CN113337541A - 一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法 - Google Patents
一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法，利用相分离技术原理设计模块化组合的转录因子，根据所靶基因序列的特征，通过CRISPR/dCas9技术使转录因子结合在靶基因启动子区域，借助模块化组合的转录因子中的IDR相分离过程形成凝聚体液滴，增强调节转录因子与转录复合物间的相互作用。通过筛选比较不同的IDR来优化凝聚体的状态，实现对活细胞内源基因转录的高效精准控制。本发明方法将在内源基因表达调控、诱导多能干细胞发育以及全基因组测序等方面有重要应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的对活细胞内源基因转录过程的精准高效调控方法，属于分子生物学和细胞生物学领域。
背景技术
在生物体的发育过程中，特定的基因在不同的细胞中表达、行使不同的功能以建立不同类型的细胞。这需要对基因表达进行复杂的调控，而基因表达的调控在很大程度上依赖于基因转录成mRNA的过程。哺乳动物细胞的转录调控是迄今发现的最复杂的调控系统之一，对基因的选择性表达和细胞分化等过程起到主要控制作用。在过去的几十年中，生物学家从分子和细胞生物学领域研究阐明了转录过程以及参与转录过程的一些转录复合物，并阐明了有关如何调控这些转录复合物进而调控转录的机制。转录调控过程包括转录起始控制、转录延伸控制、转录终止控制等。转录调控极为复杂，涉及上百种蛋白参与协同控制。在这些转录调控复合物中，转录因子在转录起始中调控基因的特异性表达。转录因子能够结合在特定基因上游启动子区域，并招募RNA聚合酶等一系列转录调控复合物，驱动转录进程。因此，转录因子在转录、细胞周期、响应细胞间信号传递、对环境压力的响应以及发育等方面都有着重要的调控作用。在细胞的重编程中，需要特异性的启动某些基因的表达。当我们人为干预基因的表达过程，就能够逆转细胞命运，控制细胞的生命活动过程。对于内源基因的表达过程进行操纵，需要利用特异性增强或抑制某些基因的表达。基于此，目前亟需开发一种能实现在活细胞内基于转录因子实现对内源基因转录过程的精准高效调控的方法。现在使用最为广泛的是利用CRISPR/dCas9系统对基因的表达过程进行干预，使用内切酶结构域失活的dCas9融合上转录抑制蛋白(KRAB等)或者转录激活蛋白(VP16或VPR等)，利用特异性的sgRNA导向，将dCas9-效应蛋白导向到特异的基因位置，实现基因特异性的表达调控。这些技术操作简易，起效迅速，被统称为CRISPRa或CRISPRi。但是现有的转录激活蛋白或者抑制蛋白的激活或抑制效应不高，对某些基因的转录激活和抑制作用不明显，限制了其在细胞生物学中的广泛的应用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种控制细胞内源基因转录过程的一种重要工具，以克服现在对于细胞内基因转录调控效率低的问题。本发明综合利用分子生物学和细胞内生物学相变的方法，可以在活细胞中高效控制任意基因的转录过程，进而研究该基因表达改变对细胞生命活动的影响。
转录因子是一类高度模块化的蛋白，各功能区域的排列顺序和数目取决于转录因子本身。而在这些功能区域中，最重要的就是DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和转录激活结构域(Transactivation domain,TAD)。DNA结合域具有有序的结构，是与靶基因上游启动子或增强子序列结合的区域，是转录因子中最重要的领域。转录激活结构域通常都包含天然的无序结构(Intrinsically Disordered Region,IDR)，是和其他转录复合物(比如RNA聚合酶，转录调节因子等)结合的区域，是确保转录完成的重要结构域。
近年来，相分离(Phase separation)过程由于被发现在细胞生物行为中广泛存在而引起人们的关注。液-液相分离(liquid-liquid phase separation)描述的是单一相中不同成分间相互碰撞、融合形成液滴，从而使一些成分被包裹在液滴内，一些成分被阻隔在液滴外，最终平衡的过程，类似于水油相混不能互溶。相分离是产生凝聚体的一种途径，凝聚体具有隔间、过滤器、反应容器、反应工厂、力发生器、细胞信号调节器等功能，细胞内通过形成这种液-液相分离，可以形成独立的一个小环境。由于这个凝聚体是无膜的，它可以直接的与细胞质进行接触并快速高效的和周围进行物质交换，另一方面，由于这个凝聚体是相对独立的，在其中可以独立进行生物学反应。凝聚体可以将包裹在凝聚体内的生物分子隔离开来，避免环境干扰，并且在一个相对独立的空间内提高凝聚体内部生物分子相互作用的反应速率。而相分离发生的驱动力是多价相互作用，比如蛋白质与蛋白质之间的多价相互作用，或者蛋白质与核酸分子之间的相互作用，以及蛋白质的无结构区域(IDR)介导的蛋白质自身相互作用等。近些年研究者研究发现，在转录过程中，有众多转录复合物通过相分离这个机制来调控转录。RNA聚合酶Ⅱ的C端(RNA Pol II CTD)具有七个氨基酸重复单元Y1S2P3T4S5P6S7是一个很长的IDR。RNA Pol II CTD中的IDR可以介导不同的RNA Pol II分子之间弱相互作用，发生相分离形成凝聚体，进而驱动转录工厂的形成。除此之外，众多转录因子的转录激活结构域(TAD)也大多具有较长的IDR，亦可以通过IDR间的相互作用驱动相分离的发生，促进转录因子与转录复合物间的相互作用，形成凝聚体进而促进转录。
本发明利用相分离的技术原理，提出了一种基于可控相分离液滴和CRISPR/dCas9技术(Liquid Liquid Phase Separated CRISPRa,LLPS-CRISRPa)对细胞内源基因转录过程的高效控制方法。由此，蛋白质相分离能直接有助于细胞内转录凝聚体建立和维持。由于转录因子结构的高度模块化，可以对各功能区域进行特定排列与替换，从而筛选出最高效的转录因子组合，是实现活细胞内高效转录调控非常理想的手段。因此，本发明通过筛选比较不同的IDR来优化凝聚体的状态，实现对活细胞内源基因转录的高效精准控制。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法，其特征在于，根据所靶向基因序列的特征，借助CRISPR/dCas9技术使转录因子结合在靶基因启动子区域，并设计模块化组合的转录因子，筛选出效率最高的IDR，利用转录激活结构域的IDR相分离过程，增强调节转录因子与转录复合物间的相互作用，对该基因的转录过程进行精准而高效的控制。
使用CRISPR/dCas9技术，由介导RNA(sgRNA)和核酸酶失活型Cas9(dCas9)组成，sgRNA可识别目标序列，并募集dCas9，在sgRNA的指引下，dCas9可以作为DNA锚定平台，将不同效应蛋白递送并作用于基因组特定区域。由此，在本发明的实施例中，结合相分离手段和CRISPR/dCas9技术，将10种具有相分离能力的IDR融合到dCas9-VPR上。这样基于目标基因序列，设计特异性的sgRNA，连同dCas9-VPR-IDR转染至细胞中，在转录激活因子VPR的作用下驱动目标基因的转录，同时，借助IDR间多价相互作用发生相分离形成凝聚物，进一步的增强其与转录复合物间的相互作用，从而提高转录水平。继而筛选出10种IDR中转录激活最高效的一个，从而实现精准高效的活细胞内源基因的转录激活。
本发明基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录的控制方法，联合相分离与CRISPR/dCas9技术，参见图1，在细胞内表达模块化组合的转录因子dCas9-VPR-IDR，同时表达识别靶基因目标序列的sgRNA，在sgRNA的介导下使转录激活因子VPR和蛋白无结构区域IDR锚定到靶基因的启动子区域，并借助IDR间多价相互作用发生相分离形成凝聚体液滴，招募更多的转录机器至靶基因启动子区域，高效促进靶基因的转录。
具体的，本发明联合相分离与CRISPR/dCas9技术实现细胞内源基因的高效转录激活方法通过以下步骤实现：
1)利用分子克隆的办法，将具有相分离能力的蛋白无结构区域IDR与dCas9-VPR融合蛋白相融合，构建dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体；
2)根据实验目的需要，设计与靶基因相匹配的sgRNA，并构建该sgRNA的表达载体；
3)将步骤1)和2)构建的表达载体一同转染进细胞；
4)筛选出转染成功的细胞；
5)利用sgRNA的指引，dCas9作为DNA锚定平台，将转录激活因子VPR与蛋白无结构区域IDR锚定到靶基因的启动子区域；
6)利用IDR间多价相互作用，提高靶基因启动子区域dCas9-VPR-IDR的浓度，并在达到一定浓度后能自发在细胞内形成凝聚体液滴；
7)利用液滴的形成招募更多的转录机器至靶基因启动子区域中，高效促进靶基因的转录过程。
在步骤1)中，先使dCas9融合上转录激活因子VPR，再融合上蛋白无结构区域IDR，形成dCas9-VPR-IDR融合蛋白。
在本发明的实施例中，所述IDR的氨基酸序列选自序列表中SEQ ID No：1～10中的一种。
上述步骤1)构建的dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体中，dCas9-VPR-IDR融合蛋白基因的启动子可以是组成型启动子，例如SFFV启动子、CMV启动子、SV40启动子等，也可以是诱导型启动子，例如四环素操纵子调控系统Tet-On/Tet-Off。
上述步骤2)构建的sgRNA的表达载体中，优选采用组成型启动子，如SFFV启动子。
上述步骤3)优选采用脂质体转染的方法，在本发明的实施例中，所用脂质体为Lipo-2000。
在本发明的实施例中，为便于直观显示，选择荧光蛋白基因作为靶基因，在步骤7)通过流式细胞荧光分选技术(FACS)分析靶基因的表达情况。
本发明利用相分离的技术原理，发明了一种基于可控相分离液滴和CRISPR/dCas9技术对细胞内源基因转录过程的高效控制方法，使得蛋白质相分离直接有助于细胞内转录凝聚体建立和维持。由于转录因子结构的高度模块化，可以对各功能区域进行特定排列与替换，从而筛选出最高效的转录因子组合，是实现活细胞内高效转录调控非常理想的手段。因此，本发明通过筛选比较不同的IDR来优化凝聚体的状态，实现对活细胞内源基因转录的高效精准控制。该方法将在内源基因表达调控、诱导多能干细胞发育以及全基因组测序等方面有重要应用。具体的，本发明对于活细胞内源基因转录过程的精准高效控制研究具有如下优势：
1.对活细胞内源基因转录过程的精准高效控制要比直接编辑内源基因更具有成本效益。
2.相比较于传统的CRISPRa，IDR的融合在一定程度上突破了PAM序列结合靶序列的数量的限制，可以使用一条sgRNA实现更多的转录激活蛋白招募。
3.dCas9-VPR-IDR的融合极大地提高了转录激活的效率。
4.转录过程与动态环境刺激相结合时，特定基因的转录调控可能有助于快速的调控细胞功能。
5.人为干预基因的表达过程，就可能在一定程度上控制细胞的生命活动过程，甚至逆转细胞命运。
6.通过实验验证，dCas-VPR-Q23具有最强的转录增强效应。
附图说明
图1.本发明基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程高效控制的方法示意图，其中：
CRISPRa所示在sgRNA的介导下，dCas9锚定转录激活因子VPR至靶基因上游启动子区域，招募转录机器，驱动转录；LLPS-CRISPRa系统为dCas9-VPR上融合蛋白无结构区域IDR，以实现利用IDR间多价相互作用，提高靶基因启动子区域dCas9-VPR-IDR的浓度自发在细胞内形成液滴，利用液滴的形成招募更多的转录机器至靶基因启动子区域中，从而高效地促进靶基因的转录过程。
图2.本发明实施例中所用的10种质粒的图谱示意图，其中所示质粒系统为LLPS-CRISPRa，在dCas9-VPR上融合10种不同的蛋白无结构区域IDR，从而筛选出转录激活效率最高的IDR。
图3.本发明实施例的质粒系统LLPS-CRISPRa高效促进细胞报告基因转录实验结果图，其中上图显示了促进报告基因EGFP转录的原理，下图显示了实验测得的荧光数据。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，但不作为本发明的限定。
实施例：基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程进行高效控制，以靶向细胞内的TetO-EGFP为例进行说明：
(1)通过PCR从含有所需序列的模板质粒上扩增出相应的DNA片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的下述蛋白对应的DNA片段：TetO,EGFP,sgRNA,dCas9,VPR,BRD4,EWR,FUSN,RGG,TAFN,HalTag3,HalTag3-RGG,Q23,Q74,TDP43等。其中，TetO是四环素操纵子；EGFP代表增强型绿色荧光蛋白；sgRNA是靶向序列，将dCas9失活性内切核酸酶募集到合适的靶序列；dCas9是失活性内切核酸酶，可以在sgRNA的介导下锚定到指定的核酸序列上；VPR是转录激活蛋白；BRD4,EWR,FUSN,RGG,TAFN,HalTag3,HalTag3-RGG,Q23,Q74,TDP43代表10种蛋白无序区域，是一段具有相分离能力的天然无结构区域IDR。BRD4,EWR,FUSN,RGG,TAFN,HalTag3,HalTag3-RGG,Q23,Q74,TDP43的氨基酸序列依次如序列表中SEQ ID No：1～10所示。
所使用的PCR扩增体系如下：
(2)通过分子克隆等步骤得到sgRNA和融合蛋白的表达质粒：pBS-CMV-TetO-EGFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-BRD4-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-EWR-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-FUSN-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-RGG-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-TAFN-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-HalTag3-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-HalTag3-RGG-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-Q23-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-Q74-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-TDP43-P2A-BFP。
(3)将人宫颈癌细胞系HeLa S6使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在六孔板里，培养24小时。
(4)为直观展示对内源基因的调控，构建6XTetO-EGFP稳定细胞系。将1μg的pBS-CMV-TetO-EGFP利用6μL的脂质体Lipo-2000和Pbase质粒一起转染至HeLa细胞中，转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。消化细胞并计数。通过流式细胞荧光分选技术(FACS)，分选出转染成功的细胞，并将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，进行单克隆培养。待细胞贴壁后，再次进行分选，筛选出稳定表达TetO-EGFP的稳定细胞系。
(5)上述细胞使用6μL的脂质体Lipo-2000共转染各1μg的pHRm-SV40-dCas9-VPR-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-BRD4-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-EWR-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-FUSN-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-RGG-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-TAFN-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-HalTag3-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-HalTag3-RGG-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-Q23-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-Q74-P2A-BFP、pHRm-SV40-dCas9-VPR-TDP43-P2A-BFP表达质粒中的一种和pHR-SFFV-sgRNA表达载体，转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。
(6)通过流式细胞荧光分选技术(FACS)，通过P2A或者BFP的信号分选出转染成功的细胞；
(7)通过流式细胞荧光分选技术(FACS)，分析靶向基因EGFP的表达情况；
(8)统计计算比较各实验组的效率。
实验结果如图3所示，以dCas9-VPR促进靶向基因EGFP的表达为内参，比较融合了不同IDR序列的实验组对靶向基因EGFP表达的促进程度。通过统计结果可以看到，将IDR融合到dCas9-VPR后会不同程度的促进靶向基因的表达，其中dCas9-VPR-Q23具有最强的转录增强效应。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法
<130> WX2021-03-110
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Gly Tyr Ser Ala Tyr Thr Ala Gln Pro Thr Gln Gly Tyr Ala Gln Thr
20 25 30
Thr Gln Ala Tyr Gly Gln Gln Ser Tyr Gly Thr Tyr Gly Gln Pro Thr
35 40 45
Asp Val Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Thr Thr Ala Thr Tyr Gly Gln Thr
50 55 60
Ala Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Gln Pro Pro Thr Gly Tyr Thr Thr Pro
65 70 75 80
Thr Ala Pro Gln Ala Tyr Ser Gln Pro Val Gln Gly Tyr Gly Thr Gly
85 90 95
Ala Tyr Asp Thr Thr Thr Ala Thr Val Thr Thr Thr Gln Ala Ser Tyr
100 105 110
Ala Ala Gln Ser Ala Tyr Gly Thr Gln Pro Ala Tyr Pro Ala Tyr Gly
115 120 125
Gln Gln Pro Ala Ala Thr Ala Pro Thr Arg Pro Gln Asp Gly Asn Lys
130 135 140
Pro Thr Glu Thr Ser Gln Pro Gln Ser Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Gln
145 150 155 160
Pro Ser Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Asn Tyr Ser Tyr Pro Gln Val Pro
165 170 175
Gly Ser Tyr Pro Met Gln Pro Val Thr Ala Pro Pro Ser Tyr Pro Pro
180 185 190
Thr Ser Tyr Ser Ser Thr Gln Pro Thr Ser Tyr Asp Gln Ser Ser Tyr
195 200 205
Ser Gln Gln Asn Thr Tyr Gly Gln Pro Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Ser
210 215 220
Ser Tyr Gly Gln Gln Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Pro Pro Thr Ser Tyr
225 230 235 240
Pro Pro Gln Thr Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gln Tyr Ser Gln
245 250 255
Gln Ser Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Asn Pro Ser Tyr Asp Ser Val Arg
260 265 270
Arg Gly Ala Trp Gly Asn Asn Met Asn Ser Gly Leu Asn Lys Ser Pro
275 280 285
Pro Leu Gly Gly Ala Gln Thr Ile Ser Lys Asn Thr Glu Gln Arg Pro
290 295 300
Gln Pro Asp Pro Tyr Gln Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ser Arg Leu Ala
305 310 315 320
Asn Pro Gly Ser Gly Gln Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu Leu
325 330 335
Leu Ser Asp Ser Ala Asn Ala Ser Cys Ile Thr Trp Glu Gly Thr Asn
340 345 350
Gly Glu Phe Lys Met Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala Arg Arg Trp Gly
355 360 365
Glu Arg Lys Ser Lys Pro Asn Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ala
370 375 380
Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asn Ile Met Thr Lys Val His Gly Lys
385 390 395 400
Arg Tyr Ala Tyr Lys Phe Asp Phe His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Gln
405 410 415
Pro His Pro Thr Glu Ser Ser Met Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp Ile Ser
420 425 430
Tyr Met Pro Ser Tyr His Ala His Gln Gln Lys Val Asn Phe Val Pro
435 440 445
Pro His Pro Ser Ser Met Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe Gly Ala
450 455 460
Ala Ser Gln Tyr Trp Thr Ser Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Pro
465 470 475 480
Asn Val Pro Arg His Pro Asn Thr His Val Pro Ser His Leu Gly Ser
485 490 495
Tyr Tyr
<210> 3
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gln Gln Ala Thr Gln Ser Tyr Gly Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Thr Gln Pro Gly Gln Gly Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Gln Pro Tyr
20 25 30
Gly Gln Gln Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Thr Asp Thr Ser Gly
35 40 45
Tyr Gly Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Tyr Gly Gln Ser Gln Asn Thr Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Gln Ser Thr Pro Gln Gly Tyr Gly Ser Thr Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Gly Ser Ser Gln Ser Ser Gln Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Ser Ser Tyr
85 90 95
Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Pro Ala Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ser Tyr
100 105 110
Gly Ser Ser Ser Gln Ser Ser Ser Tyr Gly Gln Pro Gln Ser Gly Ser
115 120 125
Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Tyr Gly Gly Gln Gln Gln Ser Tyr Gly Gln
130 135 140
Gln Gln Ser Tyr Asn Pro Pro Gln Gly Tyr Gly Gln Gln Asn Gln Tyr
145 150 155 160
Asn Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Tyr
165 170 175
Gly Gln Asp Gln Ser Ser Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Tyr Gly Asn Gln Asp Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly
195 200 205
Gln Gln Asp Arg Gly Gly Gly Gly
210 215
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 4
Pro Arg Met Glu Ser Asn Gln Ser Asn Asn Gly Gly Ser Gly Asn Ala
1 5 10 15
Ala Leu Asn Arg Gly Gly Arg Tyr Val Pro Pro His Leu Arg Gly Gly
20 25 30
Asp Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala Gly Gly Asp Asp Arg Arg
35 40 45
Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Gly Gly Asn Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Asp Arg Gly Tyr Asn Asp Asn Arg Asp
65 70 75 80
Asp Arg Asp Asn Arg Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Asn
85 90 95
Tyr Glu Asp Arg Gly Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg
100 105 110
<210> 5
<211> 210
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ser Asp Ser Gly Ser Tyr Gly Gln Ser Gly Gly Glu Gln Gln Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Thr Tyr Gly Asn Pro Gly Ser Gln Gly Tyr Gly Gln Ala Ser Gln
20 25 30
Ser Tyr Ser Gly Tyr Gly Gln Thr Thr Asp Ser Ser Tyr Gly Gln Asn
35 40 45
Tyr Ser Gly Tyr Ser Ser Tyr Gly Gln Ser Gln Ser Gly Tyr Ser Gln
50 55 60
Ser Tyr Gly Gly Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ser Ser Tyr Ser Gln Gln
65 70 75 80
Pro Tyr Asn Asn Gln Gly Gln Gln Gln Asn Met Glu Ser Ser Gly Ser
85 90 95
Gln Gly Gly Arg Ala Pro Ser Tyr Asp Gln Pro Asp Tyr Gly Gln Gln
100 105 110
Asp Ser Tyr Asp Gln Gln Ser Gly Tyr Asp Gln His Gln Gly Ser Tyr
115 120 125
Asp Glu Gln Ser Asn Tyr Asp Gln Gln His Asp Ser Tyr Ser Gln Asn
130 135 140
Gln Gln Ser Tyr His Ser Gln Arg Glu Asn Tyr Ser His His Thr Gln
145 150 155 160
Asp Asp Arg Arg Asp Val Ser Arg Tyr Gly Glu Asp Asn Arg Gly Tyr
165 170 175
Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Tyr Asp Lys Asp
180 185 190
Gly Arg Gly Pro Met Thr Gly Ser Ser Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe
195 200 205
Lys Asn
210
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Glu Ile Ala Lys Ser Leu Lys Glu Ile Ala Lys Ser Leu Lys Glu
1 5 10 15
Ile Ala Trp Ser Leu Lys Glu Ile Ala Lys Ser Leu Lys Gly
20 25 30
<210> 7
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Glu Ile Ala Lys Ser Leu Lys Glu Ile Ala Lys Ser Leu Lys Glu
1 5 10 15
Ile Ala Trp Ser Leu Lys Glu Ile Ala Lys Ser Leu Lys Gly Pro Arg
20 25 30
Met Glu Ser Asn Gln Ser Asn Asn Gly Gly Ser Gly Asn Ala Ala Leu
35 40 45
Asn Arg Gly Gly Arg Tyr Val Pro Pro His Leu Arg Gly Gly Asp Gly
50 55 60
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala Gly Gly Asp Asp Arg Arg Gly Gly
65 70 75 80
Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Gly Gly Asn Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Tyr Asp Arg Gly Tyr Asn Asp Asn Arg Asp Asp Arg
100 105 110
Asp Asn Arg Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Asn Tyr Glu
115 120 125
Asp Arg Gly Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg
130 135 140
<210> 8
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Phe Glu Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
1 5 10 15
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Asn
35 40 45
Ser Ala Val Asp Gly Thr
50
<210> 9
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Phe Glu Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
1 5 10 15
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
20 25 30
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
65 70 75 80
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln
85 90 95
Pro Pro Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr
100 105
<210> 10
<211> 416
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile
1 5 10 15
Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr
20 25 30
Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser
35 40 45
Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro
50 55 60
Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp
65 70 75 80
Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val
85 90 95
Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro
100 105 110
Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe Gly
115 120 125
Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser
130 135 140
Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys
145 150 155 160
Val Met Ser Gln Arg His Met Ile Asp Gly Arg Trp Cys Asp Cys Lys
165 170 175
Leu Pro Asn Ser Lys Gln Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg Lys
180 185 190
Val Phe Val Gly Arg Cys Thr Glu Asp Met Thr Glu Asp Glu Leu Arg
195 200 205
Glu Phe Phe Ser Gln Tyr Gly Asp Val Met Asp Val Phe Ile Pro Lys
210 215 220
Pro Phe Arg Ala Phe Ala Phe Val Thr Phe Ala Asp Asp Gln Ile Ala
225 230 235 240
Gln Ser Leu Cys Gly Glu Asp Leu Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val His
245 250 255
Ile Ser Asn Ala Glu Pro Lys His Asn Ser Asn Arg Gln Leu Glu Arg
260 265 270
Ser Gly Arg Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly Gly
275 280 285
Phe Gly Asn Ser Arg Gly Gly Gly Ala Gly Leu Gly Asn Asn Gln Gly
290 295 300
Ser Asn Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn Pro
305 310 315 320
Ala Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ser Trp Gly Met
325 330 335
Met Gly Met Leu Ala Ser Gln Gln Asn Gln Ser Gly Pro Ser Gly Asn
340 345 350
Asn Gln Asn Gln Gly Asn Met Gln Arg Glu Pro Asn Gln Ala Phe Gly
355 360 365
Ser Gly Asn Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ala Ala Ile Gly
370 375 380
Trp Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly Gly
385 390 395 400
Phe Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met Gly Thr
405 410 415
Claims (8)
1.一种对细胞内源基因转录过程的控制方法，基于可控相分离液滴和CRISPR/dCas9技术，在细胞内表达模块化组合的转录因子dCas9-VPR-IDR，同时表达识别靶基因目标序列的sgRNA，在sgRNA的介导下使转录激活因子VPR和蛋白无结构区域IDR锚定到靶基因的启动子区域，并借助IDR间多价相互作用发生相分离形成凝聚体液滴，招募更多的转录机器至靶基因启动子区域，高效促进靶基因的转录。
2.如权利要求1所述的控制方法，其特征在于，通过下述步骤实现对细胞内源基因的高效转录激活：
1)利用分子克隆的办法，将具有相分离能力的蛋白无结构区域IDR与dCas9-VPR融合蛋白相融合，构建dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体；
2)设计与靶基因相匹配的sgRNA，并构建该sgRNA的表达载体；
3)将步骤1)和2)构建的表达载体一同转染进细胞；
4)筛选出转染成功的细胞；
5)利用sgRNA的指引，dCas9作为DNA锚定平台，将转录激活因子VPR与蛋白无结构区域IDR锚定到靶基因的启动子区域；
6)利用IDR间多价相互作用，提高靶基因启动子区域dCas9-VPR-IDR的浓度，并在达到一定浓度后自发在细胞内形成凝聚体液滴；
7)利用液滴的形成招募更多的转录机器至靶基因启动子区域中，高效促进靶基因的转录过程。
3.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，所述IDR的氨基酸序列选自序列表中SEQIDNo：1～10中的一种。
4.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，在步骤1)中，先使dCas9融合上转录激活因子VPR，再融合上蛋白无结构区域IDR，构建dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体。
5.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，在步骤1)构建的dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体中，dCas9-VPR-IDR融合蛋白基因采用组成型启动子或诱导型启动子。
6.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，在步骤2)构建的sgRNA的表达载体采用组成型启动子。
7.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，步骤3)采用脂质体转染的方法。
8.如权利要求7所述的控制方法，其特征在于，步骤3)所用脂质体为Lipo-2000。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110544532.1A CN113337541A (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法 |
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|---|---|---|---|
| CN202110544532.1A CN113337541A (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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- 2021-05-19 CN CN202110544532.1A patent/CN113337541A/zh active Pending
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