CN111471713A - 基于可控相分离液滴控制细胞内mRNA定位和翻译过程的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于可控相分离液滴控制细胞内mRNA定位和翻译过程的方法。通过蛋白质相分离技术在细胞内构建蛋白质液滴，利用RNA适配子连接mRNA，可以将任意特定mRNA招募到蛋白质液滴中，通过光遗传学技术控制液滴聚集与解聚，实现对mRNA的招募与释放。当mRNA被包裹在液滴内，其翻译被抑制，而通过光照特定区域使液滴解聚，释放出mRNA，完成翻译过程，从而实现了在活细胞内对mRNA的翻译过程进行精确的时间和空间控制。本发明技术在研究基因表达的空间调控对组织发育中细胞迁移以及疾病的影响方面将有广泛应用。

Description

基于可控相分离液滴控制细胞内mRNA定位和翻译过程的方法

技术领域

本发明涉及一种对活细胞内mRNA翻译过程的精准时间和空间控制方法，属于分子生物学和细胞生物学领域。

背景技术

细胞内mRNA的非均匀性分布可以保证细胞内生命活动在不同的亚细胞区域内进行。控制细胞内mRNA定位和翻译过程是细胞广泛采用的一种在时间和空间上控制基因表达的机制。这种机制在高度极化的非对称细胞内尤其显著。控制细胞内mRNA的非对称定位，可以使mRNA的翻译产物——蛋白质分布于特殊的亚细胞区室内发挥局部功能。细胞内mRNA的非极性分布在细胞命运决定、细胞迁移、胚胎发育等过程中具有重要作用。例如，在出芽酵母中，转录抑制因子ASH1控制着酵母交配方式的类型转换。ASH1 mRNA可以被运送到分裂细胞的芽端。因此，它只被传递到子细胞的细胞核，确保母细胞和子细胞有不同的交配方式类型。又如，在果蝇中，bicoid、oskar和nanos等mRNA定位于卵母细胞的前、后极，有助于胚胎发育过程中极性的建立；在蛙类的卵母细胞中编码T-box转录因子VegT的mRNA定位于植物极，诱导内胚层和中胚层细胞在胚胎中的命运决定；在成纤维细胞中，β-actin mRNA非极性分布能够调控细胞的运动方向；在胶质细胞中，编码髓磷脂基本蛋白的信使mRNA(MBP)被输送到髓鞘形成的远端，并在远端进行翻译。

然而，目前在活细胞中对mRNA的亚细胞分布及其局部翻译过程的实时动态追踪以及精准的时间和空间控制还难以实现，而mRNA翻译过程的精确时空动态在决定细胞行为方面往往是至关重要的，在整个生命进程中具有重要意义。基于此，目前亟需开发一种能实现对活细胞内mRNA翻译过程的精准时间和空间控制的方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种控制细胞内的mRNA的定位和翻译过程的重要工具，以克服现在对于细胞内mRNA定位难以操纵的问题。本发明综合利用光遗传学和细胞内生物学相变的方法，可以在活细胞中控制任意mRNA的定位和翻译过程，进而研究该mRNA的不均匀分布对细胞生命活动的影响。

近年来，相分离(Phase separation)过程由于被发现在细胞生物行为中广泛存在而引起人们的关注。液-液相分离(liquid-liquid phase separation)描述的是单一相中不同成分间相互碰撞、融合形成液滴，从而使一些成分被包裹在液滴内，一些成分被阻隔在液滴外，最终平衡的过程，类似于水油相混不能互溶。相分离是产生凝聚体的一种途径，凝聚体具有隔间、过滤器、反应容器、反应工厂、力发生器、细胞信号调节器等功能，细胞内通过形成这种液-液相分离，可以形成独立的一个小环境。由于这个凝聚体是无膜的，它可以直接的与细胞质进行接触并快速高效的和周围进行物质交换，另一方面，由于这个凝聚体是相对独立的，在其中可以独立进行生物学反应。凝聚体可以将包裹在凝聚体内的生物分子隔离开来，避免环境干扰，并且在一个相对独立的空间内提高凝聚体内部生物分子相互作用的反应速率。因此，利用相分离形成凝聚体对目标分子进行包裹可以实现对生物分子在一个相对独立的空间的精准时间和空间的人工控制。因此本发明使用细胞内相分离形成液滴将mRNA分子包裹入其中，抑制其翻译过程。并结合光遗传学技术，在需要翻译的细胞亚结构中将该mRNA分子释放出来，进行局部翻译，使生成的蛋白只在局部发挥功能。

本发明利用相分离的技术原理，结合光遗传学技术，提出了一种基于控制蛋白质液滴解聚以实现对mRNA翻译的精准时间和空间控制的方法。由此，蛋白质相分离可能直接有助于细胞内空间隔室的建立和维持。由于光遗传控制可以精准的实施与移除，是实现精准的时间和空间控制非常理想的手段。因此，本发明利用光遗传学来控制凝聚体的状态，实现对mRNA翻译过程的精准空间控制。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于可控相分离液滴对细胞内mRNA的定位和翻译过程进行控制的方法，其特征在于，利用细胞内蛋白质的光控相分离过程形成凝聚体液滴，根据所靶向RNA序列的特征，将特异的mRNA分子招募到液滴中，在细胞的特定区域利用光照将液滴解散，从而在特定亚细胞部位将mRNA从液滴中释放出来进行翻译，实现对该mRNA的定位和翻译过程的控制。

本发明使用PixELLs光遗传学系统(Pix Evaporates from Liquid-likedroplets in Light)，其由PixD和PixE蛋白组成，其中PixD的氨基酸序列如序列表中SEQID No：1所示，PixE的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：3所示。PixD和PixE蛋白在无光刺激的环境下会形成PixD-PixE蛋白聚集体，由此，我们结合相分离的手段和PixELLs系统，将具有相分离能力的天然无结构区域(intrinsically disordered regions，IDRs)融合到PixD和PixE蛋白上，这样在无光刺激时，体系就会形成一个个凝聚体隔室(液滴)，将它们自己与细胞内浮动的物质区隔开来，这些凝聚体在一定程度上作为一种独立的结构存在于细胞的水、蛋白、核酸和其他分子的海洋中。当给予蓝光刺激时，PixELLs系统会解聚从而使整个凝聚体解聚，释放出里面的生物分子。因此，利用天然无结构区域IDRs结合PixELLs系统，将特异mRNA通过锚定蛋白富集到凝聚体中，这样在无光的环境下，mRNA会被包裹在体系形成的凝聚体隔室中，从而抑制了自身的翻译过程，当体系到达目标区域时，给予蓝光刺激，几秒钟内，凝聚体隔室会解聚，进而释放mRNA，mRNA随即完成翻译过程。这样本发明就在活细胞内基于光控液滴解聚实现对mRNA翻译的精准时间和空间控制，从而实现人工设计mRNA的极性分布。

上述基于可控相分离液滴对细胞内mRNA的定位和翻译过程进行控制的方法中，具有相分离能力的天然无结构区域IDRs可以使用细胞内天然存在的可以发生相分离的蛋白，也可以是人工合成的能发生相分离的蛋白。所述具有相分离能力的天然无结构区域例如FUS蛋白的N端区域(其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：5所示)、RNA聚合酶II的C端区域等。

为了在液滴内富集目标mRNA，利用RNA适配子连接mRNA，使所述mRNA含有特异性的靶向序列，该靶向序列可以结合特定的锚定蛋白，而所述锚定蛋白与PixD或PixE构成融合蛋白，参与凝聚体的形成，从而可以通过靶向序列和锚定蛋白的相互作用使该mRNA进入液滴中。具有这样的相互作用的靶向序列和锚定蛋白系统例如PP7噬菌体操纵子茎环序列和PP7噬菌体外壳蛋白(PP7 phage coat protein,PCP)即PP7-PCP系统，以及MS2噬菌体操纵子茎环序列和MS2噬菌体外壳蛋白(MS2 phage coat protein,MCP)即MS2-MCP系统。

进一步的，为了避免因少量核糖体被带入到液滴中造成液滴内的翻译过程不能被完全抑制，可以在液滴内富集抑制mRNA翻译过程的蛋白，例如抑制翻译起始的蛋白4EBP1，使液滴内的mRNA翻译过程完全受到抑制；也可以只利用液滴对细胞内翻译机器的屏蔽作用，抑制mRNA的翻译过程。

上述基于可控相分离液滴对细胞内mRNA的定位和翻译过程进行控制的方法，实现光控细胞内液滴的聚合和解散的步骤包括：

1)将具有相分离能力的天然无结构区域IDRs分别与光控蛋白模块PixD和PixE融合，构建融合蛋白IDR-PixD和IDR-PixE的表达载体，并转染进细胞内；

2)将锚定蛋白和光控蛋白模块PixD或PixE融合，构建锚定蛋白-PixD或锚定蛋白-PixE的融合蛋白表达载体，并转染进细胞内；

3)构建包含特异性靶向序列的目标mRNA的表达载体并转染进细胞内，其中所述特异性靶向序列可以和所述锚定蛋白发生相互作用，使目标mRNA结合所述锚定蛋白；

4)在无蓝光刺激的条件下(例如黑暗环境中)，IDR-PixD和IDR-PixE聚集在一起，同时聚集了锚定蛋白-PixD或锚定蛋白-PixE，细胞内形成凝聚体液滴，将包含特异性靶向序列的目标mRNA招募进液滴中，mRNA的翻译过程被抑制；

5)使用区域化的蓝光光斑照射细胞内特定区域，使该特定区域的液滴解聚，释放出所包裹的mRNA，并在释放位置进行翻译过程。

优选的，在步骤1)进一步将抑制翻译过程的蛋白与IDR-PixD或IDR-PixE融合，构建表达载体并转染进细胞内。

参见图1，截取FUS蛋白N端的一段天然无结构区域，此段序列可以自发相互作用，但是聚集程度较低，无法成液滴。在黑暗环境中，PixD和PixE蛋白会形成PixD-PixE蛋白聚集体，但是聚集程度也较低。当FUS的天然无结构区域分别与两个蛋白PixE和PixD融合时，黑暗环境中可以发生强烈聚集，形成液滴，液滴在细胞中呈均匀分布。利用tdPCP-PixE融合蛋白可以将带有PP7的mRNA招募进液滴中，此时进入液滴中的mRNA无法与核糖体翻译机器相互作用，无法进行翻译，翻译过程受到抑制。当需要在细胞的特定位置激活该mRNA的翻译过程时，只要使用区域化的光斑给细胞局部照射波长为488nm的蓝光，几秒钟，PixD-PixE蛋白聚集体会分解成PixD蛋白二聚体和PixE蛋白单体，液滴解开，释放出所包裹的mRNA，并在释放的位置进行翻译。

本发明的方法对于活细胞内mRNAs翻译过程的精准时间、空间控制具有如下优势：

1.从单个mRNA合成多个蛋白拷贝可能比运输单个蛋白更具有成本效益。

2.局部mRNA的空间限制性翻译增加了局部蛋白浓度。

3.新合成的蛋白质可能经过局部翻译后修饰，使其功能上不同于先前存在的蛋白质。

4.蛋白质复合体的成员可以逐个局部合成，以促进蛋白质复合体的形成。

5.翻译过程与动态环境刺激相结合时，用于翻译的mRNA的极性分布可能有助于快速和区域化的调控细胞功能。

附图说明

图1.本发明基于可控相分离液滴对细胞内mRNA的定位和翻译过程进行控制的方法示意图。

图2.本发明实施例中所用的几个质粒的图谱示意图，其中：A所示质粒系统仅利用液滴本身对核糖体翻译机器的抑制作用；B所示质粒系统还在液滴中添加了抑制翻译起始的蛋白4EBP1；其中FUSN-mCherry-PixE和FUSN-mCherry-PixD用于液滴的形成，GFP-tdPCP-PixE用于将FLAG-ECFP-PP7的mRNA招募到液滴中。

图3.实施例一将报告mRNA招募到液滴中可以抑制翻译的实验结果，A为利用液滴本身对核糖体翻译机器的抑制作用实验结果；B为在液滴中添加抑制翻译起始的蛋白4EBP1的实验结果。

图4.实施例二通过荧光成像揭示将报告mRNA招募到液滴中并通过光照将目标RNA释放的过程，其中A为目标RNA的结构示意图，目标mRNA表达CFP基因，并在3’端添加一段RNA适配子MS2和PP7，MS2用于观察该mRNA在细胞内的定位，而PP7用于招募该mRNA到液滴中；B为mRNA和液滴的荧光图像，在黑暗条件下，可以看到mRNA和液滴共定位，表明mRNA被招募到液滴中；在蓝光照射条件下可以观测到液滴解聚，mRNA分散到细胞质中的过程。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，但不作为本发明的限定。

实施例一：使用一种基于可控相分离液滴对细胞内mRNA的定位和翻译过程的控制方法对mRNA的翻译过程进行控制。以带有FLAG标签的CFP(青色荧光蛋白)的信使RNA为例进行说明：

(1)通过PCR从含有所需序列的模板质粒上扩增出相应的DNA片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的下述蛋白对应的DNA片段：FUSN，mCherry，PixE，PixD，FLAG，CFP，PP7，4EBP1，GFP，tdPCP等。其中，FUSN代表FUS蛋白的N端区域，是一段具有相分离能力的天然无结构区域IDR，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：5所示，其对应的DNA序列如SEQ ID No：6所示；mCherry、CFP、GFP分别为红色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白；PixE、PixD是PixELLs系统的光控蛋白模块；PixD的序列氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，对应的DNA序列如SEQ ID No：2所示；PixE的序列氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，对应的DNA序列如SEQ ID No：4所示；FLAG标签是由8个氨基酸残基组成的序列N-DYKDDDDK-C(SEQ ID No：13)；4EBP1为抑制翻译起始的蛋白；锚定蛋白tdPCP的氨基酸序列如SEQ ID No：7所示，对应的DNA序列如SEQ ID No：8所示；靶向序列PP7的DNA序列如SEQ ID No：9所示。

所使用的PCR扩增体系如下：

(2)通过分子克隆等步骤得到融合蛋白FUSN-mCherry-PixE、FUSN-mCherry-PixD、GFP-tdPCP-PixE、FLAG-ECFP-PP7和4EBP1-FUSN-mCherry-PixE的表达质粒，其中ECFP代表增强型CFP。

(3)将人宫颈癌细胞系HeLa S6使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在六孔板里，培养24小时。

(4)上述细胞使用6μL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体FUSN-mCherry-PixE、FUSN-mCherry-PixD、GFP-tdPCP-PixE和FLAG-ECFP-PP7表达质粒(如图2中A所示)，或者共转染4EBP1-FUSN-mCherry-PixE、FUSN-mCherry-PixD、GFP-tdPCP-PixE和FLAG-ECFP-PP7表达质粒(如图2中B所示)。转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。对照组放在黑暗环境中用锡箔纸包裹培养，而实验组使用低功率蓝光LED等周期性间隔照射。照射参数为每五分钟照射10秒。

(5)融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应无没有明显的细胞沉淀。

(6)对细胞裂解液中目标蛋白的含量使用免疫印迹进行定量。

实验结果如图3所示，以GAPDH蛋白的表达为内参，其中A利用液滴本身对核糖体翻译机器的抑制作用，比较使用光照和不用光照的细胞，通过western blot可以看到，将报告mRNA招募到液滴中可以抑制翻译过程，可以降低目标蛋白的表达量，但是不能完全控制目标蛋白不表达；B在液滴中添加抑制翻译起始的蛋白4EBP1，比较使用光照和不用光照的细胞，通过western blot可以看到，将报告mRNA招募到液滴中并在液滴中放入4EBP1，可以完全抑制目标mRNA翻译过程。

实施例二：使用荧光显微成像方法对一种基于可控相分离液滴对细胞内mRNA的定位和翻译过程的控制方法对mRNA的翻译过程进行可视化。以带有的CFP的信使RNA招募进液滴和光照释放为例进行说明：

(1)通过PCR从含有模板序列的质粒上扩增出相应的DNA片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的下述蛋白对应的DNA片段FUSN，mCherry，PixE，PixD，CFP，PP7，GFP，tdPCP，MS2，tdMCP等，其中MS2的DNA序列如SEQ ID No：10所示；tdMCP的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示，对应的DNA序列如SEQID No：12所示。

所使用的PCR扩增体系如下：

(2)通过分子克隆等步骤得到FUSN-mCherry-PixE，FUSN-mCherry-PixD，tdPCP-PixE，CFP-MS2-PP7和tdMCP-GFP等表达质粒。

(3)将人宫颈癌细胞系HeLa S6使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在成像专用玻璃底培养皿里，培养24小时。

(4)上述细胞使用6μL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg载体FUSN-mCherry-PixE、FUSN-mCherry-PixD、tdPCP-PixE、CFP-MS2-PP7、tdMCP-GFP表达质粒。转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。样品放在黑暗环境中用锡箔纸包裹培养。

(5)使用1×PBS清洗细胞三遍，最后清洗完成后换上不含酚红的培养基。

(6)使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞内的荧光亮度。选择表达量较为合适的细胞，采集信使RNA和液滴的荧光图像实验数据。然后使用488nm的激光照射细胞2分钟，再次采集信使RNA和液滴的荧光图像实验数据。实验结果见图4，可以看出，在黑暗条件下mRNA和液滴共定位，表明mRNA被招募到液滴中；在蓝光照射条件下可以观测到液滴解聚，mRNA分散到细胞质中的过程。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 基于可控相分离液滴控制细胞内mRNA的定位和翻译过程的方法

<130> WX2020-03-044

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<212> PRT

<213> Bacteriophage PP7

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115 120 125

Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu Thr Glu Ile Gln

130 135 140

Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val Gly Pro Leu Val

145 150 155 160

Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn Gly Ala Lys Thr

165 170 175

Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp Val Val Asp Ser

180 185 190

Gly Leu Pro Lys Val Arg Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr

195 200 205

Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu

210 215 220

Thr Lys Ser Leu Val Ala Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn

225 230 235 240

Leu Val Pro Leu Gly Arg

245

<210> 8

<211> 747

<212> DNA

<213> Bacteriophage PP7

<400> 8

ttggcttcca aaactatcgt tctgagcgta ggtgaagcga ccagaacgtt aactgaaatt 60

caatctacag cagacaggca aatatttgaa gagaaagtcg gtccattagt agggaggtta 120

agattgacag ctagcttaag acaaaatgga gctaaaactg catacagggt caatttaaaa 180

ttggatcaag cagatgtcgt tgatagcggt ctacctaagg ttagatacac gcaagtgtgg 240

tcacacgatg tcactattgt cgcgaattct accgaagcta gtagaaaatc attgtatgat 300

ttaacaaaat ccttggtggc tacctctcag gtggaagatc ttgttgtgaa tttagttcca 360

ttaggtaggg cggatccgct agcctccaaa accatcgttc tttcggtcgg cgaggctact 420

cgcactctga ctgagatcca gtccaccgca gaccgtcaga tcttcgaaga gaaggtcggg 480

cctctggtgg gtcggctgcg cctcacggct tcgctccgtc aaaacggagc caagaccgcg 540

tatcgcgtca acctaaaact ggatcaggcg gacgtcgttg attccggact tccgaaagtg 600

cgctacactc aggtatggtc gcacgacgtg acaatcgttg cgaatagcac cgaggcctcg 660

cgcaaatcgt tgtacgattt gaccaagtcc ctcgtcgcga cctcgcaggt cgaagatctt 720

gtcgtcaacc ttgtgccgct gggccgt 747

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Bacteriophage PP7

<400> 9

ggagcagacg atatggcgtc gctcc 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Bacteriophage MS2

<400> 10

aaacatgagg atcacccatg t 21

<210> 11

<211> 268

<212> PRT

<213> Bacteriophage MS2

<400> 11

Met Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro

1 5 10 15

Asp Tyr Ala Ile Glu Gly Arg His Met Leu Ala Val Lys Met Ala Ser

20 25 30

Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly Asp Val

35 40 45

Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile Ala Glu Trp Ile Ser

50 55 60

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val Arg Gln

65 70 75 80

Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val Pro Lys

85 90 95

Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe

100 105 110

Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu

115 120 125

Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly

130 135 140

Ile Tyr Ala Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn

145 150 155 160

Gly Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly

165 170 175

Ile Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val

180 185 190

Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile

195 200 205

Lys Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu

210 215 220

Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val

225 230 235 240

Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala

245 250 255

Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr Ala Asp Ser Arg

260 265

<210> 12

<211> 804

<212> DNA

<213> Bacteriophage MS2

<400> 12

atgggcccaa aaaagaaaag aaaagttggc tacccctacg acgtgcccga ctacgccatc 60

gaaggccgcc atatgctagc cgttaaaatg gcttctaact ttactcagtt cgttctcgtc 120

gacaatggcg gaactggcga cgtgactgtc gccccaagca acttcgctaa cgggatcgct 180

gaatggatca gctctaactc gcgttcacag gcttacaaag taacctgtag cgttcgtcag 240

agctctgcgc agaatcgcaa atacaccatc aaagtcgagg tgcctaaagg cgcctggcgt 300

tcgtacttaa atatggaact aaccattcca attttcgcca cgaattccga ctgcgagctt 360

attgttaagg caatgcaagg tctcctaaaa gatggaaacc cgattccctc agcaatcgca 420

gcaaactccg gcatctacgc catggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat 480

ggcggaactg gcgacgtgac tgtcgcccca agcaacttcg ctaacgggat cgctgaatgg 540

atcagctcta actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct 600

gcgcagaatc gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aaggcgcctg gcgttcgtac 660

ttaaatatgg aactaaccat tccaattttc gccacgaatt ccgactgcga gcttattgtt 720

aaggcaatgc aaggtctcct aaaagatgga aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac 780

tccggcatct acgcggattc taga 804

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

Claims (10)

1.一种对细胞内mRNA的定位和翻译过程进行控制的方法，其特征在于，在细胞内利用蛋白质的光控相分离过程形成凝聚体液滴，将特异的mRNA分子招募到液滴中抑制其翻译过程；对细胞的特定区域利用光照使液滴解散，从而在特定区域将mRNA从液滴中释放出来进行翻译，实现对该mRNA的定位和翻译过程的控制。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将具有相分离能力的天然无结构区域IDRs分别融合到PixELLs光遗传学系统的PixD和PixE蛋白上，获得可通过光控相分离过程形成凝聚体液滴的蛋白质。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PixD蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示，所述PixE蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：3所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述具有相分离能力的天然无结构区域IDRs是FUS蛋白的N端区域或RNA聚合酶II的C端区域。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述FUS蛋白的N端区域的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：5所示。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA含有特异性的靶向序列，该靶向序列可以结合特定的锚定蛋白，而所述锚定蛋白与PixD或PixE构成融合蛋白，参与凝聚体的形成。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述靶向序列为PP7噬菌体操纵子茎环序列，相应的锚定蛋白是PP7噬菌体外壳蛋白；或者，所述靶向序列为MS2噬菌体操纵子茎环序列，相应的锚定蛋白是MS2噬菌体外壳蛋白。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在液体中富集抑制mRNA翻译过程的蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过光控细胞内液滴的聚合和解散实现对目标mRNA的定位和翻译过程的控制，包括如下步骤：

1)将具有相分离能力的天然无结构区域IDRs分别与光控蛋白模块PixD和PixE融合，构建融合蛋白IDR-PixD和IDR-PixE的表达载体，并转染进细胞内；

2)将锚定蛋白和光控蛋白模块PixD或PixE融合，构建锚定蛋白-PixD或锚定蛋白-PixE的融合蛋白表达载体，并转染进细胞内；

3)构建包含特异性靶向序列的目标mRNA的表达载体并转染进细胞内，其中所述特异性靶向序列可以和所述锚定蛋白发生相互作用，使目标mRNA结合所述锚定蛋白；

4)在无蓝光刺激的条件下，IDR-PixD和IDR-PixE聚集在一起，同时聚集了锚定蛋白-PixD或锚定蛋白-PixE，细胞内形成凝聚体液滴，将包含特异性靶向序列的目标mRNA招募进液滴中，mRNA的翻译过程被抑制；

5)使用区域化的蓝光光斑照射细胞内特定区域，使该特定区域的液滴解聚，释放出所包裹的mRNA，并在释放位置进行翻译过程。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤1)将抑制翻译过程的蛋白与IDR-PixD或IDR-PixE融合，构建表达载体并转染进细胞内。

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