CN104846016A - 人胚肾细胞hek293t电转染的方法 - Google Patents

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李强
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Abstract

本发明公开了一种人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，该法主要采用低渗透压的电转染缓冲液，对人胚肾细胞HEK293T进行一次放电，通过高压脉冲电场和低渗透压组合，使得细胞体积增大，秒冲电场更容易击穿细胞膜，增加膜穿孔数量，外源分子更容易进入细胞质中，从而提高电转效率。实际测试表明，应用本发明HEK293T细胞转染pmaxGFP(绿色荧光蛋白)细胞学实验结果转染效率达到60％左右。本发明可以缩短周期，降低成本，减少操作复杂性，为HEK293T细胞系转基因研究提供关键的技术支持。

Description

人胚肾细胞HEK293T电转染的方法
技术领域
本发明属于转基因技术领域，尤其涉及一种人胚肾细胞HEK293T电转染的方法。
背景技术
人胚肾细胞HEK293T是一个常用的研究表达外源基因的细胞株，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染。HEK293T细胞由293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，因其较高的转染效率而被广泛应用于瞬时转染，过表达各种目标蛋白,或是用以包装病毒。
HEK293T细胞常采用脂质体转染方法，操作周期通常为两天，但是，脂质体试剂本身颇为昂贵，且带有毒性，影响细胞的正常生长。病毒转染是另一种常用的HEK293T细胞的转染方法，其制备周期更长，通常为1-2个月，且价格不菲，因改造后病毒仍然具有侵染性，操作起来颇为繁琐。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简便、周期较短的人胚肾细胞HEK293T电转染的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，采用低渗透压的电转染缓冲液，对人胚肾细胞HEK293T进行一次放电；电转染缓冲液的渗透压为90～280mOsmol/kg，一次放电的电压为130～810V，持续时间为45～75μs(微秒)。
电转染缓冲液的渗透压为200～280mOsmol/kg。
一次放电的电压为100～200V或200～300V或300～400V或400～600V，持续时间为75μs。
电转染缓冲液的渗透压为250mOsmol/kg，一次放电的电压为130V或260V或390V或520V，持续时间为75μs。
电转染缓冲液由低渗透压溶液和等渗透压溶液配制而成；低渗透压溶液组成为KCl25mM、KH2PO40.3mM、KHPO 0.85mM、肌醇90mOsmol/kg，pH7.1～7.3,电导率，25度3.2～3.8mS/cm)；等渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH2PO4 0.3mM、K2HPO4 0.85mM、肌醇280mOsmol/kg，pH7.1～7.3，电导率，25度3.2～3.8mS/cm。
电转染是一种备受关注的转基因方法，其成本低廉，只需要普通缓冲盐溶液即可，周期短，通常只需一天，操作简便，不会对细胞产生强大的毒副作用。针对脂质体转染和病毒转染的周期长、成本高、操作繁琐的问题，发明人结合电转染的上述优点，建立了一种人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，该法主要采用低渗透压的电转染缓冲液，对人胚肾细胞HEK293T进行一次放电，通过高压脉冲电场和低渗透压组合，使得细胞体积增大，脉冲电场更容易击穿细胞膜，增加膜穿孔数量，外源分子更容易进入细胞质中，从而提高电转效率。实际测试表明，应用本发明HEK293T细胞转染pmaxGFP(绿色荧光蛋白)细胞学实验结果转染效率达到60％左右。本发明可以缩短周期，降低成本，减少操作复杂性，为HEK293T细胞系转基因研究提供关键的技术支持。
附图说明
图1是传统脂质体转染HEK293T细胞的荧光显微镜图。
图2是传统脂质体转染HEK293T细胞不加质粒的阴性对照的荧光显微镜图。
图3是本发明电转染(130V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。
图4是本发明电转染(260V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。
图5是本发明电转染(390V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。
图6是本发明电转染(520V)HEK293T细胞的荧光显微镜图。
图7是各种不同条件下转染进gfp的细胞占总细胞的比例的柱状图。
具体实施方式
采用脂质体转染和本发明电转染方法的转染率进行对比，同时设置不转质粒的组作为阴性对照。
一、人胚肾细胞HEK293T电转染的方法
试验方法：用人胚肾细胞HEK293T通过本发明电转染方法转染AMAXA公司的货号为VPA1001的pmaxGFP(绿色荧光蛋白)质粒，采用荧光显微镜拍照计算发绿色荧光数目的细胞以分析转染效率。试验中包括了对细胞实施四种不同电压，相同渗透压的缓冲液以及相同脉冲时长的放电时间。
试验设备：型号eppendorf multiporator，货号4308CG831520。
电转染方法：采用低渗透压的电转染缓冲液(250mOsmol/kg)，对人胚肾细胞HEK293T进行一次放电；电转染缓冲液的渗透压为250mOsmol/kg，一次放电的电压分别为130V、260V、390V、520V，持续时间为75μs。其中，低渗透压的电转染缓冲液采用的低渗透压溶液和等渗透压溶液混合配制成渗透压为250mOsmol/kg的电转缓冲液。低渗透压溶液(KCl，25mM；KH2PO4，0.3mM；KHPO 0.85mM；肌醇90mOsmol/kg，pH7.1～7.3,电导率，25度3.2～3.8mS/cm)，等渗透压溶液(KCl，25mM；KH2PO4，0.3mM；K2HPO4 0.85mM；肌醇280mOsmol/kg，pH7.1～7.3，电导率，25度3.2～3.8mS/cm)，低渗透压溶液取1.6ml，等渗透压溶液取8.4ml，混合均匀后便是250mOsmol/kg的电转缓冲液。
具体试验步骤如下：
指数时期收集细胞，以渗透压为250mOsmol/kg的低渗缓冲液稀释细胞，并加入质粒，要求细胞终密度为2x106cells/ml，质粒终浓度为20μg/ml；分装400μl至直径为2mm的电转杯后，施加电压；
第一次条件为：电压130V，渗透压250mOsmol/kg，持续时间75μs；
第二次条件为：电压260V，渗透压250mOsmol/kg，持续时间75μs；
第三次条件为：电压390V，渗透压250mOsmol/kg，持续时间75μs；
第四次条件为：电压520V，渗透压250mOsmol/kg，持续时间75μs。
二、人胚肾细胞HEK293T脂质体转染方法
将1μg的质粒和1μl的脂质体分别加入50μl的optin-DMEM培养基中，静置5min；混合均匀后静置20min，然后加入到孔板中；用optin-DMEM培养基补足剩余的培养基。
三、实验数据及结果
如图1至7所示，传统脂质体转染效率在60％左右，而采用本发明方法随着电压的增高，HEK293T细胞的转染效率呈梯度增高趋势，130V时达到4％左右，260V时达到10％左右，390V时达到40％左右，520V时达到65％左右，与脂质体转染效率接近。
通过对比数据可知，本发明通过高压脉冲电场和低渗透压组合的方式，在对细胞施加不同电压后，外源分子进入细胞质的数量呈递增趋势，在520V的条件下，HEK293T细胞转染pmax(绿色荧光蛋白)细胞学实验结果的转染效率和脂质体转染接近，达到60％左右，成本低廉、操作简便、周期较短，可为该细胞系转基因研究提供关键的技术支持。

Claims (5)

1.一种人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，其特征在于采用低渗透压的电转染缓冲液，对人胚肾细胞HEK293T进行一次放电；所述电转染缓冲液的渗透压为90～280mOsmol/kg，一次放电的电压为130～810V，持续时间为45～75μs。
2.根据权利要求1所述的人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，其特征在于：所述电转染缓冲液的渗透压为200～280mOsmol/kg。
3.根据权利要求2所述的人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，其特征在于：所述一次放电的电压为100～200V或200～300V或300～400V或400～600V，持续时间为75μs。
4.根据权利要求3所述的人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，其特征在于：所述电转染缓冲液的渗透压为250mOsmol/kg，一次放电的电压为130V或260V或390V或520V，持续时间为75μs。
5.根据权利要求4所述的人胚肾细胞HEK293T电转染的方法，其特征在于：所述电转染缓冲液由低渗透压溶液和等渗透压溶液配制而成；所述低渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH2PO4 0.3mM、KHPO 0.85mM、肌醇90mOsmol/kg，pH7.1～7.3,电导率，25度3.2～3.8mS/cm)；所述等渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH2PO4 0.3mM、K2HPO4 0.85mM、肌醇280mOsmol/kg，pH7.1～7.3，电导率，25度3.2～3.8mS/cm。
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