CN114431223A - 一种肠道样本的保存液和肠道样本的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于保存肠道样本中微生物核酸完整性的保存液及保存方法。保存液包括Tris‑HCl、乙酸、乙酸钠、Triton X‑100、盐酸胍、脲、乙二胺四乙酸二钠、乙醇、青霉素、硫酸链霉素和蛋白酶K。将上述保存液和肠道样本混合均匀后可在常温条件下长期保存。本发明所述保存液和保存方法可以抑制微生物生长繁殖并破坏微生物结构释放其核酸，且含有抑制核酸酶活性成分，避免释放的核酸降解，同时提供了长期稳定保存核酸稳定性的缓冲体系，保存时间长，适用温度范围广。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更为具体的是涉及用于保存肠道样本中微生物核酸完整性的保存液。
背景技术
肠道菌群，作为寄居在人体肠道内微生物的总称，作为人类的第二套基因组，越来越受到研究者及社会的关注。人类肠道中约有1014个，超过1000种细菌，其基因组总量约是人体基因组的100倍。肠道菌群这个复杂的微生态系统，对宿主的健康有着重要意义，肠道菌群失调会导致一系列的健康问题，包括肠道疾病(如肠易激综合症、腹泻、胀气、便秘、消化不良等)、代谢综合症(如肥胖、糖尿病、高血压等)、免疫力低下，营养消化吸收不良等。
肠道样本，可反映该人体肠道菌群状况。目前采用16S rDNA法鉴定肠道样本中所有细菌种类，通过生物信息分析肠道菌群的种类，然后依靠大量参考文献和实验室对照数据，获知该人体肠道菌群的比例是否正常，从而判断是否患某种疾病，进而给出相应的膳食建议。
16S rDNA鉴定是指利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定，是目前较为常见和通用的细菌种属鉴定方法。16S rDNA基因的序列有10 个保守区和9个高变区(V1-V9:长度分布范围约30～100bp)之分。保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。根据保守区设计引物位点，扩增可变区获得的序列可以用于菌种鉴定。因此想要如实的反映人体肠道的菌群状况，就需要保持肠道样本菌群核酸的稳定性。
由于肠道样本离体后，其环境发生变化，其中提供微生物代谢的能量来源也只消耗不补充状态，与此同时，其中部分细菌还保持了活性，继续代谢和生长，而由于环境变化，不同细菌其增长与死亡的速率已经不同于排便前。因此，需要对肠道样本进行一些保护措施，尽量将其中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，从而最好的代表受试者肠道中的共生微生物。目前采用的保存方法有采集后立即冷冻保存或用特定保存液摇匀室温保存。
为鉴定肠道样本中肠道菌群的准确性，使肠道菌群内的微生物种类保持与在体内时菌群分布保持一致性，要求肠道样本从受试者到实验室途中不受地域、时间、温度影响，有必要研究确定合适的保存液，使得在常温下就能保存且不改变微生物构造。因此需要考虑以下两点，一是要确保肠道样本排出体外后能迅速无菌保藏。二是病人地域分布广，要确保在运输途中，样品不受时间和温度影响。所以，确定一种保存液用来存储肠道样本就显得十分重要。病人只需要将采集的肠道样本置于保存液中摇匀，无需冻存，即可达到稳定其中微生物构造的作用，能够用于肠道样本的长途运输，也方便实验人员的鉴定工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种保存肠道样本中微生物核酸完整性的保存液和保存方法、以及保存液的制备方法。本发明所述保存液，可在常温条件下长期保存肠道样本，方便采样者在任何时候可以进行采样及样本保存，同时满足样本长途运输的要求。其中的保存液无毒性试剂，使用简单，可在常温条件下保存肠道样本，保存时间长达1年；保存的肠道样本常温条件下即可进行转运。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案包括：提供一种用于保存肠道样本中微生物核酸完整性的保存液，包括缓冲剂、抗生素、有机醇和变性剂，所述抗生素为至少两种抗生素，所述有机醇为高浓度有机醇。进一步的，所述保存液还包括去污剂、金属离子螯合剂、有机酸和蛋白酶K。
进一步的，所述变性剂包括盐酸胍和脲。
进一步的，所述盐酸胍的浓度为0.1-1mol/L、所述脲的浓度为0.1-1mol/L。
进一步的，所述抗生素包括青霉素和硫酸链霉素。
进一步的，所述青霉素的浓度为10-1000U/mL和硫酸链霉素的浓度 0.01-1mg/mL。
进一步的，所述有机醇为乙醇。
进一步的，所述乙醇的浓度为30％-70％。
更为具体的，所述保存也包括Tris-HCl、乙酸、乙酸钠、Triton X-100、盐酸胍、脲、乙二胺四乙酸二钠、乙醇、青霉素、硫酸链霉素和蛋白酶K。
进一步的，包括PH为6.5-8.5的Tris-HCl 0.1-1mol/L、乙酸0.05-0.5mol/L、乙酸钠0.1-0.5mol/L、Triton X-100 1-10％、盐酸胍0.1-1mol/L、脲0.1-1mol/L、乙二胺四乙酸二钠1-10mmol/L、青霉素10-1000U/mL、硫酸链霉素0.01-1mg/mL、乙醇30％-70％和蛋白酶K1-20mg/mL，体系PH7.0-9.0。
更进一步的，包括PH为8.0的Tris-HCl 0.3mol/L、乙酸0.1mol/L、乙酸钠0.33mol/L、Triton X-100 5％、盐酸胍0.67mol/L、脲0.33mol/L、乙二胺四乙酸二钠3.3mmol/L、青霉素100U/mL、硫酸链霉素0.1mg/mL、乙醇50％和蛋白酶K 15mg/mL，体系PH8.3-PH8.5.
本发明还提供所述的保存液在保存肠道样本中微生物核酸完整性的应用。
本发明还提供了一种用于保存肠道样本中微生物的核酸完整性的方法，包括提供所述的保存液；并将所述保存液与肠道样本混合。
进一步的，肠道样本为液态时，样本体积范围为50-200μL，与2mL保存液混合均匀；肠道样本为固态时，样本重量范围为50-200mg，与2mL保存液混合均匀；肠道样本为采样拭子时，将拭子头部完全浸没于保存液中。
进一步的，保存液与肠道样本混合均匀或采样后常温保存。
本发明的肠道样本保存溶液，以抑制肠道样本中微生物继续繁殖生长、稳定菌群种类、破坏微生物结构释放及保存核酸为优。以含有有机醇的水溶性有机溶剂作为有效成分，通过将肠道样本与含有有机醇的水溶性有机溶剂混合，其中添加的盐酸胍及脲，能够使蛋白结构变性，起到破坏微生物结构及抑制酶活性的作用，加入的高浓度的有机醇，可以破坏蛋白质结构，保持核酸稳定性并能抑制酶活性，降低核酸降解的风险，加入的两种广谱抗生素，可以有效抑制微生物的继续生长繁殖。本发明的肠道样本保存溶液由于含有有机醇的水溶性有机溶剂，能够使蛋白质变性，破坏酶结构，使得样本中的各类蛋白酶、DNaes、RNase等的活性显著降低，从而抑制微生物的活性及核酸的降解。
本发明的保存液和保存方法抑制微生物继续繁殖生长并可以破坏微生物结构，释放其核酸，同时其中含有抑制核酸酶活性成分，避免核酸降解，提供了长期稳定保存核酸的缓冲体系，保存时间长，适用温度范围广。
附图说明
图1：肠道样本置于实施例1所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图2：肠道样本置于实施例2所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图3：肠道样本置于实施例3所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图4：肠道样本置于实施例4所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图5：肠道样本置于磷酸盐缓冲液中保存0-12个月后检测结果。
图6：肠道样本置于95％乙醇中保存0-12个月后检测结果。
图7：肠道样本置于实施例2所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图8：肠道样本置于实施例5所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图9：肠道样本置于实施例6所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图10：肠道样本置于实施例7所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图11：肠道样本置于实施例8所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
图12：肠道样本置于实施例9所述保存液中保存0-12个月后检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的技术方法、优势及目的更加清晰易懂，下面结合具体实施例及相关附图，对本发明进行详细的说明。此处描述的实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明用于保存肠道样本的保存液的配方主要包括以下组分：Tris-HCl、乙酸、乙酸钠、Triton X-100、盐酸胍、脲、乙二胺四乙酸二钠、乙醇、青霉素、硫酸链霉素和蛋白酶K，其中PH为6.5-8.5的Tris-HCl的终浓度为0.1-1mol/L、乙酸的终浓度为0.05-0.5mol/L、乙酸钠的终浓度为0.1-0.5mol/L、Triton X-100 的终浓度为1-10％、盐酸胍的终浓度为0.1-1mol/L、脲的终浓度为0.1-1mol/L、乙二胺四乙酸二钠的终浓度为1-10mmol/L、青霉素的终浓度为10-1000U/mL、硫酸链霉素的终浓度为0.01-1mg/mL、乙醇的终浓度为30％-70％和蛋白酶K的终浓度为1-20mg/mL，体系PH7.0-9.0。
下面提供本发明的四种具体实施方式，所述用于保存肠道样本的保存液的配方如表1所示：
表1：
配制方法(以实施例2中的所述肠道样本保存液为例)：往容器中依次加入 Tris-HCl、乙酸、乙酸钠、盐酸胍、脲、乙二胺四乙酸二钠、青霉素、硫酸链霉素、蛋白酶K，使其终浓度分别为0.3mol/L、0.1mol/L、0.33mol/L、0.67mol/L、 0.33mol/L、3.3mmol/L、100U/mL、0.1mg/ml和15mg/ml，加入无菌水搅拌溶解，待上述试剂成分完全溶解后，加入Triton X-100至终浓度为5％(V/V)，加热至完全溶解后加入乙醇至终浓度为50％(V/V)，后使用HCl调PH至8.3-8.5，使用无菌水定容。
应用一：表1中实施例1至实施例4的肠道样本保存液的保存效果测试。
取200mg新鲜的肠道样本分别置于2mL实施例1、2、3、4中所述保存液中，将含有样本的保存液放置于常温条件下保存，分别在保存0天、7天、一个月、三个月、六个月、九个月和十二个月后，利用杭州百迈生物股份有限公司的
粪便基因组DNA制备试剂盒提取肠道样本核酸，提取的核酸采用16S rDNA V3-V4区引物进行PCR扩增，扩增产物由第三方公司进行测序。
所用16S rDNA V3-V4区扩增引物为北京擎科生物科技有限公司杭州分公司合成的引物，序列为：
16S Amplicon PCR Forward Primer：
5'TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC WGCAG
16S Amplicon PCR Reverse Primer：
5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGG TATCTAATCC
PCR检测反应体系为：
| 组分 | 单人份用量(μL) |
| 2×Phanta Max Master Mix(Vazyme) | 12.5 |
| 16S V3-V4(F) | 1 |
| 16S V3-V4(R) | 1 |
| DNA | 10-100ng |
| NF Water | x |
| Total | 25 |
PCR检测程序为：
采用杭州百迈生物股份有限公司的
粪便基因组DNA制备试剂盒，提取肠道样本核酸的步骤为：
1.取200μL样本至2mL离心管，加入1μlLRNase A。
2.加入180μl Buffer G1和20μl Proteinase K，涡旋混匀，于70℃水浴10min。
3.加入420μl Buffer G2，涡旋混匀，置于4℃孵育10min。然后以最大转速(>13000xg)离心10min。
4.吸取步骤5中的离心上清并转移到制备管(置于2ml离心管(试剂盒内提供)中)，12,000×g离心1min，弃滤液。
5.将制备管置回离心管，加800l Wash 1C，12,000×g离心1min，弃滤液。
6.将制备管置回离心管，加800l Wash 2A，12,000×g离心1min，弃滤液。
7.将制备管置回离心管，加700l Wash 2A，12,000×g离心1min，弃滤液。
8.将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。
9.将制备管移入新的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加80-150lEluent A，室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱产物即为提取得到的肠道样本核酸。
PCR产物经过测序，鉴定各样本的微生物种类及丰度。
检测结果见图1-图4。
总结：如图1-图4所示，肠道样本保存在实施例1、2、3、4中所示的样本保存液中，在常温放置0天到12个月后分别进行核酸提取、PCR检测及测序分析，检测结果显示，肠道样本中的菌群种类及丰度变化均无明显波动，表明上述 4种实施例的样本保存液均有稳定保存肠道样本菌群核酸的功效。
应用二：比较了肠道样本保存在不同保存液中的效果
取200mg新鲜的肠道样本分别置于2mL的磷酸盐缓冲液、95％乙醇和实施例2中所述样本保存液中，将含有样本的保存液放置于常温条件下保存，分别在保存0天、7天、一个月、三个月、六个月、九个月和十二个月后，利用杭州百迈生物股份有限公司的
粪便基因组DNA制备试剂盒提取肠道样本核酸，提取的核酸采用16S rDNA V3-V4区引物进行PCR扩增，扩增产物由第三方公司进行测序。
所用16S rDNA V3-V4区扩增引物为北京擎科生物科技有限公司杭州分公司合成的引物，序列为：
16S Amplicon PCR Forward Primer：
5'TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC WGCAG
16S Amplicon PCR Reverse Primer：
5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGG TATCTAATCC
PCR检测反应体系、检测程序及肠道样本核酸提取步骤同应用一。PCR产物经过测序，鉴定各样本的微生物种类及丰度。
检测结果见图5-图7。
总结：如图5-图7所示，实施例2样本保存液能在常温条件下长期保存肠道样本中菌群种类及丰度，而在磷酸盐缓冲液和95％乙醇中，肠道样本中菌群种类及丰度均有不同程度的影响，表明磷酸盐缓冲液和95％乙醇不适合在常温条件下长期保存肠道样本。
应用三
按表2配制肠道样本保存用组合物。
表2：
以实施例5中所述肠道样本保存液为对照，实施例6、实施例7、实施例8 和实施例9中所述肠道样本保存液为测试组，检测上述四种样本保存液保存样本的效果。
取200mg新鲜的肠道样本分别置于实施例5、6、7、8、9中所述样本保存液中，将含有样本的保存液放置于常温条件下保存，分别在保存0天、7天、一个月、三个月、六个月、九个月和十二个月后，利用杭州百迈生物股份有限公司的
粪便基因组DNA制备试剂盒提取肠道样本核酸，提取的核酸采用 16S rDNA V3-V4区引物进行PCR扩增，扩增产物由第三方公司进行测序。
所用16S rDNA V3-V4区扩增引物为北京擎科生物科技有限公司杭州分公司合成的引物，序列为：
16S Amplicon PCR Forward Primer：
5'TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC WGCAG
16S Amplicon PCR Reverse Primer：
5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGG TATCTAATCC
PCR检测反应体系、检测程序及肠道样本核酸提取步骤同应用一。
PCR产物经过测序，鉴定各样本的微生物种类及丰度。
检测结果见图8-图12：
总结：如图8-图12的实验结果所示，肠道样本保存在实施例5中的样本保存液中，在常温放置0天、7天、一个月、三个月、六个月、九个月和十二个月后分别进行核酸提取并测序检测，检测结果菌种种类及丰度均没有明显变化，说明实施例5的肠道样本保存液保存效果较好。肠道样本保存在实施例6、实施例 7、实施例8和实施例9的样本保存液中，保存效果均明显不如实施例5所示的肠道样本保存用组合物，表明本发明所述的肠道样本保存液可以能起到长期保存肠道样本菌种种类及丰度的功效。
序列表
<110> 杭州百迈生物股份有限公司
<120> 一种肠道样本的保存液和肠道样本的保存方法
<130> 2021-1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
Claims (10)
1.一种肠道样本的保存液，包括缓冲剂、抗生素、有机醇，其特征在于，还包括变性剂，所述抗生素为至少两种抗生素，所述有机醇为高浓度有机醇。
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述变性剂包括盐酸胍和脲。
3.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，所述盐酸胍的浓度为0.1-1mol/L、所述脲的浓度为0.1-1mol/L。
4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述抗生素包括青霉素和硫酸链霉素。
5.根据权利要求4所述的保存液，其特征在于，所述青霉素的浓度为10-1000U/mL和硫酸链霉素的浓度0.01-1mg/mL。
6.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述有机醇为乙醇。
7.根据权利要求6所述的保存液，其特征在于，所述乙醇的浓度为30％-70％。
8.根据权利要求1至7之一所述的保存液，其特征在于，还包括去污剂、金属离子螯合剂和有机酸。
9.一种肠道样本的保存方法，其特征在于，提供权利要求1至8之一所述的保存液，并将所述保存液与肠道样本混合。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，肠道样本为液态时，以50-200μL肠道样本∶2mL保存液的比例用量进行混合均匀；肠道样本为固态时，以20-200mg肠道样本∶2mL保存液的比例用量进行混合均匀；肠道样本为采样拭子时，将拭子头部完全浸没于保存液中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202111644580.4A CN114431223A (zh) | 2021-12-29 | 2021-12-29 | 一种肠道样本的保存液和肠道样本的保存方法 |
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|---|---|
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-
2021
- 2021-12-29 CN CN202111644580.4A patent/CN114431223A/zh active Pending
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