CN104862338A - 人肝癌细胞HepG2电转染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人肝癌细胞HepG2电转染的方法，该法主要采用等渗透压的电转染缓冲液，对人肝癌细胞HepG2进行一次放电，通过脉冲电场和脉冲磁场交替作用及与等渗透压组合，使细胞膜透性增加，膜强度减弱，使得外源分子更容易进入细胞质中，从而提高转染效率。实际测试表明，应用本发明HepG2细胞转染pmaxGFP(绿色荧光蛋白)细胞学实验转染效率达到45％左右。同时，本发明可以减少试剂购买及运输的过程，缩短实验操作时间，降低了研究成本，为人肝癌细胞HepG2后续研究提供了简便的细胞转染方式。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种人肝癌细胞HepG2电转染的方法。
背景技术
HepG2细胞即人肝肿瘤细胞株，该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。该细胞能大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，对人生长激素有刺激反应，多应用于遗传毒理学及病毒培养等方面的研究。
HepG2细胞常采用脂质体转染方法，操作周期一般为两天，但是，脂质体试剂需单独购买，价格昂贵，且带有毒性，会影响细胞的正常生长。病毒转染是HepG2细胞的另一种常用的转染方法，但其购买途径复杂，价格昂贵，操作繁琐，制备周期长，并且改造后的病毒仍然具有侵染性，对细胞影响较大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简便快捷、转染稳定且效率高的人肝癌细胞HepG2电转染的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：人肝癌细胞HepG2电转染的方法，采用等渗透压的电转染缓冲液，对人肝癌细胞HepG2进行一次放电；电转染缓冲液的渗透压为280mOsmol/kg，一次放电的电压为130～810V，持续时间为45～75μs(微秒)。
一次放电的电压为300～400V或400～600V或600～700V或700～800V。
一次放电的电压为390V或520V或650V或780V，持续时间为75μs。
电转染缓冲液为等渗透压溶液，等渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇280mOsmol/kg，pH7.1～7.3，电导率，25度3.2～3.8mS/cm。
电转染是一种较受欢迎的细胞转染方法，其只需要普通缓冲盐溶液，成本低廉，操作简便，通常只需一天，并且对细胞的毒副作用较小。针对脂质体转染和病毒转染操作复杂、周期长且毒性大等问题，发明人结合电转染的上述优点，建立了一种人肝癌细胞HepG2电转染的方法，该法主要采用等渗透压的电转染缓冲液，对人肝癌细胞HepG2进行一次放电，通过脉冲电场和脉冲磁场交替作用及与等渗透压组合，使细胞膜透性增加，膜强度减弱，使得外源分子更容易进入细胞质中，从而提高转染效率。实际测试表明，应用本发明HepG2细胞转染pmaxGFP(绿色荧光蛋白)细胞学实验转染效率达到45％左右。同时，本发明可以减少试剂购买及运输的过程，缩短实验操作时间，降低了研究成本，为人肝癌细胞HepG2后续研究提供了简便的细胞转染方式。
附图说明
图1是传统脂质体转染HepG2细胞的荧光显微镜图。
图2是传统脂质体转染HepG2细胞不加质粒的阴性对照的荧光显微镜图。
图3是本发明电转染(390V)HepG2细胞的荧光显微镜图。
图4是本发明电转染(520V)HepG2细胞的荧光显微镜图。
图5是本发明电转染(650V)HepG2细胞的荧光显微镜图。
图6是本发明电转染(780V)HepG2细胞的荧光显微镜图。
图7是各种不同条件下转染进gfp的细胞占总细胞的比例的柱状图。
具体实施方式
采用脂质体转染和本发明电转染方法的转染效率进行对比，同时设置不转染质粒的组作为阴性对照。
一、人肝癌细胞HepG2电转染的方法
试验方法：用人肝癌细胞HepG2通过本发明电转染方法转染AMAXA公司的货号为VPA1001的pmaxGFP(绿色荧光蛋白)质粒，采用荧光显微镜拍照计算发绿色荧光数目的细胞以分析转染效率。试验中包括了对细胞实施四种不同电压，相同渗透压的缓冲液以及相同脉冲时长的放电时间。
试验设备：型号eppendorf multiporator，货号4308CG831520。
电转染方法：采用等渗透压的电转染缓冲液，对人肝癌细胞HepG2进行一次放电；电转染缓冲液的渗透压为280mOsmol/kg，一次放电的电压分别为390V、520V、650V、780V，持续时间为75μs。等渗透压溶液配方为KCl，25mM；KH2PO4，0.3mM；K2HPO40.85mM；肌醇280mOsmol/kg，pH7.1～7.3，电导率，25度3.2～3.8mS/cm)。
具体试验步骤如下：
指数时期收集细胞，以渗透压为280mOsmol/kg的等渗缓冲液稀释细胞，并加入质粒，要求细胞终密度为2x106cells/ml，质粒终浓度为20μg/ml；分装400μl至直径为2mm的电转杯后，施加电压；
第一次条件为：电压390V，渗透压280mOsmol/kg，持续时间75μs；
第二次条件为：电压520V，渗透压280mOsmol/kg，持续时间75μs；
第三次条件为：电压650V，渗透压280mOsmol/kg，持续时间75μs；
第四次条件为：电压780V，渗透压280mOsmol/kg，持续时间75μs。
二、人肝癌细胞HepG2脂质体转染方法
将1μg的质粒和1μl的脂质体分别加入50μl的optin-DMEM培养基中，静置5min；混合均匀后静置20min，然后加入到孔板中；用400μl的optin-DMEM培养基补足剩余的培养基；6h后对细胞进行换液。
三、实验数据及结果
如图1至7所示，传统脂质体转染效率在8％左右，而采用本发明方法随着电压的增高，人肝癌细胞HepG2的转染效率呈梯度增高趋势，390V时达到6％左右，520V时达到23％左右，650V时达到32％左右，780V时达到45％左右。
通过对比数据可知，本发明通过高场强电脉冲和等渗透压组合的方式，对细胞施加不同电压后，外源分子进入细胞质的数量呈递增趋势，在390V的条件下，HepG2细胞转染pmax(绿色荧光蛋白)细胞学实验结果的转染效率和脂质体转染接近，400～800V转染效率都高于脂质体转染，并且该转染方法操作简便、节约成本、周期较短，可为以后以HepG2细胞为模型进行的细胞转染实验提供有效的方法。
Claims (4)
1.一种人肝癌细胞HepG2电转染的方法，其特征在于采用等渗透压的电转染缓冲液，对人肝癌细胞HepG2进行一次放电；所述电转染缓冲液的渗透压为280mOsmol/kg，一次放电的电压为130～810V，持续时间为45～75μs。
2.根据权利要求1所述的人肝癌细胞HepG2电转染的方法，其特征在于：所述一次放电的电压为300～400V或400～600V或600～700V或700～800V。
3.根据权利要求2所述的人肝癌细胞HepG2电转染的方法，其特征在于：所述一次放电的电压为390V或520V或650V或780V，持续时间为75μs。
4.根据权利要求3所述的人肝癌细胞HepG2电转染的方法，其特征在于：所述电转染缓冲液为等渗透压溶液，等渗透压溶液组成为KCl 25mM、KH2PO4 0.3mM、K2HPO4 0.85mM、肌醇280mOsmol/kg，pH7.1～7.3，电导率，25度3.2～3.8mS/cm。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 任建军: "不同方法HBx 基因表达质粒转染肝癌HepG2细胞的效果比较", 《中国普通外科杂志》 * |
| 董菊子: "电转染效率影响因素的探讨", 《生物技术通讯》 * |
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