이용율과 흡수율이 우수하며, 부작용이 알려져 있지 않아, 주로 식품의 칼슘강화제 또는 산도조절제로서 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 칼슘락테이트는 본 발명에서 제공하는 암 치료용 약학 조성물의 유효성분인 락테이트 금속염의 일 예로서 사용될 수 있는데, 상기 락테이트에 결합된 칼슘은 정상세포 보다는 암세포에서 더욱 이용성이 높기 때문에, 상기 칼슘락테이트는 다른 종류의 락테이트 금속염 보다도 암세포에 대한 락테이트의 전달효율이 상대적으로 우수하다는 장점이 있다.
본 발명에서 제공하는 암 치료용 약학 조성물에 의하여 치료될 수 있는 암은 대사과정의 교란에 의하여 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 해당과정의 교란에 의하여 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암, 흑색종 등의 고형암이 될 수 있고, 다른 예로서 락테이트 금속염의 처리에 의하여 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 대장암, 유방암, 흑색종 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 락테이트 금속염을 합성하기 위하여, 다양한 락테이트 금속염 중에서 생체내에 유해를 미칠 수도 있는 금속을 포함하지 않는 락테이트 금속염인 칼슘락테이트, 나트륨락테이트 및 칼륨락테이트를 각각 합성하고, 결합에너지 및 암세포로의 락테이트 전달효율을 비교한 결과, 칼슘락테이트가 가장 높은 수준의 락테이트에 대한 결합력을 나타낼 뿐만 아니라 암세포로의 락테이트 전달효율이 가장 우수함을 확인하고, 상기 칼슘락테이트를 최종 선발하였다(도 1).
상기 선발된 칼슘락테이트를 암세포에 처리하면, 암세포내의 칼슘농도(도 2) 및 락테이트농도(도 3)이 증가하고, 세포내 pH가 저하됨(도 4)을 확인하였다. 또한, 유전자의 해독수준에서 암성장인자인 β-catenin의 발현이 억제되고(도 5), β-catenin과 활성화된 β-catenin 모두 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 단백질 발현 수준이 감소함(도 6)을 확인하였다. 또한, 상기 칼슘락테이트는 유방암 세포주(도 8), 대장암 세포주(도 9), 흑색종 세포주(도 10)에서 세포내 DNA 손상을 억제하는 PARP의 단백질 발현 수준을 감소시키고; 세포내 락테이트의 대사에 영향을 미치는 LDH-B(lactate dehydrogenase B)의 단백질 발현 수준(도 11a 내지 11c), 피루브산 수준(도 12), PDH(pyruvate dehydrogenase)의 단백질 발현 수준(도 13a 및 13b) 및 α-KG(α-ketoglutarate) 수준(도 14a 및 14b)을 증가시키며; 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 영향을 미치는 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)의 단백질 발현 수준(도 15), VEGF(vascular endothelial growth factor) 수준(도 16a 및 16b) 및 HUVEC의 튜브형성 수준(도 17)을 억제하고; 대장암 세포주(도 18), 유방암 세포주(도 19) 및 흑색종 세포주(도 20)의 세포이동성을 억제하며; 유방암 세포주(도 21a 내지 21f) 및 대장암 세포주(도 22)의 세포사멸율을 증가시키고; 대장암 세포주(도 23) 및 흑색종 세포주(도 24)의 군집형성능을 억제하며; 종래의 항암제와 병용투여할 경우, 항암효율을 증가시킴(도 25a 및 25b)을 확인하였다.
또한, 동물모델을 사용하여 상기 칼슘락테이트의 항암활성을 시험한 결과, 마우스에 대장암 세포주를 이식하여 제작된 동물모델에서 PARP 분해활성이 증가하고(도 28), HIF-1α 및 VEGF의 발현이 억제되며(도 29 및 31), 종양의 성장이 억제되고(도 30, 32 및 34), 종양의 크기가 감소되며 혈관 형성 역시 감소되어 있음(도 33 및 35)을 확인하였다. 한편, 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용처리한 결과, 종양의 성장을 더욱 효과적으로 감소시킬 수 있음(도 37)을 확인하였다.
아울러, 다양한 암의 치료에 사용되는 각종 항암제들과 칼슘락테이트를 병용 처리한 경우에도, 상기 항암제를 단독으로 처리한 경우에 비하여, 종양의 성장을 더욱 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다(도 38a 내지 55b).
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 암 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경구패치 등의 경구형 제형, 외용제, 외용패치제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 데포(depot), 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 경구패치제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용패치제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 락테이트 금속염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있는데, 상기 약학 조성물의 1회 투여량에 포함된 락테이트 금속염의 농도는 2.5 내지 25 mM이 될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 항암제 또는 항암활성을 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 암이 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 락테이트 금속염을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 암이 발병된 개체에 투여하여 암의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 암을 치료하는 방법에 있어서, 치료대상이 되는 암의 종류는 상술한 바와 동일하다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다.
본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 락테이트 금속염이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 락테이트 금속염과 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염은 종래의 항암제와도 병용투여할 경우, 향상된 항암활성을 나타낼 수 있는데, 이는 종래의 항암제가 암 세포의 해당과정에 관여하는 기작을 갖지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염과 공지된 항암제의 유효성분을 동시에 포함하는 항암제는 보다 효과적인 암 치료에 사용될 수 있다.
이때, 상기 락테이트 금속염, 공지된 항암제, 상기 암 치료용 약학 조성물이 적용될 수 있는 암질환, 투여량, 투여방법 등은 상술한 바와 동일하다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 전이억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염은 암 세포의 전이, 침윤, 신생혈관 형성, 튜브형성, 세포이동성, 군집형성능 등의 암세포의 전이를 유도할 수 있는 다양한 특성을 억제할 수 있으므로, 암 전이억제용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
이때, 전이억제의 대상이 되는 암은 앞서 정의한 바와 동일한데, 일 예로서, 상기 암 전이억제용 약학 조성물은 전이성 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전이암의 발병을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염의 일종인 칼슘락테이트를 다양한 암세포에 처리하면, 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 영향을 미치는 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)의 단백질 발현 수준(도 15), VEGF(vascular endothelial growth factor) 수준(도 16) 및 HUVEC의 튜브형성 수준(도 17)을 억제하고; 대장암 세포주(도 18), 유방암 세포주(도 19) 및 흑색종 세포주(도 20)의 세포이동성을 억제하며; 유방암 세포주(도 21) 및 대장암 세포주(도 22)의 세포사멸율을 증가시키고; 대장암 세포주(도 23) 및 흑색종 세포주(도 24)의 군집형성능을 억제함을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암의 전이가 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "전이(metastasis)"란 암 또는 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 의미한다.
본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염을 투여할 경우, 상기 전이를 억제할 수 있다.
본 발명의 암의 전이를 억제하는 방법에 있어서, 전이 억제대상이 되는 암의 종류, 투여되는 약물의 형태, 약물의 투여경로 등은 상술한 바와 동일하다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 락테이트 금속염은 대체로 생체내의 대사에 사용되어 왔고, 칼슘락테이트의 경우에는 부작용이 없다고 인정되어 공식적인 식품첨가물로서 사용되어 왔으므로, 상기 락테이트 금속염은 상식할 수 있으면서도 암의 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다. 이때, 상기 식품에 포함되는 상기 락테이트 금속염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 다른 예로서 0.1 내지 1 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 일 예로서 100㎖를 기준으로 1 내지 10g, 다른 예로서 2 내지 7g의 비율로 포함될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
한편, 상기 락테이트 금속염을 암 개선용 식품 조성물을 이용하여 암 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 암을 개선시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있는데, 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품 또는 국수가공식품의 형태인 건강기능성 식품으로 제조될 수 있다. 이때, 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 국수가공식품은 건면, 소면, 라면, 우동면, 냉면, 밀봉포장생면 등을 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "건강기능성 식품(functional food)"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 암의 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락테이트 금속염의 제작
칼슘 카보네이트, 나트륨 카보네이트 또는 칼륨 카보네이트와, 락테이트를 반응시켜서 각각의 락테이트 금속염(칼슘락테이트, 나트륨락테이트 또는 칼륨락테이트)용액을 수득하고, 이들 각각을 여과, 건조 및 분쇄하여 분말상의 락테이트 금속염(칼슘락테이트, 나트륨락테이트 또는 칼륨락테이트)을 수득하였다. 이어, 상기 수득한 각각의 락테이트 금속염(칼슘락테이트, 나트륨락테이트 또는 칼륨락테이트)의 구조와 결합에너지를 분석하였다(도 1).
도 1은 칼슘락테이트의 분자구조와 유사한 구조를 갖는 소듐락테이트 및 칼륨락테이트의 구조와 결합에너지를 비교한 개략도 및 도표이다. 도 1에서 보듯이, 칼슘락테이트는 나트륨락테이트 및 칼륨락테이트에 비하여 상대적으로 높은 수준의 결합에너지를 나타냄을 확인하였다.
이하에서는 상대적으로 높은 수준의 결합에너지를 나타내는 칼슘락테이트를 사용하여 실험을 수행하였다.
실시예 2: 종양 미세환경에 미치는 칼슘락테이트의 효과
칼슘락테이트를 암 세포에 처리한 후, 세포내 칼슘의 농도변화, 락테이트의 농도변화 및 pH 변화를 분석하여, 칼슘락테이트의 유입수준을 예측하였다.
실시예 2-1: 칼슘수준의 변화
암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 5 x 105 세포수의 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 각각 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 암세포에 10μM의 Fluo-3/AM 칼슘 염색약 및 25% Pluronic F-127을 처리하고 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 형광프로브를 가하고, 공초점 현미경으로 촬영하였다(도 2). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않은 암세포를 사용하였다.
도 2는 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 칼슘의 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다. 도 2에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리한 암세포 내에서 칼슘의 농도가 증가함을 확인하였다.
실시예 2-2: 락테이트수준의 변화
상기 실시예 2-1에서 배양된 세포를 다시 3mM(low) 또는 11mM(normal) 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양하고, 배양이 종료된 세포에 초음파를 처리하여 파쇄하였으며, 상기 파쇄물에 포함된 락테이트의 농도를 락테이트 분석 키트(AbCam, Cambridge, MA)를 이용하여 측정하였다(도 3). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않은 암세포를 사용하였다.
도 3은 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 락테이트의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 배지에 포함된 글루코즈의 농도에 상관없이 칼슘락테이트를 처리한 암세포 내에서 락테이트의 농도가 증가하였고, 이는 고농도의 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양할 경우 더욱 명확하게 나타남을 확인하였다.
실시예 2-3: 암세포 내외환경에서 pH의 변화
상기 도 2 및 3의 결과로부터, 암세포에 칼슘락테이트를 처리할 경우, 상기 칼슘락테이트가 암세포내로 유입됨을 확인하였으므로, 상기 유입된 칼슘락테이트에 의하여 암세포의 내외환경의 pH가 변화되는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 배양된 세포를 대상으로, 세포외 pH는 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 세포의 배지를 대상으로, pH 측정장치를 이용하여 측정하고, 세포내 pH는 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 세포를 대상으로, pH 탐지 키트(life technologies, CA)를 이용하여 측정하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않은 암세포를 사용하였다.
도 4는 칼슘락테이트가 처리된 암세포의 내외환경에서 pH의 변화를 나타내는 그래프로서, 좌측은 세포외 환경의 pH 변화를 나타내고, 우측은 세포내 환경의 pH 변화를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 경우, 세포외 배지의 pH는 변화되지 않았으나, 세포내 pH는 저하되어 산성을 나타냄을 확인하였다. 상기 도 4의 좌측그래프에서 보듯이, 칼슘락테이트 자체는 암 세포 외부의 pH를 변화시키지 않았으나, 상기 칼슘락테이트가 암세포내부로 유입된 경우에는 pH를 저하시켰으므로, 상기 칼슘락테이트의 유입으로 인하여 암세포내 환경이 산성으로 변화되었음을 알 수 있었다.
실시예 3: 암 성장인자의 발현에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 2의 결과로부터, 칼슘락테이트가 암세포의 내부환경을 변화시킬 수 있음을 확인하였으므로, 이러한 변화로 인하여 암세포의 성장이 변화되는지의 여부를 확인하기 위하여, 대장암 또는 유방암 세포주에서 칼슘락테이트의 처리에 따른 암성장인자의 하나인 β-catenin의 발현 수준의 변화를 유전자 및 단백질 발현 수준에서 확인하였다.
실시예 3-1: 대장암 세포주에서 β- catenin의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)를 대상으로 0, 1.5 또는 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하여, 배양된 각각의 암세포를 수득한 다음, 이에 포함된 mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준에서 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 β-catenin의 발현 수준을 비교하였다.
먼저, mRNA 발현 수준을 비교하기 위하여, 상기 각 암세포를 RNeasy® mini 키트를 사용하여 총 RNA를 추출한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 β-catenin 유전자를 수득한 다음, 이의 수준을 전기영동을 통해 비교하였다(도 5의 상단). 이때, 내부대조군으로는 액틴을 사용하였다.
β-catenin F: 5'-AAAATGGCAGTGCGTTTAG-3'(서열번호 1)
β-catenin R: 5'-TTTGAAGGCAGTCTGTCGTA-3'(서열번호 2)
ACTIN F: 5'-AAC-TGGAACGGTGAAGGT-3'(서열번호 3)
ACTIN R: 5'-CCTGTAACAACGCATCTCAT-3'(서열번호 4)
도 5의 상단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 mRNA 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 5의 상단에서 보듯이, β-catenin의 mRNA 발현 수준에서는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 차이가 나타나지 않았다.
다음으로, 단백질 발현 수준을 비교하기 위하여, 상기 각 암세포를 파쇄하고, 이를 전기영동한 다음, 1차 항체로 항-β-catenin 항체를 사용하고, 2차 항체로 항-토끼 IgG 결합체를 사용하며, 분석프로그램으로 Image-J 프로그램을 사용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 5의 하단). 이때, 내부대조군으로는 액틴을 사용하였다.
도 5의 하단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 5의 하단에서 보듯이, β-catenin의 mRNA 발현 수준과는 달리 단백질 발현 수준에서는 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 β-catenin 단백질 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
따라서, 암세포에 유입된 칼슘락테이트는 암세포의 내부환경을 변화시키고, 이로 인하여 유전자의 해독수준에서 암성장인자인 β-catenin의 발현이 억제됨을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 유방암 세포주에서 β- catenin의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 사람의 유방암 세포주(MCF-7) 및 다른 암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지)37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 사람의 유방암 세포주(MDA-MB-231)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 단백질 발현 수준에서 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 β-catenin과 활성화된 β-catenin의 발현 수준을 비교하였다(도 6).
도 6은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 총 β-catenin과 활성화된 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 6에서 보듯이, β-catenin과 활성화된 β-catenin 모두 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 단백질 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 4: 암 영양학( energetics )에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 2를 통해 암 세포주에 칼슘락테이트를 처리하면, 암 세포주 내의 락테이트의 농도가 증가함을 확인하였으므로, 상기 증가된 락테이트로 인하여 락테이트를 합성하는 해당과정에 변화가 발생하는 지의 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)를 정상 산소조건(normoxia) 또는 저산소조건(hypoxia)에서 배양하고, 상기 저산소조건에서 배양된 세포주에 칼슘락테이트를 처리한 다음, 이들 배양된 각 세포주에서 발현되는 GLUT 1과 HK2의 발현 수준을 mRNA 발현 수준 및 단백질 발현 수준에서 비교하였다(도 7).
도 7은 저산소조건에서 배양된 세포주에서, 해당과정의 초기에 작용하는 GLUT 1과 HK2의 mRNA 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 그래프 및 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 7에서 보듯이, 저산소조건에서는 해당과정의 초기에 작용하는 GLUT 1과 HK2의 발현 수준이 증가되어 해당과정이 활성화되지만, 이러한 활성화된 해당과정은 칼슘락테이트의 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다.
실시예 5: 칼슘락테이트에 의한 암 유전자의 안정화 분석
칼슘락테이트의 처리에 의하여 유전자 손상 시 복구의 염기 절제 경로의 일부로 DNA의 무결성의 유지에 중요한 역할을 하고 있는 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 발현 수준이 변화되는 지의 여부를 확인하였다.
실시예 5-1: 유방암 세포주에서 PARP의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
사람의 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)를 0, 2.5 또는 5.0mM의 칼슘락테이트를 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하여, 배양된 각각의 암세포를 수득한 다음, 이에 포함된 PARP의 단백질 발현 수준에서 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 발현 수준의 변화를 분석하였다(도 8). 이때, 상기 발현 수준의 변화는 1차 항체로 항-PARP 항체를 사용하고, 2차 항체로 항-토끼 IgG 결합체를 사용하며, 분석프로그램으로 Image-J 프로그램을 사용한 웨스턴 블럿 분석을 통해 분석하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 8은 사람의 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 발현되는 PARP 및 절단된 PARP의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 8에서 보듯이, 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 각 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 PARP의 단백질 발현 수준이 감소되고, 특히, MCF-7 세포주에서는 절단된 PARP의 단백질 발현 수준이 증가됨을 확인하였다. 이는 칼슘락테이트가 단순히 암세포주에서 해당과정을 중지시키는 수준으로 영향을 미치는 것이 아니라, 상기 해당과정을 중지시켜서 암세포에 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 역할을 수행할 수 있으므로, 항암제로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5-2: 대장암 세포주에서 PARP의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
사람의 대장암 세포주(HCT-116)에 5mM의 칼슘락테이트, carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 24시간 동안 처리한 다음, 상기 대장암 세포주에서 발현되는 PARP의 단백질 발현 수준을 비교하였다(도 9). 이때, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 암세포주를 사용하였다.
도 9는 칼슘락테이트, carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 처리한 대장암 세포주에서 PARP의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 9에서 보듯이, 상기 물질을 단독으로 처리할 경우에는 칼슘락테이트를 처리한 경우에만, PARP 단백질 발현 수준이 감소하였으나, 이들을 조합하여 처리하면, 칼슘락테이트를 처리하지 않을 경우에도 PARP 단백질 발현 수준이 감소하였고, 칼슘락테이트와 조합하여 처리할 경우에는 PARP 단백질이 더욱 낮은 수준을 나타내며, 상기 3가지 물질을 조합하여 처리하면, 세포내에서 PARP 단백질이 검출되지 않음을 확인하였다.
실시예 5-3: 흑색종 세포주에서 PARP의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)에 각각 0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 또는 10mM의 칼슘락테이트를 12시간 동안 처리하고, 상기 흑색종 세포주에서 발현되는 PARP의 단백질 발현 수준을 비교하였다(도 10).
도 10은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)에서 발현된 PARP 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 10에서 보듯이, 흑색종 세포주 역시 칼슘락테이트의 처리농도가 증가하면, PARP의 단백질 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 6: 암 세포내 락테이트 관련 대사과정에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 2 및 4의 결과로부터, 암 세포주에 칼슘락테이트가 유입되면, 세포내 락테이트의 농도가 증가하고, 해당과정을 통한 에너지 공급이 정상적으로 수행되지 않을 수 있음을 확인하였다.
이에, 상기 칼슘락테이트의 처리로 인하여 락테이트의 세포내 대사에 미치는 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 6-1: LDH -B(lactate dehydrogenase B)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
락테이트를 피루브산으로 전환시키는 효소인 LDH-B(lactate dehydrogenase B)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양하였다. 상기 배양된 암 세포주에 4%의 파라포름알데히드를 처리하여 고정하고, 항-토끼 LDHB 항체를 15 시간 동안 처리하였다. 이어, PBS로 세척하고, 비오틴이 결합 된 2차 항체를 처리한 다음, 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, FITC와 결합된 스트렙타비딘을 처리하여, 형광염색을 수행한 다음, 형광현미경으로 촬영하였다(도 11a 내지 11c). 이때, 대조군으로는 정상 산소공급조건의 암세포주(N-control) 또는 산소결핍조건의 암세포주(H-control)를 사용하였고, 각 세포의 핵은 DAPI를 이용하여 염색하였으며, 촬영된 사진은 Xenogen In Vivo Imaging System 100 시리즈 및 Living imaging 소프트웨어(Xenogen사)를 사용하여 분석하였다.
도 11a는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 LDH-B의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 11b는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주 자체의 형광흡광도를 나타내는 형광현미경 사진이며, 도 11c는 LDH-B의 단백질 발현 수준에 따른 형광의 발색수준을 정량분석한 그래프이다. 도 11a 내지 11c에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 세포에서는 LDH-B의 단백질 발현 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
실시예 6-2: 피루브산의 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 6-1의 결과로부터, 암 세포내 LDH-B의 단백질 발현 수준이 칼슘락테이트의 처리에 의하여 증가함을 확인하였으므로, 상기 LDH-B에 의해 생성되는 피루브산의 세포내 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 5 x 105 세포수의 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 24시간동안 처리하고, 초음파를 처리하여 세포를 파쇄하고, 10 kDa 필터로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 수득한 여과액을 피루브산 분석 키트(Abcam, Cambridge, MA)에 적용하여, 상기 여과액에 포함된 피루브산의 농도를 측정하였다(도 12).
도 12는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 피루브산의 농도변화를 나타내는 그래프이다. 도 12에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 세포에서는 피루브산의 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
실시예 6-3: PDH ( pyruvate dehydrogenase )의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 6-2의 결과로부터, 암 세포내 피루브산 수준이 칼슘락테이트의 처리에 의하여 증가함을 확인하였으므로, 상기 피루브산을 TCA 회로로 전이시키는 효소인 PDH(pyruvate dehydrogenase)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 항-토끼 LDHB 항체 대신에 항-토끼 PDH 항체를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 6-1의 방법을 수행하여, 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 PDH 단백질 발현 수준을 측정하였다(도 13a 및 13b).
도 13a는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 PDH의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 13b는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 PDH의 단백질 발현 수준의 변화를 정량분석한 그래프이다. 도 13a 및 13b에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 세포에서는 PDH의 단백질 발현 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
실시예 6-4: α-KG(α- ketoglutarate )의 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 6-3의 결과로부터, 암 세포내 PDH 단백질 발현 수준이 칼슘락테이트의 처리에 의하여 증가함을 확인하였으므로, 상기 PDH 단백질에 의하여 활성화되는 TCA 회로에서 생성되는 α-KG(α-ketoglutarate)의 세포내 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다. 이때, 상기 α-KG는 배지내 글루타민에 의하여 합성될 수도 있기 때문에, 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주를 대상으로 하였다.
즉, 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 5 x 105 세포수의 암 세포주에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 24시간 동안 처리한 다음, 초음파를 처리하여 세포를 파쇄하고, 10 kDa 필터로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 수득한 여과액을 α-Ketoglutarate 분석 키트(BioVision, Exton, PA)에 적용하여, 상기 여과액에 포함된 α-KG의 농도를 측정하였다(도 14a 및 14b).
도 14a는 정상배지에서 배양된 암 세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른 각 세포내의 α-KG의 농도변화를 나타내는 그래프이고; 도 14b는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른 각 세포내의 α-KG의 농도변화를 나타내는 그래프이다. 도 14a 및 14b에서 보듯이, 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주 모두에서 칼슘락테이트를 처리하면, 이들 세포내 α-KG의 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
상기 실시예 6-1 내지 6-4의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트가 처리된 암세포에서는 락테이트를 피루브산을 전환시키는 LDH-B, 상기 LDH-B에 의해 생성되는 피루브산, 상기 피루브산을 TCA 회로로 전이시키는 PDH(pyruvate dehydrogenase) 및 상기 PDH 단백질에 의하여 활성화되는 TCA 회로에서 생성되는 α-KG의 수준이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 7: 암 세포의 전이(metastasis), 침윤(invasion) 및 신생혈관 형성(angiogenesis) 인자의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 6의 결과로부터 칼슘락테이트가 처리된 암세포에서는 α-KG의 수준이 증가함을 알 수 있었으므로, 상기 α-KG에 의해 단백질의 발현 수준이 조절되는 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 미치는 인자의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 7-1: HIF - 1α ( hypoxia inducible factor 1α )의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
암세포의 전이인자로 알려진 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)를 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 각 암 세포주를 대상으로, 항-HIF-1α 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 15의 상단).
도 15의 상단은 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 15의 상단에서 보듯이, HIF-1α는 산소결핍조건(hypoxia)에서 발현되지만, 이러한 산소결핍조건에서도 칼슘락테이트가 처리되면 발현되지 않음을 확인하였다.
이에, 산소결핍조건(hypoxia)에서 상기 칼슘락테이트를 다양한 농도(0.5, 1.5 및 2.5mM)로 처리하면서 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)를 배양할 경우, 암세포의 핵에서 HIF-1α의 발현 수준의 변화를 측정하였다(도 15의 하단).
도 15의 하단은 산소결핍조건(hypoxia)에서 0.5, 1.5 및 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 15의 하단에서 보듯이, 상기 칼슘락테이트는 농도의존적으로 HIF-1α의 발현 수준을 억제함을 확인하였다.
실시예 7-2: VEGF (vascular endothelial growth factor)의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 7-1의 결과로부터 칼슘락테이트는 농도의존적으로 HIF-1α의 발현 수준을 억제함을 확인하였으므로, 상기 HIF-1α에 의하여 발현이 조절되는 암세포 침윤인자로 알려진 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 산소결핍조건(hypoxia)에서 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 각 암 세포주를 대상으로, VEGF mRNA 발현 수준 및 단백질 발현 수준을 분석하였다(도 16a 및 16b). 이때, 대조군으로는 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 칼슘락테이트를 처리하지 않고 배양된 사람 대장암 세포주를 사용하였다.
도 16a는 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 VEGF의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 16b는 정상 산소공급조건 또는 산소결핍조건에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 VEGF의 단백질 발현 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 16a 및 16b에서 보듯이, 산소결핍조건(hypoxia)에서는 VEGF의 수준이 급격히 증가하였으나, 이에 칼슘락테이트를 처리하면, 증가된 VEGF의 수준이 감소됨을 확인하였다.
실시예 7-3: 사람의 혈관 내피세포( HUVEC )의 튜브형성(tube formation)을 유발시키는 암세포 유래 인자에 미치는 칼슘락테이트의 효과
신생혈관 형성능에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하기 위하여, 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)의 튜브형성능을 유발시킬 수 있는 암세포에서 분비되는 인자에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 1%의 FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양된 암 세포주에 0.5, 1, 1.5 및 2.5mM의 칼슘락테이트를 24시간 동안 처리하면서 배양하고, 이로부터 각각의 배양상층액을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 배양상층액에 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)를 접종하고 배양하면서, 세포의 형태변화를 분석하였다(도 17). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않고 배양된 암세포주의 배양액을 이용하여 배양된 HUVEC를 사용하고, 비교군으로는 HUVEC의 성장 억제제인 설포라판(Sulforaphane)을 처리하여 배양된 HUVEC를 사용하였다.
도 17은 다양한 농도의 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 암 세포주의 배양상층액을 이용하여 배양된 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)에서, 상기 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 상기 HUVEC의 튜브형성 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다. 도 17에서 보듯이, 우수한 튜브형성능을 나타내는 대조군에 비하여, 칼슘락테이트가 처리된 암 세포주의 배양상층액을 사용하여 배양된 HUVEC는 칼슘락테이트의 농도가 증가함에 따라 튜브형성능이 감소하며, 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리한 암세포주의 배양상층액에서 배양된 HUVEC는 설포라판을 처리한 비교군과 유사한 수준으로 튜브형성능이 감소됨을 확인하였다. 상기 HUVEC는 암세포에서 분비되는 인자에 의하여 혈관형성이 유도되므로, 상기 칼슘락테이트는 혈관형성을 유도하는 인자의 작용을 농도의존적으로 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
상기 실시예 7-1 내지 7-3의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 암세포의 전이인자로 알려진 HIF-1α 및 암세포 침윤인자로 알려진 VEGF의 발현을 억제하고, 혈관신생을 유도하는 인자의 작용을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 8: 암 세포주의 전이(metastasis) 및 침윤(invasion)에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 7의 결과로부터, 칼슘락테이트는 암세포의 전이인자로 알려진 HIF-1α 및 암세포 침윤인자로 알려진 VEGF의 발현을 억제하고, 혈관신생을 유도하는 인자의 작용을 억제하는 효과를 확인하였으므로, 실제로 암세포의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 암세포의 이동능력 분석을 통하여 확인하고자 하였다.
실시예 8-1: 대장암 세포주의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과
중간에 500㎛ 두께의 ibidi culture insert가 삽입된 형태의 배양용기에 4 x 105 세포수의 대장암 세포주 HCT-116을 접종하여 배양하면서, 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리한 다음 다시 24시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 insert를 제거하고, 12시간 동안 추가로 배양하면서, 상기 insert가 제거된 부위로 암세포가 이동하는 수준을 JuLi Br, Live cell analyzer(NanoEnTek Inc, South Korea)를 사용하여 분석하였다(도 18). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않고 배양한 대장암 세포주를 사용하였다.
도 18은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 대장암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 18에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리한 대장암 세포주는 세포의 전이능력이 감소하였으나, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군의 대장암 세포주는 세포의 전이능력이 유지됨을 확인하였다.
실시예 8-2: 유방암 세포주의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과
대장암 세포주 대신에 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB231)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 8-1과 동일한 방법을 수행하여, 유방암 세포주의 이동성에 대한 칼슘락테이트의 효과를 확인하였다(도 19).
도 19는 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 유방암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 19에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군의 유방암 세포주에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 유방암 세포주는 상대적으로 낮은 수준의 세포주 전이능력을 나타냄을 확인하였다.
실시예 8-3: 흑색종 세포주의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과
대장암 세포주 대신에 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)를 사용하고, insert 제거후 24시간 동안 추가로 배양하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 8-1과 동일한 방법을 수행하여, 흑색종 세포주의 이동성에 대한 칼슘락테이트의 효과를 확인하였다(도 20).
도 20은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 흑색종 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 20에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군의 흑색종 세포주에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 흑색종 세포주는 상대적으로 낮은 수준의 세포주 전이능력을 나타냄을 확인하였다.
상기 실시예 8-1 내지 8-3의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 대장암, 유방암, 흑색종 등의 모든 암세포의 세포 전이능력을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 9: 암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테이트의 효과
유방암 세포주, 대장암 세포주 및 흑색종 세포주의 생존능력에 대한 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 9-1: 유방암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테이트의 효과
유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB231)에 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않은 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이전의 각 유방암 세포주와 배양이 종료된 각 유방암 세포주에 5㎕의 FITC Annexin V와 5㎕의 PI를 처리하고 15분 동안 실온에서 반응시킨 다음, FACS Calibur(BD Bioscience, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하여, 이들의 염색수준을 평가함으로써, 암세포의 사멸율을 측정하였다(도 21a 내지 21f).
도 21a는 유방암 세포주(MCF-7)에 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 운동성여부를 확인한 결과를 나타낸 사진이고, 도 21b는 유방암 세포주(MCF-7)에 칼슘락테이트를 처리하지 않은 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이며, 도 21c는 유방암 세포주(MCF-7)에 칼슘락테이트를 처리한 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이고, 도 21d는 유방암 세포주(MDA-MB231)에 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 운동성여부를 확인한 결과를 나타낸 사진이며, 도 21e는 유방암 세포주(MDA-MB231)에 칼슘락테이트를 처리하지 않은 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이고, 도 21f는 유방암 세포주(MDA-MB231)에 칼슘락테이트를 처리한 경우의 세포 생존율을 나타내는 유세포 분석결과 그래프이다. 도 21a 내지 21c에서 보듯이, MCF-7 세포주는 칼슘락테이트를 처리하기 전에는 9.63%의 세포사멸율을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 이후에는 33.8%의 세포사멸율을 나타내었고, 도 21d 내지 21f에서 보듯이, MDA-MB231 세포주는 칼슘락테이트를 처리하기 전에는 10.17%의 세포사멸율을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 이후에는 13.05%의 세포사멸율을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 상기 유방암 세포주에 칼슘락테이트를 처리하면, 세포사멸율이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 9-2: 대장암 줄기세포주의 형태변화에 미치는 칼슘락테이트의 효과
사람 대장암 줄기세포주를 줄기세포 배양배지(1% 페니실린/스트렙토마이신 및 50배의 B27을 포함하고, DMEM 배지와 F12 배지가 1:1로 혼합된 배지)에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양하였다. 상기 배양된 대장암 줄기세포주에 칼슘락테이트를 처리하고 줄기세포가 형성하는 구상체(sphere)의 형태가 변화되는지의 여부를 확인하였다(도 22). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않고, DMSO를 처리한 것을 사용하였다.
도 22는 구상체를 형성하는 대장암 줄기세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른, 구상체의 형태변화를 나타내는 현미경사진이다. 도 22에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리되지 않은 대조군에서는 구상체가 유지되었으나, 칼슘락테이트를 처리하면 구상체의 형태가 파괴되어 대장암 줄기세포의 생존능이 감소됨을 확인하였다.
실시예 9-3: 암 세포주의 군집형성능에 미치는 칼슘락테이트의 효과
먼저, 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)를 다양한 농도(0, 0.5, 1.5 또는 2.5 mM)의 칼슘락테이트를 포함하는 고체배지에 접종하여 10일 동안 배양하고, 배양이 종료된 후, 세포를 고정시킨 다음, 헤마톡실린으로 염색하여 군집이 형성된 암세포의 수를 계수하였다(도 23).
도 23은 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 대장암 세포주의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프(좌측:HCT-116, 중앙:HT-29, 우측:DLD-1)이다. 도 23에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 모든 대장암 세포주는 260 내지 360개의 군집을 형성하였으나, 칼슘락테이트의 처리농도가 증가함에 따라 군집의 수가 감소하였고, 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리한 경우에는 100 내지 120개의 군집을 형성함을 확인하였다.
다음으로, 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)를 다양한 농도(1, 2.5 또는 5 mM)의 칼슘락테이트를 포함하는 고체배지에 접종하여 배양하는 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법을 수행하여, 군집이 형성된 암세포의 수를 계수하였다(도 24a 및 24b).
도 24a는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02)의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이고, 도 24b는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 사람 흑색종 세포주(SKMEL-28)의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다. 도 24a 및 24b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 사람 흑색종 세포주는 105 내지 168개의 군집을 형성하였으나, 칼슘락테이트의 처리농도가 증가함에 따라 군집의 수가 감소하였고, 5 mM의 칼슘락테이트를 처리한 KMEL-28 세포주에서는 군집이 아예 소멸하였으며, 5 mM의 칼슘락테이트를 처리한 SKMEL-02 세포주에서는 약 49개의 적은 군집을 형성하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 대장암 및 흑색종세포주의 군집형성능을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 9-4: 암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테이트와 항암활성을 나타내는 물질을 조합처리한 효과
5mM의 칼슘락테이트 또는 항암활성을 나타낸다고 알려진 물질(1mM의 IS(5-indane sulfonamide) 또는 5mM CA(cinnamic acid))을 각각 개별적으로 또는 조합하여 포함하는 고체배지를 각각 제작하고, 상기 제작된 각 고체배지에 사람 대장암 세포주인 HCT-116을 접종하고 10일 동안 배양한 다음, 세포의 생존율을 비교하였다(도 25a 및 25b).
도 25a는 칼슘락테이트와 carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 처리한 대장암 세포주의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 25b는 칼슘락테이트와 carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 조합하여 처리한 대장암 세포주의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 25a 및 25b에서 보듯이, 칼슘락테이트 또는 항암활성을 나타낸다고 알려진 물질(IS 또는 CA)을 개별적으로 처리한 대장암 세포주는 그의 생존율이 약 60% 수준으로 감소하였고, 상기 칼슘락테이트 및 항암활성을 나타낸다고 알려진 물질을 조합하여 처리한 대장암 세포주는 그의 생존율이 약 10 내지 30% 수준으로 더욱 감소됨을 확인하였다.
실시예 9-5: 세포부착능이 감소된 암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테이트의 효과
저부착능을 나타내는 6웰 플레이트에 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)를 접종하여 배양하면서, 다양한 농도(0, 1.5 또는 2.5 mM)의 칼슘락테이트를 처리한 다음, 세포의 생존율을 비교하였다(도 26).
도 26은 저부착능을 나타내는 배양용기에서 배양된 대장암 세포주의 생존율에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 26에서 보듯이, 저부착능을 나타내는 배양용기에 배양할 경우에도 칼슘락테이트를 처리하지 않으면, 세포사멸율이 매우 낮은 수준(약 5%)을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리하면, 세포사멸율이 급격히 증가됨(약 90%)을 확인하였다.
상기 실시예 9-1 내지 9-5의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 대장암, 흑색종 등의 모든 암세포의 생존율을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 10: 동물모델을 이용한 칼슘락테이트의 항암효과 검증
실시예 10-1: 동물모델을 이용한 실험군의 설정
RPMI1640 배지에서 배양한 다음, PBS에 희석시킨 대장암 세포(HT-29)를 Balb/c 종의 마우스의 옆구리 피하에 이식하고, 상기 마우스에서 약 5mm가 되도록 대장암 세포가 성장할 때까지 사육한 다음, 30일 동안 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군(control); 2.5mM의 칼슘락테이트를 경구투여한 실험군 1(peroral, P.O); 종양부위에 2.5mM의 칼슘락테이트를 주사한 실험군 2(intra tumor, I.T) 및 25Mm의 칼슘락테이트를 피하주사한 실험군 3(subcutaneous, S.C)을 각각 설정하였다(도 27).
도 27은 동물모델을 이용한 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
실시예 10-2: PARP의 발현 수준 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군, 실험군 1 또는 실험군 2의 마우스로부터 각각의 대장암조직을 적출하고, 이로부터 발현된 암 유전자의 안정화에 기여하는 PARP 및 절단된 PARP의 발현 수준을 비교하였다(도 28).
도 28은 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부 및 처리방법에 따른 PARP의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다. 도 28에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 서로 다른 방법으로 칼슘락테이트를 처리한 실험군에서는 PARP의 분해활성이 증가함을 확인하였다.
실시예 10-3: 칼슘락테이트를 경구투여시킨 동물모델에서 HIF - 1α 및 VEGF의 발현 수준 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 1의 마우스로부터 각각의 대장암조직을 적출하고, 이로부터 발현된 종양의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 관여하는 HIF-1α와 VEGF의 발현 수준을 비교하였다(도 29). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 29는 칼슘락테이트를 경구투여시킨 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다. 도 29에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 1에서는 HIF-1α 및 VEGF의 발현이 억제됨을 확인하였다.
실시예 10-4: 칼슘락테이트를 경구투여시킨 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 1의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 30).
도 30은 2.5Mm 칼슘락테이트를 경구투여시킨 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 30에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군은 최종적으로 종양부피가 약 1200 ㎣ x 103을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 1은 최종적으로 종양부피가 약 480 ㎣ x 103을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 칼슘락테이트는 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10-5: 칼슘락테이트를 주사한 동물모델에서 HIF - 1α 및 VEGF의 발현 수준 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 2의 마우스로부터 각각의 대장암조직을 적출하고, 이로부터 발현된 종양의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 관여하는 HIF-1α와 VEGF의 발현 수준을 비교하였다(도 31). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 31은 칼슘락테이트를 암조직 주변에 주사한 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 웨스턴블럿 사진이다. 도 31에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 2에서는 HIF-1α 및 VEGF의 발현이 억제됨을 확인하였다.
실시예 10-6: 칼슘락테이트를 주사한 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 2의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 32).
도 32는 2.5mM 칼슘락테이트를 암조직에 직접 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 32에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군은 최종적으로 종양부피가 약 1200 ㎣ x 103을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 2는 최종적으로 종양부피가 약 490 ㎣ x 103을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 칼슘락테이트는 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10-7: 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 2의 마우스에서 형성된 종양조직의 형태를 비교하였다(도 33).
도 33은 동물모델에서 2.5mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다. 도 33에서 보듯이, 2.5mM 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에서 촬영된 종양은 그의 크기가 훨씬 크며 종양 표면에 혈관 형성이 증가되어 있고, 실험군에서 촬영된 종양은 그의 크기가 매우 감소되어 있으며 혈관 형성 역시 감소되어 있음을 확인하였다.
실시예 10-8: 칼슘락테이트를 피하 주사한 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 3의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 34).
도 34는 25mM 칼슘락테이트를 목덜미 주변 피하에 직접 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 34에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군은 최종적으로 종양부피가 약 2,300㎣를 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 3은 최종적으로 종양부피가 약 80㎣를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 25mM 칼슘락테이트는 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10-9: 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 3의 마우스에서 형성된 종양 조직의 형태를 비교하였다(도 35).
도 35는 동물모델에서 25mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다. 도 35에서 보듯이, 25 mM 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에서 촬영 된 종양은 그의 크기가 훨씬 크며 종양 표면에 혈관 형성이 증가되어 있고, 실험군 3에서 촬영된 종양은 그의 크기가 매우 감소되어 있으며 혈관 형성 역시 감소되어 있음을 확인하였다.
따라서, 상기 실시예 10-1 내지 10-9의 결과를 종합하면, 동물모델에서 2.5mM 내지 25mM 농도의 칼슘락테이트가 우수한 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 11: 방사선 조사와 칼슘락테이트의 병용투여를 통한 대장암 치료효과
상기 실시예 10-2, 10-3 및 10-5에서 칼슘락테이트의 처리에 따라 PARP, HIF-1α 및 VEGF의 발현이 감소함을 확인하였는데, 상기 인자는 방사선 치료에 대한 저항성을 부여하는 특성을 나타내므로, 상기 인자가 칼슘락테이트에 의해 감소될 경우, 방사선 치료에 대한 효율이 증가될 것으로 예상하고, 이를 검증하였다.
실시예 11-1: 동물모델을 이용한 실험군의 설정
마우스의 옆구리 피하에 대장암 세포(HT-29 또는 HCT-116)를 이식하고, 상기 각 마우스에서 약 5mm의 크기로 대장암세포가 성장할 때까지 사육한 다음, 30일 동안 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군(control); 2.5mM의 칼슘락테이트를 주사한 실험군 11(intra tumor, I.T), 2.0 mm 알루미늄 필터를 장착 한 X-RAD 320 X-ray 조사기(300 kVp)를 사용하여 2Gy의 방사선을 5회 조사한 실험군 12(IR) 또는 2Gy의 방사선을 5회 조사함과 동시에 2.5mM의 칼슘락테이트를 주사한 실험군 13(CaLa+IR)을 각각 설정하였다(도 36).
도 36은 동물모델을 이용한 방사선 조사 및 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
실시예 11-2: 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용처리한 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 11-1에서 설정된 대조군 또는 각 실험군의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 37a 및 37b).
도 37a는 HT-29 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 37b는 HCT-116 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
상기 도 37a 및 37b에서 보듯이, 이식된 대장암 세포에 상관없이, 방사선 조사 및 칼슘락테이트를 전혀 처리하지 않은 대조군에 비하여, 방사선 조사 및 칼슘락테이트 처리를 개별적으로 또는 조합하여 처리한 실험군에서는 종양의 성장이 억제됨을 확인하였고, 상기 실험군 중에서도 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용투여한 실험군 13이 종양의 성장을 가장 낮은 수준으로 저하시킴을 확인하였다.
이러한 결과는, 칼슘락테이트의 처리에 의하여 방사선에 대한 저항성을 부여하는 인자의 발현을 억제시킬 수 있음을 입증하는 것으로서, 칼슘락테이트와 방사선 조사를 병용투여할 경우, 보다 적은 선량으로 방사선을 조사하여도 항암치료의 효율을 증진시킬 수 있을 것으로 분석되었다.
따라서, 암의 치료에 있어서, 칼슘락테이트를 단독으로 처리할 수도 있으나, 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용투여하면 더욱 향상된 항암치료효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 12: 공지된 항암제와 칼슘락테이트의 병용처리
상기 실시예 9-4 에서 칼슘락테이트와 항암활성을 나타내는 물질의 병용처리에 의하여 암 세포의 생존 능력이 단독처리에 비해 감소함을 확인하였는데, 상기 결과를 바탕으로 공지된 항암제와 칼슘락테이트의 병용처리가 다양한 암 세포주에 미치는 치료효과를 검증하였다.
실시예 12-1: 이매티닙(Imatinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1, 2.5 및 5μM의 이매티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1, 2.5 및 5μM) Imatinib과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 활용하였다(도 38a, 38b, 39a 및 39b).
도 38a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 38b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이며; 도 39a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 39b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 38a, 38b, 39a 및 39b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1, 2.5 및 5μM)의 이매티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군(control)에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 이매티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 이매티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12- 2: 5 -FU(5- Fluorourasil )와 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 2.5, 5 및 10μM의 5-FU를 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(2.5, 5 및 10μM) 5-FU와 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 활용하였다(도 40a, 40b, 41a 및 41b).
도 40a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 40b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이며; 도 41a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 41b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 40a, 40b, 41a 및 41b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(2.5, 5 및 10μM)의 5-FU를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 5-FU와 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 5-FU를 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다
실시예 12-3: 파클리탁셀(Paclitaxel)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 유방암 세포주(MCF-7)와 사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.63, 1.3 및 2.5nM의 파클리탁셀을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.63, 1.3 및 2.5nM) 파클리탁셀과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 유방암(MCF-7) 및 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 42a, 42b, 43a 및 43b).
도 42a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 42b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 42a 및 42b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 파클리탁셀의 낮은 농도(0.63, 1.3 및 2.5nM)를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 파클리탁셀과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 파클리탁셀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
도 43a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 43b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 43a 및 43b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.63, 1.3 및 2.5nM)의 파클리탁셀을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 파클리탁셀과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 파클리탁셀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-4: 제피티닙(Gefitinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1.3, 2.5 및 5μM의 제피티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1.3, 2.5 및 5μM) 제피티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 44a 및 44b).
도 44a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 제피티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 44b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 제피티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 44a 및 44b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1.3, 2.5 및 5μM)의 제피티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 제피티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 제피티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-5: 소라페닙(Sorafenib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 간암 세포주(Hep3B)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1, 2.5 및 5μM의 소라페닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1, 2.5 및 5μM) 소라페닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 간암 세포주(Hep3B)를 활용하였다(도 45a 및 45b).
도 45a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 소라페닙을 사람 간암 세포주(Hep3B)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 45b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 소라페닙을 사람 간암 세포주(Hep3B)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 45a 및 45b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1, 2.5 및 5μM)의 소라페닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 소라페닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 소라페닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-6: 이리노테칸(Irinotecan)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.5, 1 및 2μM의 이리노테칸을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.5, 1 및 2μM) 이리노테칸과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29)를 활용하였다(도 46a 및 46b).
도 46a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 이리노테칸을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 46b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 이리노테칸을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 46a 및 46b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.5, 1 및 2μM)의 이리노테칸을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 이리노테칸과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 이리노테칸을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-7: 에를로티닙(Erlotinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.5, 1 및 2μM의 에를로티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.5, 1 및 2μM) 에를로티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 47a 및 47b).
도 47a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 에를로티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 47b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 에를로티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 47a 및 47b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.5, 1 및 2μM)의 에를로티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 에를로티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 에를로티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-8: 서니티닙(Sunitinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.5, 1 및 2μM의 서니티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.5, 1 및 2μM) 서니티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29)를 활용하였다(도 48a 및 48b).
도 48a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 서니티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 48b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 서니티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 48a 및 48b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.5, 1 및 2μM)의 서니티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 서니티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 서니티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-9: 메토트렉세이트(Methotrexate)와 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 5, 10 및 20nM의 메토트렉세이트를 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(5, 10 및 20nM) 메토트렉세이트와 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 49a 및 49b).
도 49a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 5, 10 및 20nM 농도의 메토트렉세이트를 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 49b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 5, 10 및 20nM 농도의 메토트렉세이트를 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 49a 및 49b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(5, 10 및 20nM)의 메토트렉세이트를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 메토트렉세이트와 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 메토트렉세이트를 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-10: 카보플라틴(Carboplatin)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 2.5, 5 및 10μM의 카보플라틴을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(2.5, 5 및 10μM) 카보플라틴과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 50a 및 50b).
도 50a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 카보플라틴을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 50b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 카보플라틴을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 50a 및 50b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(2.5, 5 및 10μM)의 카보플라틴을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 카보플라틴과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 카보플라틴을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-11: 도세탁셀(Docetaxel)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.6, 1.3 및 2.5nM의 도세탁셀을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.6, 1.3 및 2.5nM) 도세탁셀과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 51a 및 51b).
도 51a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.6, 1.3 및 2.5nM 농도의 도세탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 51b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.6, 1.3 및 2.5nM 농도의 도세탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 51a 및 51b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.6, 1.3 및 2.5nM)의 도세탁셀을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 도세탁셀과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 도세탁셀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-12: 라파티닙(Lapatinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 유방암 세포주(MCF-7)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 2, 4 및 8μM의 라파티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(2, 4 및 8μM) 라파티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 유방암 세포주(MCF-7)를 활용하였다(도 52a 및 52b).
도 52a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2, 4 및 8μM 농도의 라파티닙을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 52b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2, 4 및 8μM 농도의 라파티닙을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 52a 및 52b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(2, 4 및 8μM)의 라파티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 라파티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 라파티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-13: 에버롤리무스(Everolimus)와 칼슘락테이트의 병용처리
사람 신장암 세포주(Caki-1)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.3, 0.5 및 1nM의 에버롤리무스를 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.3, 0.5 및 1nM) 에버롤리무스와 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 신장암 세포주(Caki-1)를 활용하였다(도 53a 및 53b).
도 53a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.3, 0.5 및 1nM 농도의 에버롤리무스를 사람 신장암 세포주(Caki-1)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 53b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.3, 0.5 및 1nM 농도의 에버롤리무스를 사람 신장암 세포주(Caki-1)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 53a 및 53b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.3, 0.5 및 1nM)의 에버롤리무스를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 에버롤리무스와 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 에버롤리무스를 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-14: 트라스트주맵 ( Trastuzumab , Herceptin )과 칼슘락테이트의 병용처리
트라스트주맵에 항암제 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)를 RPMI1640 배지(1% fetal bovine serum+500ng/ul epithelial growth factor)가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.23, 0.45 및 18㎍/㎖의 트라스트주맵을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.23, 0.45 및 18㎍/㎖) 트라스트주맵과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 유방암 세포주(MCF-7)를 활용하였다(도 54a 및 54b).
도 54a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.23, 0.45 및 1.8ug/ml 농도의 트라스트주맵을 트라스트주맵에 강한 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 54b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.23, 0.45 및 1.8ug/ml 농도의 트라스트주맵을 트라스트주맵에 강한 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 54a 및 54b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹에서는 대조군에 비해 군집형성 능력이 감소되었으나, 여러 농도(0.23, 0.45 및 18㎍/㎖)의 트라스트주맵을 단독 처리한 그룹은 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 거의 차이가 없는 것을 확인하였다. 그러나, 0.23, 0.45 및 18㎍/㎖ 농도의 트라스트주맵과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 트라스트주맵을 단독으로 처리하여 항암제 효과가 없었던 그룹에 비해 군집형성 능력이 보다 낮은 수준을 나타내도록 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-15: 옥살리플라틴(Oxaliplatin)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1.3, 2.5 및 5μM의 옥살리플라틴을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1.3, 2.5 및 5μM) 옥살리플라틴과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29)를 활용하였다(도 55a 및 55b).
도 55a는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 옥살리플라틴을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소정도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고; 도 55b는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 옥살리플라틴을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 개별 군집의 형성 억제 정도를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 55a 및 55b에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1.3, 2.5 및 5μM)의 옥살리플라틴을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 옥살리플라틴과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 옥살리플라틴을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
이러한 결과는, 칼슘락테이트와 공지된 항암제를 병용투여할 경우, 종래의 항암제를 보다 적은 용량으로 투여하여도 항암치료의 효율을 증진시킬 수 있음을 암시하는 것으로 분석되었다.
따라서, 암 세포에 락테이트 금속염을 단독으로 처리하여도 항암활성을 나타낼 수 있으나, 락테이트 금속염과 공지된 항암제를 병용투여하면 더욱 향상된 항암치료효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 트라스트주맵의 결과에서 보듯이, 공지된 항암제에 대한 암세포의 민감성을 더욱 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (20)

  1. 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 락테이트 금속염은 칼슘락테이트(calcium lactate), 아연락테이트(zinc lactate), 마그네슘락테이트(magnesium lactate), 나트륨락테이트(sodium lactate), 칼륨락테이트(potassium lactate), 철락테이트(ferrous lactate), 크롬락테이트(Chromium lactate), 구리락테이트(copper lactate), 망간락테이트(manganese lactate) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 락테이트 금속염은 칼슘락테이트인 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    방사선 조사 또는 항암제와의 병용치료에 사용되는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 방사선은 1일 2 내지 10Gy의 조사량으로 암환자에게 조사하면서, 상기 약학 조성물과 병용처리되는 것인 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 항암제는 이매티닙(Imatinib), 5-FU(5-Florouracil), 이리노테칸(Irinotecan), 서니티닙(Sunitinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 라파티닙(Lapatinib), 트라스트주맵(Trastuzumab, Herceptin), 제피티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Erlotinib), 메토트렉세이트(Methotrexate), 카보플라틴(Carboplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 에버롤리무스(Everolimus), 소라페닙(Sorafenib), 카르보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase)의 억제제 및 모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter)의 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제인 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 패치, 캡슐제, 환제, 정제, 데포(depot) 또는 좌제의 형태로 제형화되는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법.
  11. 락테이트 금속염과 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 락테이트 금속염은 칼슘락테이트(calcium lactate), 아연락테이트(zinc lactate), 마그네슘락테이트(magnesium lactate), 나트륨락테이트(sodium lactate), 칼륨락테이트(potassium lactate), 철락테이트(ferrous lactate), 크롬락테이트(Chromium lactate), 구리락테이트(copper lactate), 망간락테이트(manganese lactate) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 항암제는 이매티닙(Imatinib), 5-FU(5-Florouracil), 이리노테칸(Irinotecan), 서니티닙(Sunitinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 라파티닙(Lapatinib), 트라스트주맵(Trastuzumab, Herceptin), 제피티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Erlotinib), 메토트렉세이트(Methotrexate), 카보플라틴(Carboplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 에버롤리무스(Everolimus), 소라페닙(Sorafenib), 카르보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase)의 억제제 및 모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter)의 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제인 것인 조성물.
  14. 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 전이억제용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 락테이트 금속염은 칼슘락테이트인 것인 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 전이성 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전이암의 발병을 억제하는 것인 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암의 전이가 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법.
  18. 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 개선용 식품 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 락테이트 금속염은 칼슘락테이트인 것인 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품 또는 국수가공식품의 형태인 건강기능성 식품으로 제조되는 것인 조성물.
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