CN109652367A

CN109652367A - 一种制备临床级脂肪干细胞的方法

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Publication number: CN109652367A
Application number: CN201910006406.3A
Authority: CN
Inventors: 姜丽君; 李超
Original assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: CN109652367B

Abstract

本发明涉及一种制备临床级脂肪干细胞的方法。具体地，本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法包括步骤：1)用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎并去除油脂；2)使步骤1)中获得的脂肪组织乳糜化；3)将步骤2)中获得的乳糜化的脂肪组织加入到含有酶混合物的a‑MEM培养基中消化，其中所述酶混合物包含I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I和胰蛋白酶；和4)离心步骤3)的消化液，弃上清，得到脂肪干细胞。

Description

一种制备临床级脂肪干细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术和生物治疗领域，特别涉及一种临床级脂肪干细胞制备方法。

背景技术

脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSC)是指从脂肪组织中分离出的具有自我更新及多向分化潜能的成体间充质干细胞。具有干细胞的一些共同特点，在体外适宜的诱导条件下具有自我更新、高增殖能力及具有向成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等分化潜能而受到广泛关注。ADSC细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。

ADSC是符合再生医学要求的干细胞，比其他干细胞更适合组织工程，可作为组织工程的种子细胞。各种组织特别是缺乏再生能力的组织，如软骨、肌肉、心肌、神经等的损伤修复一直是医学领域里的难题。已有大量的动物研究实验证实，ADSC对多种疾病具有治疗效果，例如骨骼和肌肉系统疾病、泌尿系统疾病、心血管系统疾病、慢性损伤、自身免疫性疾病等。截至2013年3月，在美国国立卫生院官方网站上已注册的ADSC临床试验项目有68项，包括骨缺损、脑卒中、克罗恩病、移植物抗宿主病、软组织缺损等疾病的治疗。

目前脂肪干细胞的分离方法多采用酶消化进行分离，但获取细胞数量不足，且活力较低，长期传代中常常发生老化，培养基中添加外源血清及因子等完全不符合临床应用要求，这些因素都大大增加了临床使用时风险。

有鉴于此，本发明提供了一种临床级脂肪干细胞的分离和制备方法。该方法得到的脂肪干细胞数量多、活力强、且所消耗的时间短。体外扩增后进行其表面标志、分化能力、活率等均符合临床回输要求。

发明内容

本发明涉及一种制备临床级脂肪干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎并去除油脂；

2)使步骤1)中获得的脂肪组织乳糜化；

3)将步骤2)中获得的乳糜化的脂肪组织加入到含有酶混合物的 a-MEM培养基中消化，其中所述酶混合物包含I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I和胰蛋白酶；和

4)离心步骤3)的消化液，弃上清，得到脂肪干细胞。

根据本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述方法进一步包括在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞。

优选地，根据本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞1至 10代；进一步优选地，在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞5代。

根据本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基包含Helios UltraGRO细胞营养添加物。

根据本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基进一步包含EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF 的因子组合。

优选地，根据本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基包含的EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF 的浓度分别为10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml和 10～20ng/ml；进一步优选地，根据本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF的浓度分别为 20ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、10ng/ml和10ng/ml。

优选地，根据权利要求本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在步骤2)中通过将剪碎的脂肪组织加入注射器中，并反复推注注射器使脂肪组织乳糜化，其中，优选地反复推注注射器1分钟至5 分钟，每分钟10-30次；更优选地，反复推注注射器3分钟，每分钟 30次。

优选地，根据权利要求本发明所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在步骤3)酶混合物中包含0.1mg/ml的I型胶原酶、0.05mg/ml 的脱氧核糖核酸酶I、0.1mg/ml的透明质酸酶和0.125％的胰蛋白酶。

附图说明

图1A至图1C是本发明实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5 代细胞的倒置显微镜图。其中，图1A表示4X；图1B表示10X；图 1C表示20X。

图2A至图2B-1、图2B-2和图2B-3是本发明实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5代细胞经细胞计数仪活率检测的报告。图2A显示该报告的图片信息；图2B-1、图2B-2和图2B-3分别表示直径分布图、FL1荧光强度分布图和FL2荧光强度分布图。

图3A至图3C是本发明实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5 代细胞分化能力的检测图片；其中，图3A表示成脂，油红染色；图 3B表示成骨，茜素红S染色；图3C表示成软骨，阿辛蓝染色。

图4是本发明实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5代的细胞流式表型鉴定结果。

图5显示脂肪干细胞培养方法的比对实验。其显示分别在 a-MEM+10％FBS、a-MEM+细胞营养添加物或a-MEM+细胞营养添加物+组合因子培养基中连续培养至P5代的细胞生长数量。

具体实施方式

结合以下具体实施方式和实施例进一步说明本发明，但是，在不偏离本发明主旨的情况下，本领域技术人员可以结合现有技术的公知常识对该具体实施方式进行改变，其均在本发明的范围内。

本发明提供了一种临床级脂肪干细胞的制备方法，步骤如下：

(1)双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎，去除杂质、油脂等物质；

(2)通过注射器反复推注乳糜化脂肪组织，缩短消化时间，提高干细胞数量及活力；

(3)采用用I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I、胰蛋白酶的混合酶对脂肪组织进行消化，过滤、洗涤，弃上清得到脂肪干细胞。

进一步地，本发明的方法还包括以下步骤：

(4)将脂肪干细胞接种于a-MEM培养基中进行培养，培养基中含有细胞营养添加物、EGF、bFGF、TGF、HGF、PDGF，不含外源血清等不符合临床级培养试剂。

作为一种优选的方案，步骤(1)中脂肪来源于美容吸脂液和手术脂肪块均可，吸脂液更加方便，6小时内进行脂肪干细胞提取；

更为优选的是，步骤(2)通过注射器反复推注乳糜化脂肪组织，30 次/min,推注3min；

更为优选的是，步骤(3)混合消化酶为0.1mg/ml的I型胶原酶、 0.05mg/ml的脱氧核糖核酸酶I、0.1mg/ml的透明质酸酶、0.125％的胰蛋白酶；

更为优选的是，步骤(4)培养基中加入细胞营养添加物，使用浓度为5％，不含外源血清等不符合临床级培养试剂

作为优选的是，步骤(4)中EGF、bFGF、TGF、HGF、PDGF的浓度分别为10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml和 10～20ng/ml；

更为优选的，EGF、bFGF、TGF、HGF、PDGF的浓度分别为20ng/ml、 20ng/ml、10ng/ml、10ng/ml和10ng/ml。

实施例1：脂肪干细胞的分离和制备

通过以下步骤分离和制备脂肪干细胞：

1)从美容吸脂液或手术的脂肪块获得脂肪组织，用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，其中，青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml，剪碎，去除油脂等杂质；

2)从步骤1)中获得的脂肪组织中取出30ml加入到50ml注射器中，通过反复推注注射器3分钟，每分钟30次，使脂肪组织乳糜化；其中，该反复推注注射器的持续时间为1分钟至5分钟，每分钟10-30次；时间过短，脂肪组织不能充分糜化，时间过长，干细胞受到损伤，回收效果不好；

通过此糜化步骤可以缩短消化时间，提高干细胞数量及活力；

3)将酶混合物加入步骤2)获得的乳糜化脂肪组织中，所述酶混合物包含a-MEM培养基中的0.1mg/ml的I型胶原酶、0.1mg/ml的透明质酸酶、0.05mg/ml的脱氧核糖核酸酶I和0.125％的胰蛋白酶，通过 0.22μm滤器过滤，然后含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤，以 2000rpm，离心5min，弃上清得到脂肪干细胞；

4)将步骤3)所得到的脂肪干细胞接种于不含血清的a-MEM培养基 (Gibco)中进行培养，培养基中含有细胞营养添加物(Helios UltraGRO)、 20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、10ng/ml TGF、10ng/ml HGF、和 10ng/mlPDGF。

实施例2：本发明制备的脂肪干细胞细菌、真菌、内毒素、支原体检测

显微镜观察通过实施例1的方法制备的脂肪干细胞的细胞生长状态，融合度80％-90％时进行传代培养，传代后留取样本进行细菌、真菌、内毒素、支原体检测。检测结果显示：经哥伦比亚血琼脂培养和沙保罗琼脂平板培养均无菌落生长，显示细菌、真菌为阴性；经DNA 荧光染色法通过Hoechst3325染色后无微粒状的支原体，显示支原体为阴性；经凝胶法检测内毒素为阴性；以上检测均源于药典检测方法，显示结果均为阴性符合生物治疗回输条件。

实施例3：本发明制备的脂肪干细胞活率检测

通过Rigel荧光细胞分析仪对实施例1的方法制备的脂肪干细胞的第五代细胞进行AO/PI双荧光计数，结果显示：细胞平均直径为：18.66um；平均圆度为：0.9；细胞活率为：97.8。详见以下表1和图2A至图2B-1、图2B-2和图2B-3。

表1：P5代细胞经细胞分析仪活率检测报告的结果信息：

总细胞浓度	1.79E+06/ml
		活细胞浓度	1.75E+06/ml
死细胞浓度	3.81E+04/ml
		总细胞个数	1222
活细胞个数	1196
		死细胞个数	26
平均直径	18.66μm
		平均圆度	0.9
结团率	9.2％
		细胞活率	97.89

实施例4：本发明制备的脂肪干细胞分化能力检测

对实施例1的方法制备的脂肪干细胞第5代进行成脂、成骨、成软骨诱导实验。检测结果显示，经该发明制备的脂肪干细胞，在成脂分化诱导实验中，经油红染色可见脂肪细胞何有明显的脂滴，详见图3 A；在成骨分化诱导实验中，经茜素红S染色可见有矿化钙盐沉积，茜素红S染色为红色，详见图3B；在成软骨分化诱导实验中，经阿辛蓝染色后细胞周边基质可被染色为蓝色，详见图3C；脂肪干细胞经三系分化均呈现良好的分化能力，说明该制备方法所获得的细胞仍维持着良好的干性。

实施例5：本发明制备的脂肪干细胞流式表型检测

通过流式细胞技术，对实施例1的方法制备的脂肪干细胞的第五代脂肪细胞群进行间充质标志物检测，检测显示，脂肪干细胞均一、稳定表达CD90、CD73、CD105、CD29、CD44,均大于95％；低表达 HLA-DR、CD45、CD34、CD45、CD19、CD14,均小于5％；结果显示符合脂肪间充质干细胞表型。

实施例6：本发明的脂肪干细胞分离方法与现有技术中的方法的对比

在本实施例中，发明人比较了采用糜化步骤和未糜化步骤、应用I 型胶原酶(A)或者I型胶原酶与胰蛋白酶混合(B)、以及应用本发明的混合酶(I型胶原酶+透明质酸酶+脱氧核糖核酸酶I+胰蛋白酶)(C)的对比实验显示，在消化酶浓度(0.1mg/ml的I型胶原酶)、消化时间相同条件下，在未乳糜化组30分钟内均未消化完全，其中混合酶(C)获得细胞数最多，活率相对较高；60分钟内均消化完全，获得细胞数差异不大，但活率均有所下降。在乳糜化组30分钟内，混合酶(C)获得细胞数最多，活率较高，消化完全，60分钟内均消化完全，获取细胞数有所提升，但活率下降明显。

该对比实验说明，采用糜化步骤，同时采用混合酶消化脂肪组织大大缩短了分离时间，提高了原代细胞提取量，减少了酶对细胞的损伤，提高了细胞活率，可以作为脂肪干细胞首选制备方法，具体数据见表2。

表2：各脂肪干细胞分离方法的对比

实施例7：本发明制备的脂肪干细胞培养方法筛选实验

本实施例对比了三种培养方法，包括a-MEM+10％FBS、a-MEM+ 细胞营养添加物、a-MEM+细胞营养添加物+组合因子，从而确定出最佳培养方法。方法：原代培养时接种相同数量的原代细胞，三种培养基培养，细胞融合90％时，消化、计数，每次传代时取1.0*10⁶接种于 T75培养瓶内继续培养，连续培养至P5代结束。结果显示， a-MEM+10％FBS培养时，原代P0获取细胞数量最低(1.5*10⁶/T75培养瓶)，增值缓慢，P3代时细胞状态成老化状态，P5后细胞凋亡状态不再增值；a-MEM+细胞营养添加物和a-MEM+细胞营养添加物+组合因子培养时，细胞呈明显纤维状生长，a-MEM+细胞营养添加物+组合因子原代获取细胞数量最多(3.5*10⁶/T75)，增值速度最快，细胞收获量明显高于其他两种培养方法，故本发明的培养体系更适合脂肪干细胞细胞的长期培养，具体数据见图5。

本发明方法的有益之处在于：本发明提供了一种临床级脂肪干细胞的制备方法，与传统技术相比，具有很多优势：1.脂肪组织经乳糜化后，缩短了消化时间，提高了细胞数量和活力；2.采用多种酶组合消化方案，既提高效率，也减少了对细胞的伤害；3.采用多因子配合细胞营养添加物的培养方案，细胞增殖速度快，培养周期短，避免使用动物血清存在的安全隐患，符合生物制品的制备原则；4.操作简单，易行，可重复性强。

Claims

1.一种制备临床级脂肪干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

2)使步骤1)中获得的脂肪组织乳糜化；

3)将步骤2)中获得的乳糜化的脂肪组织加入到含有酶混合物的a-MEM培养基中消化，其中所述酶混合物包含I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I和胰蛋白酶；和

4)离心步骤3)的消化液，弃上清，得到脂肪干细胞。

2.根据权利要求1所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述方法进一步包括在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞。

3.根据权利要求2所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞1至10代。

4.根据权利要求3所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞5代。

5.根据权利要求4所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基包含Helios UltraGRO细胞营养添加物。

6.根据权利要求5所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基进一步包含EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF的因子组合。

7.根据权利要求6所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基包含的EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF的浓度分别为10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml和10～20ng/ml。

8.根据权利要求7所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF的浓度分别为20ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、10ng/ml和10ng/ml。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在步骤2)中通过将剪碎的脂肪组织加入注射器中，并反复推注注射器使脂肪组织乳糜化，其中，优选地反复推注注射器1分钟至5分钟，每分钟10-30次；更优选地，反复推注注射器3分钟，每分钟30次。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在步骤3)酶混合物中包含0.1mg/ml的I型胶原酶、0.05mg/ml的脱氧核糖核酸酶I、0.1mg/ml的透明质酸酶和0.125％的胰蛋白酶。