JP2022546408A - 遺伝子発現を調節するためのシステム - Google Patents

Abstract

遺伝子発現の調節に関する組成物及び方法を記載する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月３０日出願の米国仮出願第６２／８９４，６１１号、２０１９年９月２３日出願の米国仮出願第６２／９０４，６３５号、及び２０２０年６月２４日出願の米国仮出願第６３／０４３，５０４号の優先権を主張し、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府のライセンス権
本発明は、米国立衛生研究所によって授与されたＥＢ０１３５８４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

遺伝子の発現を調節するための核酸ベースの構築物は、感受性を増加させ、漏出性を低減させることによって改善することができる。

本開示は、調節可能な遺伝子産物の発現に関連する核酸構築物の発見を認識する。いくつかの実施形態では、本開示は、核酸構築物を使用する遺伝子発現の調節のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、核酸構築物における遺伝子発現の調節における選択的スプライシングの有用性を認識する。いくつかの実施形態では、本開示は、リガンド結合アプタマーを利用して遺伝子発現を調節することの有用性を認識する。

いくつかの実施形態では、本開示は、５’から３’の方向で、５’スプライスドナー部位と、操作されたイントロンと、第１の３’スプライスアクセプター部位と、１つ以上のリガンド結合ポケットを有する２つ以上のリガンド結合アプタマー、及びその中に少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを含むポリＡスイッチと、第２の３’スプライスアクセプター部位と、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列と、を含む、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現を調節するためのシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つのリガンド結合アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、３つのリガンド結合アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、スリーウェイジャンクションを含むポリＡスイッチを含む。いくつかの実施形態では、スリーウェイジャンクションは、１つ以上のＲＮＡ二本鎖ステムのジャンクションを含む。いくつかの実施形態では、スリーウェイジャンクションの部分は一本鎖である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、リガンド結合アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列は、５’ＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞における遺伝子産物の発現を調節するための方法を提供する。本方法は、細胞に、５’から３’方向で、５’スプライスドナー部位と、操作されたイントロンと、第１の３’スプライスアクセプター部位と、１つ以上のリガンド結合ポケットを有する２つ以上のリガンド結合アプタマー、及びその中に少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを含むポリＡスイッチと、第２の３’スプライスアクセプター部位と、を含むシステムを導入するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって発現される遺伝子産物は、細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって発現される遺伝子産物は、細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される方法は、個体の１つ以上の細胞において生じ、リガンドはグルコースであり、個体は糖尿病、糖尿病前症、または糖尿病による合併症を有し、及び／または発現可能なポリヌクレオチドはインスリンである。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される方法は、個体の１つ以上の細胞において生じ、発現可能なポリヌクレオチドは、ヒト成長ホルモン、凝固因子Ｘ、またはジストロフィンなどの治療用遺伝子産物である。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される方法は、個体の１つ以上の細胞において生じ、リガンドは、がんバイオマーカーの遺伝子産物であり、発現可能なポリヌクレオチドは、自殺遺伝子である。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される方法は、個体において生じ、発現可能なポリヌクレオチドはレポーター遺伝子であり、レポーター遺伝子の発現の位置及び／または強度は、個体の１つ以上の細胞におけるリガンドの空間分布、時間変動、またはその両方に関する情報を提供する。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される方法は、個体、組織、または細胞において生じ、発現可能なポリヌクレオチドは、検出可能な遺伝子産物をコードし、それぞれの個体、組織、または細胞は、画像化される。

（図１Ａ）本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの態様の概略図を提供する。リガンド誘導性選択的スプライシング及びポリＡシグナル切断に基づく「ハイブリッド」スイッチの機構を示す。 （図１Ｂ）本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの態様の概略図を提供する。Ｙ字型ポリＡスイッチの構成を示す。Ｙ字型構造の異なる部分の名称がラベル付けされている。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの態様の概略図を提供する。代表的なＹ字型ポリＡスイッチＹ１９６ＣＡＡの構成を示す。 同上。 同上。 異なる構成であり、異なる位置に位置付けされたポリＡ切断シグナルを有する追加のＹ字型構造の結果を示す。ポリＡシグナルは、赤い線で示される。スリーウェイジャンクションはボックスで示される。図２Ａ及び２Ｂは、スリーウェイジャンクションの周りに異なる配置の３つのアプタマー（アプタマーＡ、Ｂ、及びＣ）を有する代替的なＹ字型の構成を示す。図２Ｃは、スリーウェイジャンクションを有さずに互いに積み重ねられた３つのアプタマーを示す。 同上。 同上。 異なる構成であり、異なる位置に位置付けされたポリＡ切断シグナルを有する追加のＹ字型構造の結果を示す。ポリＡシグナルは、赤い線で示される。スリーウェイジャンクションはボックスで示される。図２Ａ及び２Ｂは、スリーウェイジャンクションの周りに異なる配置の３つのアプタマー（アプタマーＡ、Ｂ、及びＣ）を有する代替的なＹ字型の構成を示す。図２Ｃは、スリーウェイジャンクションを有さずに互いに積み重ねられた３つのアプタマーを示す。 同上。 同上。 異なる構成であり、異なる位置に位置付けされたポリＡ切断シグナルを有する追加のＹ字型構造の結果を示す。ポリＡシグナルは、赤い線で示される。スリーウェイジャンクションはボックスで示される。図２Ａ及び２Ｂは、スリーウェイジャンクションの周りに異なる配置の３つのアプタマー（アプタマーＡ、Ｂ、及びＣ）を有する代替的なＹ字型の構成を示す。図２Ｃは、スリーウェイジャンクションを有さずに互いに積み重ねられた３つのアプタマーを示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドにおけるポリＡ切断シグナルの数の改変の結果を示す。図３Ａは、２つの異なるステム上に位置する２つのポリＡシグナル（赤いボックス）を示す。図３Ｂは、アーム１－２に部分的に埋設された１つのみのポリＡシグナルを示す。図３Ｃは、２つのポリＡシグナル（赤いボックス）がアーム１－２に埋め込まれていることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドにおけるポリＡ切断シグナルの数の改変の結果を示す。図３Ａは、２つの異なるステム上に位置する２つのポリＡシグナル（赤いボックス）を示す。図３Ｂは、アーム１－２に部分的に埋設された１つのみのポリＡシグナルを示す。図３Ｃは、２つのポリＡシグナル（赤いボックス）がアーム１－２に埋め込まれていることを示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドにおけるポリＡ切断シグナルの数の改変の結果を示す。図３Ａは、２つの異なるステム上に位置する２つのポリＡシグナル（赤いボックス）を示す。図３Ｂは、アーム１－２に部分的に埋設された１つのみのポリＡシグナルを示す。図３Ｃは、２つのポリＡシグナル（赤いボックス）がアーム１－２に埋め込まれていることを示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの改変の結果を示す。図４Ｌは、最良のスリーウェイジャンクション配列を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのスリーウェイジャンクションの位置に対するポリＡシグナルの改変の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第３の二本鎖ステム（図１Ｂにおいてアーム３－１及び３－２と称する）の改変の結果を示す。図６Ａは、アーム３－１の改変の結果を示す。図６Ｂは、アーム３－２の改変の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第３の二本鎖ステム（図１Ｂにおいてアーム３－１及び３－２と称する）の改変の結果を示す。図６Ａは、アーム３－１の改変の結果を示す。図６Ｂは、アーム３－２の改変の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第２の二本鎖ステム（図１Ｂにおいてアーム２－１及び２－２と称する）の改変の結果を示す。図７Ａは、アーム２－２の改変の結果を示す。図７Ｂは、アーム２－１の改変の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第２の二本鎖ステム（図１Ｂにおいてアーム２－１及び２－２と称する）の改変の結果を示す。図７Ａは、アーム２－２の改変の結果を示す。図７Ｂは、アーム２－１の改変の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の二本鎖ステム（図１Ｂにおいてアーム１－２と称する）の上部の改変の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の二本鎖ステム（図１Ｂにおいてアーム１－１と称する）の下部の改変の結果を示す。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのアプタマーの方向の改変の結果を示す。図１０Ａは、アプタマーＢの方向が逆転した結果を示す。図１０Ｂは、アプタマーＡ方向の方向が逆転した結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのアプタマーの方向の改変の結果を示す。図１０Ａは、アプタマーＢの方向が逆転した結果を示す。図１０Ｂは、アプタマーＡ方向の方向が逆転した結果を示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドにおけるそれぞれのアプタマーの寄与を示す。図１１Ａは、Ａ～Ｃの点変異（矢印によって示す）によるそれぞれのアプタマーの不活性化の効果を示す。図１１Ｂは、誘導に対するアプタマーＡの欠失の効果を示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドにおけるそれぞれのアプタマーの寄与を示す。図１１Ａは、Ａ～Ｃの点変異（矢印によって示す）によるそれぞれのアプタマーの不活性化の効果を示す。図１１Ｂは、誘導に対するアプタマーＡの欠失の効果を示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドに続く発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの改変の結果を示す。異なる親構築物を使用して、発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにＣＡＡリピート（下線）を挿入した結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドに続く発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの改変の結果を示す。親構築物としてＳ５６を使用した、強力な３’スプライス部位を有する新たな５’ＵＴＲ配列を試験した結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドに続く発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの改変の結果を示す。Ｙ３０５及びＹ３００の５’ＵＴＲに非構造化スペーサー配列を挿入した結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドに続く発現可能なポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの改変の結果を示す。５’ＵＴＲ中の３’スプライス部位の前にＣＡＡリピートを挿入することを示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのＧクワッド配列の重要性を示す。Ａは、親構築物としてＹ１９６ＣＡＡを使用した誘導に対するＧ－クワッド配列の効果を示す。Ｂは、親構築物としてＳ５６を使用して、４ＭＡＺ Ｇ－クワッドを置き換えるために異なるＧ－クワッド配列を試験した結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドのテトラサイクリン誘導選択的スプライシングの確認を示す。Ｔｃの非存在下では、ＩＶＳ２スプライシングＲＮＡはポリＡ切断によって分解される（レーン１及び３）。Ｔｃの存在は、Ｙ１９６ＣＡＡ－２ＭＡＺ及びＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの両方において選択的スプライシングを誘導する（レーン２及び４）。リガンド誘導の選択的スプライシングは、４ＭＡＺの存在ではるかに顕著である。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺのアーム１－１内に移動させた結果を示す。図１５Ｂは、第１の３’スプライス部位が、アプタマーＡ（赤い矢印）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。その配列の一部を欠失させることによってアプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。図１５Ｃは、ＩＶＳの３’スプライス部位（青い箱）をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させた結果を示し、図１５Ｄは、ＩＶＳの３’スプライス部位をアーム１－２のバルジに配置した結果を示す。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位を、アーム１－１内のアプタマーＡ内またはアプタマーＡからさらに離れて移動させた結果を示す。図１５Ｇは、第１の３’スプライス部位（ＣＡＧＮＮＮ）後の３つの塩基のランダム化を示す。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺのアーム１－１内に移動させた結果を示す。図１５Ｂは、第１の３’スプライス部位が、アプタマーＡ（赤い矢印）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。その配列の一部を欠失させることによってアプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。図１５Ｃは、ＩＶＳの３’スプライス部位（青い箱）をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させた結果を示し、図１５Ｄは、ＩＶＳの３’スプライス部位をアーム１－２のバルジに配置した結果を示す。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位を、アーム１－１内のアプタマーＡ内またはアプタマーＡからさらに離れて移動させた結果を示す。図１５Ｇは、第１の３’スプライス部位（ＣＡＧＮＮＮ）後の３つの塩基のランダム化を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺのアーム１－１内に移動させた結果を示す。図１５Ｂは、第１の３’スプライス部位が、アプタマーＡ（赤い矢印）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。その配列の一部を欠失させることによってアプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。図１５Ｃは、ＩＶＳの３’スプライス部位（青い箱）をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させた結果を示し、図１５Ｄは、ＩＶＳの３’スプライス部位をアーム１－２のバルジに配置した結果を示す。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位を、アーム１－１内のアプタマーＡ内またはアプタマーＡからさらに離れて移動させた結果を示す。図１５Ｇは、第１の３’スプライス部位（ＣＡＧＮＮＮ）後の３つの塩基のランダム化を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺのアーム１－１内に移動させた結果を示す。図１５Ｂは、第１の３’スプライス部位が、アプタマーＡ（赤い矢印）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。その配列の一部を欠失させることによってアプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。図１５Ｃは、ＩＶＳの３’スプライス部位（青い箱）をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させた結果を示し、図１５Ｄは、ＩＶＳの３’スプライス部位をアーム１－２のバルジに配置した結果を示す。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位を、アーム１－１内のアプタマーＡ内またはアプタマーＡからさらに離れて移動させた結果を示す。図１５Ｇは、第１の３’スプライス部位（ＣＡＧＮＮＮ）後の３つの塩基のランダム化を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺのアーム１－１内に移動させた結果を示す。図１５Ｂは、第１の３’スプライス部位が、アプタマーＡ（赤い矢印）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。その配列の一部を欠失させることによってアプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。図１５Ｃは、ＩＶＳの３’スプライス部位（青い箱）をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させた結果を示し、図１５Ｄは、ＩＶＳの３’スプライス部位をアーム１－２のバルジに配置した結果を示す。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位を、アーム１－１内のアプタマーＡ内またはアプタマーＡからさらに離れて移動させた結果を示す。図１５Ｇは、第１の３’スプライス部位（ＣＡＧＮＮＮ）後の３つの塩基のランダム化を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺのアーム１－１内に移動させた結果を示す。図１５Ｂは、第１の３’スプライス部位が、アプタマーＡ（赤い矢印）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。その配列の一部を欠失させることによってアプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。図１５Ｃは、ＩＶＳの３’スプライス部位（青い箱）をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させた結果を示し、図１５Ｄは、ＩＶＳの３’スプライス部位をアーム１－２のバルジに配置した結果を示す。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位を、アーム１－１内のアプタマーＡ内またはアプタマーＡからさらに離れて移動させた結果を示す。図１５Ｇは、第１の３’スプライス部位（ＣＡＧＮＮＮ）後の３つの塩基のランダム化を示す。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第１の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺのアーム１－１内に移動させた結果を示す。図１５Ｂは、第１の３’スプライス部位が、アプタマーＡ（赤い矢印）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。その配列の一部を欠失させることによってアプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。図１５Ｃは、ＩＶＳの３’スプライス部位（青い箱）をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させた結果を示し、図１５Ｄは、ＩＶＳの３’スプライス部位をアーム１－２のバルジに配置した結果を示す。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位を、アーム１－１内のアプタマーＡ内またはアプタマーＡからさらに離れて移動させた結果を示す。図１５Ｇは、第１の３’スプライス部位（ＣＡＧＮＮＮ）後の３つの塩基のランダム化を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第２の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１６Ａは、代替３’スプライス部位の強度を変化させるための５’ＵＴＲの改変の結果を示す。図１２Ｂは、誘導を改善するために、代替３’スプライス部位の強度を調節するための、５’ＵＴＲにおける「ＴＡＧ」後の３つの塩基のランダム化（ＴＡＧＮＮＮ）の結果を示す。図１２Ｃは、ランダム化から選択される最良のＴＡＧＮＮＮ配列をＹ３２９の５’ＵＴＲに組み込む結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第２の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１６Ａは、代替３’スプライス部位の強度を変化させるための５’ＵＴＲの改変の結果を示す。図１２Ｂは、誘導を改善するために、代替３’スプライス部位の強度を調節するための、５’ＵＴＲにおける「ＴＡＧ」後の３つの塩基のランダム化（ＴＡＧＮＮＮ）の結果を示す。図１２Ｃは、ランダム化から選択される最良のＴＡＧＮＮＮ配列をＹ３２９の５’ＵＴＲに組み込む結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの第２の３’スプライスアクセプター部位の改変の結果を示す。図１６Ａは、代替３’スプライス部位の強度を変化させるための５’ＵＴＲの改変の結果を示す。図１２Ｂは、誘導を改善するために、代替３’スプライス部位の強度を調節するための、５’ＵＴＲにおける「ＴＡＧ」後の３つの塩基のランダム化（ＴＡＧＮＮＮ）の結果を示す。図１２Ｃは、ランダム化から選択される最良のＴＡＧＮＮＮ配列をＹ３２９の５’ＵＴＲに組み込む結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの操作されたイントロンのサイズの改変の結果を示す。ＩＶＳ２イントロンのサイズ及びスプライシングエレメントを変化させる結果を示す。 同上。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの操作されたイントロンのサイズの改変の結果を示す。より短い操作されたイントロンを用いて構築物（Ｓ１５９、Ｓ１６４、及びＳ１６９）からＣＡＡリピートを除去した結果を示す。 本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチド中の上流オープンリーディングフレーム（μＯＲＦ）の包含の結果を示す。ポリＡアプタマー内の上流オープンリーディングフレームの包含の概略図を示す。挿入された上流のＡＴＧ開始コドンはボックス化される。 同上。 同上。 明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチド中の上流オープンリーディングフレーム（μＯＲＦ）の包含の結果を示す。上流オープンリーディングフレームを有する構築物の５’ＵＴＲ配列の微調整の結果を示す。 明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチド中の上流オープンリーディングフレーム（μＯＲＦ）の包含の結果を示す。上流オープンリーディングフレームを含む１つの代表的なハイブリッドスイッチを示す。 同上。 同上。 リガンドの存在下で発現可能なポリペプチドの遺伝子発現を制御する、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの能力を示す。図１９Ａは、代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの性能を示す。図１９Ｂは、顕微鏡検査によって可視化された代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの用量反応を示す。図１９Ｃは、Ｙ３００及びＹ３０１の性能を示す。図１９Ｄは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＹ３６２及びＹ３６７の用量反応を示す。図１９Ｅは、ｅＧＦＰレポーターシグナルを使用した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって決定される、Ｙ３６２及びＹ３６７の１ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンに対する応答を示す。全ての結果における「誘導倍率」を、テトラサイクリンの存在下対非存在下での導入遺伝子発現の比率として計算した。 リガンドの存在下で発現可能なポリペプチドの遺伝子発現を制御する、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの能力を示す。図１９Ａは、代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの性能を示す。図１９Ｂは、顕微鏡検査によって可視化された代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの用量反応を示す。図１９Ｃは、Ｙ３００及びＹ３０１の性能を示す。図１９Ｄは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＹ３６２及びＹ３６７の用量反応を示す。図１９Ｅは、ｅＧＦＰレポーターシグナルを使用した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって決定される、Ｙ３６２及びＹ３６７の１ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンに対する応答を示す。全ての結果における「誘導倍率」を、テトラサイクリンの存在下対非存在下での導入遺伝子発現の比率として計算した。 リガンドの存在下で発現可能なポリペプチドの遺伝子発現を制御する、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの能力を示す。図１９Ａは、代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの性能を示す。図１９Ｂは、顕微鏡検査によって可視化された代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの用量反応を示す。図１９Ｃは、Ｙ３００及びＹ３０１の性能を示す。図１９Ｄは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＹ３６２及びＹ３６７の用量反応を示す。図１９Ｅは、ｅＧＦＰレポーターシグナルを使用した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって決定される、Ｙ３６２及びＹ３６７の１ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンに対する応答を示す。全ての結果における「誘導倍率」を、テトラサイクリンの存在下対非存在下での導入遺伝子発現の比率として計算した。 リガンドの存在下で発現可能なポリペプチドの遺伝子発現を制御する、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの能力を示す。図１９Ａは、代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの性能を示す。図１９Ｂは、顕微鏡検査によって可視化された代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの用量反応を示す。図１９Ｃは、Ｙ３００及びＹ３０１の性能を示す。図１９Ｄは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＹ３６２及びＹ３６７の用量反応を示す。図１９Ｅは、ｅＧＦＰレポーターシグナルを使用した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって決定される、Ｙ３６２及びＹ３６７の１ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンに対する応答を示す。全ての結果における「誘導倍率」を、テトラサイクリンの存在下対非存在下での導入遺伝子発現の比率として計算した。 リガンドの存在下で発現可能なポリペプチドの遺伝子発現を制御する、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの能力を示す。図１９Ａは、代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの性能を示す。図１９Ｂは、顕微鏡検査によって可視化された代表的なＳシリーズ構築物対Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの用量反応を示す。図１９Ｃは、Ｙ３００及びＹ３０１の性能を示す。図１９Ｄは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＹ３６２及びＹ３６７の用量反応を示す。図１９Ｅは、ｅＧＦＰレポーターシグナルを使用した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって決定される、Ｙ３６２及びＹ３６７の１ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンに対する応答を示す。全ての結果における「誘導倍率」を、テトラサイクリンの存在下対非存在下での導入遺伝子発現の比率として計算した。 ゲノムにおける内因性遺伝子の発現を制御する内因性スイッチとして機能する、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの能力を示す。 ３箇所の単一塩基変化を組み合わせたＹ字型ポリＡスイッチの構成を示す。本明細書に示すＹ３８７構築物は、３つの変化全てを含んでいる。 同上。 同上。 ３つの単一塩基変化の組み合わせが、低い薬物濃度で発現可能なポリペプチドの誘導発現を有意に増加させることを示す。４つの異なる親構築物（Ｙ３５９、Ｙ３６０、Ｙ３６１、Ｙ３６２Ｃ）を使用して、単一塩基変化の誘導への影響を示した。これらの単一塩基変化による誘導への影響は、４つの異なる親構築物全てにわたって類似している。上部パネルは、標準偏差を伴って誘導倍率を示す。下部パネルは、各構築物の誘導倍率をプロットする。 ３箇所の単一塩基変化を組み合わせたＹ字型ポリＡスイッチを含む構築物Ｙ３６２及びＹ３８６からの発現誘導の用量反応分析を示す。Ａは、テトラサイクリンによる誘導が、ＥＣ_１００参照としての最大誘導倍率を使用して、０．５～１μｇ／ｍｌのＴｃという低いレベルで、最大レベルの５０％（ＥＣ_５０）に達することを示す。Ｂは、ＥＣ_１００参照と同様の親構築物（同様の配列を有するがＹ字型構造を有しないＨＤＭ－Ｌｕｃ）の最大発現レベルを使用した同様の計算を示す。この場合、ＥＣ_５０は、０．５～１．２μｇ／ｍｌの低いテトラサイクリンによって到達される。

特定の実施形態の詳細な説明
いくつかの実施形態では、本開示は、調節可能な遺伝子産物発現のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、調節可能な遺伝子産物発現のための組成物及び方法は、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、とりわけ、１つ以上のスプライスドナー部位、１つ以上のスプライスアクセプター部位、操作されたイントロン、ポリＡスイッチ、及び発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡスイッチは、少なくとも１つのリガンド結合アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡスイッチは、少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、ＲＮＡ二本鎖ステムを含む。

アプタマー
アプタマーは、受容体のように折り畳まれ、特定のリガンドに結合する短いＲＮＡ配列である。特定のリガンドに対する高い親和性を有するアプタマーを生成するための効率的なインビトロ進化方法が十分に確立されている。アプタマーの結合親和性は、多くの場合、抗体の結合親和性に匹敵するナノモル範囲に到達することができる。この点で、アプタマーは、ＲＮＡで作製された抗体とみなすことができる。アプタマーを抗体と区別するのは、その小さなサイズ（多くの場合、５０塩基未満）及びそのモジュール性質である。これらの特徴により、アプタマーは結合機能を失うことなく他のＲＮＡ構造と統合し制御することができる。アプタマーは、自己切断ＲＮＡリボザイムを形質転換してリガンド依存的に動作し、試験管内及び細胞内で分子スイッチのように機能することが実証されている。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ二本鎖ステムを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、単一のポリＡアプタマーポリヌクレオチド内に含まれる相補的核酸の分子内塩基対合によって形成される核酸構造である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムはまた、アームと称され得る。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ二本鎖ステムを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つのＲＮＡ二本鎖ステムを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、３つのＲＮＡ二本鎖ステムを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、リガンド結合アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つのリガンド結合アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、３つのリガンド結合アプタマーを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも２つのＲＮＡ二本鎖ステムが連結されて、ジャンクションを形成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムのジャンクションは、一本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、３つのＲＮＡステムが会合して、スリーウェイジャンクションを形成する。いくつかの実施形態では、スリーウェイジャンクションは、少なくとも１つの一本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、スリーウェイジャンクションは、１つ、２つ、または３つの一本鎖領域を含む。

いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡステムの配列は、以下のうちの１つから選択される：

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムのジャンクションによって形成される一本鎖領域は、少なくとも１つの核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムのジャンクションによって形成される一本鎖領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態では、スリーウェイジャンクションは、第１、第２、及び第３の一本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の一本鎖領域は、Ｃ及びＡから選択される少なくとも１つの塩基を含む。いくつかの実施形態では、第２の一本鎖領域は、Ｃ及びＡから選択される少なくとも１つの塩基を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、３０、２０、１０、または５塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、５～３０、１０～３０、２０～３０、５～１０、５～２０、５～３０、または１０～２０塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、最大３０塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、３０、２０、または１０塩基対未満の長さである。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上のアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つのアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、３つのアプタマーを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドに含まれるアプタマーは、少なくとも１つの一本鎖領域と、少なくとも１つのアプタマーＲＮＡ二本鎖ステムと、を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーＲＮＡ二本鎖ステムは、一本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーＲＮＡは、

（例えば、アーム２－２）の配列を有するＲＮＡ二本鎖ステムを有する。いくつかの実施形態では、アプタマーＲＮＡは、

（例えば、３－２である）の配列を有するＲＮＡ二本鎖ステムを有する。いくつかの実施形態では、アプタマーＲＮＡは、長さが６～１０、７～１１、８～１２、９～１３、１０～１４塩基対の範囲の長さを有するＲＮＡ二本鎖ステムを有する。

ポリＡ切断シグナル
様々な実施形態によれば、様々なポリＡシグナルのうちの任意のもの（例えば、ポリＡシグナル配列によってコードされる）を使用し得る。非限定的な例として、哺乳動物細胞において使用されるポリＡシグナル配列としては以下が挙げられる：ＡＡＵＡＡＡ、ＡＵＵＡＡＡ、ＡＧＵＡＡＡ、ＡＣＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡＡ、ＣＡＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＡＣＡ、及びＡＡＵＡＧＡ。いくつかの実施形態では、ポリＡスイッチは、２つ以上のポリＡシグナル配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）を含み得る。

ポリアデニル化は、全ての哺乳動物細胞に存在する基本的なｍＲＮＡプロセシング機構である。典型的には、哺乳動物のポリＡシグナルは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に見出される。対照的に、本開示は、遺伝子等の発現可能なポリヌクレオチドの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）以外の位置で発現構築物中に存在するポリＡ切断シグナルを含む組成物及び方法を提供する。ポリＡシグナルが細胞に通常見られない５’ＵＴＲにおいて人工的に作製される場合、ポリＡシグナルの効率的な切断は、その部位にポリＡテールを付加することをもたらす。これにより、導入遺伝子配列と関連するｍＲＮＡの後半の除去及び分解が生じ、したがって、遺伝子発現が失われる。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、発現ポリペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）をコードする核酸配列の翻訳開始部位の上流に存在する。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、スリーウェイジャンクションの一本鎖領域は、ポリＡ切断シグナルの全部または一部を含む。いくつかの実施形態では、スリーウェイジャンクションの第３の一本鎖領域は、ポリＡ切断シグナルの全部または一部を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖ステムは、ポリＡ切断シグナルの全部または一部を含む。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡ二本鎖ステムは、ポリＡ切断シグナルの全部または一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるポリＡ切断シグナルの一部は、１つ、２つ、３つ、または４つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ切断シグナルは、ＡＡＵＡＡＡの配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリＡ切断シグナルは、ＡＵＵＡＡＡ、ＡＧＵＡＡＡ、ＡＣＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡＡ、ＣＡＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＡＣＡ、ＡＡＵＡＧＡ、ＡＡＡＡＡＧ、またはＡＣＵＡＡＡの配列を有する。２つ以上のポリＡシグナルが構築物で利用される実施形態では、ポリＡシグナルは同じであっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、発現可能なポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されることができる。

いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ中のポリＡ切断シグナルの存在は、分解のためのポリＡシグナルの後のｍＲＮＡの後半を標的とし、この能力は、本開示の種々の組成物及び方法において利用される。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ中のポリＡ切断シグナルの存在は、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡ／ｍＲＮＡの切断をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡ／ｍＲＮＡの切断は、プレｍＲＮＡ／ｍＲＮＡの後半の分解をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡ／ｍＲＮＡの切断は、ポリペプチドの発現をもたらさない。

特定の実施形態では、ポリＡ切断シグナルは、１つ以上のリガンドが結合することができる、少なくとも１つのリガンド結合アプタマーを含むポリＡアプタマーポリヌクレオチド内にある。いくつかの実施形態では、リガンドのリガンド結合アプタマーへの結合は、選択的スプライシング後のプレｍＲＮＡ／ｍＲＮＡにポリＡ切断シグナルが存在するか否かを決定する。いくつかの実施形態では、リガンドのリガンド結合アプタマーへの結合は、選択的スプライシング後にプレｍＲＮＡ／ｍＲＮＡが切断されるか否かを決定する。いくつかの実施形態では、リガンドのリガンド結合アプタマーへの結合は、発現可能なポリペプチドが選択的スプライシング後に発現されるか否かを決定する。

操作されたイントロン
いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、操作されたイントロンを含む。いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは１つ以上のスプライス部位を含む。いくつかの実施形態では、スプライス部位は、スプライスドナー部位（例えば、ＧＵ配列を含む）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、スプライス部位は、スプライスアクセプター部位（例えば、ＡＧ配列を含む）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、操作されたイントロンにおけるスプライス部位（例えば、互いに及び／または１つ以上の内因性スプライス部位（複数可）と連動して）は、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドから操作されたイントロンを切除するよう機能する。

いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは、５’スプライスドナー部位の前にある。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、操作されたイントロンの５’の領域に５’スプライスドナー部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、操作されたイントロンの３’に第１の３’スプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの操作されたイントロンは、５’スプライスドナー部位と、第１の３’スプライスアクセプター部位とを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列のすぐ５’に、第２の３’スプライスアクセプター部位を含む。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、スプライスドナー部位の５’にプロモーターを含む。例示的なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、Ｅ１Ｆ、ＶＡＶ、ＴＣＲｖベータ、ＭＣＳＶ、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びＰＧＫプロモーターが挙げられる。

いくつかの実施形態では、リガンド結合アプタマーに結合したリガンドの非存在下において、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡのスプライシングは、５’スプライスドナー部位と第１の３’スプライスアクセプター部位との間で生じる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡの５’スプライスドナー部位と第１の３’スプライスアクセプター部位との間のスプライシングは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５’ＵＴＲの前にポリＡ切断シグナルを含むｍＲＮＡをもたらす。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５’ＵＴＲの前のポリＡ切断シグナルの存在は、ポリＡ切断部位における切断及び発現可能なポリペプチドをコードする配列の分解をもたらす。

いくつかの実施形態では、リガンド結合アプタマーに結合したリガンドの存在下において、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡのスプライシングは、５’スプライスドナー部位と第２の３’スプライスアクセプター部位との間で生じる。いくつかの実施形態では、５’スプライスドナー部位と第２の３’スプライスアクセプター部位との間の、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡのスプライシングは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡをもたらす。いくつかの実施形態では、５’スプライスドナー部位と第２の３’スプライスアクセプター部位との間の、記載されるポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡのスプライシングは、それをスプライシングすることによってポリＡ切断シグナルの除去をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチドによってコードされるプレｍＲＮＡの５’スプライスドナー部位と第２の３’スプライスアクセプター部位との間のスプライシングは、発現可能なポリペプチドの発現をもたらす。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つ以上のリガンド結合アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のリガンド結合アプタマーのそれぞれは、異なるリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、２つ以上の別個のポリＡスイッチを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリＡスイッチは、第１のリガンドに結合する第１のアプタマーを含み、第２のポリＡスイッチは、第２のリガンドに結合する第２のアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のアプタマーは同一ではなく、第１及び第２のリガンドは同一ではない。いくつかの実施形態では、第１及び第２のアプタマーは同一ではなく、第１及び第２のリガンドは同一である。

いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは、任意の配列である。いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは、約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは、１００～２００、１１０～２００、１２０～２００、１３０～２００、１４０～２００、１５０～２００、１６０～２００、１７０～２００、または１８０～２００塩基の長さの範囲内である。いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは、最大でも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０塩基の長さである。いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは、以下の配列を有する：
ＧＴＧＡＧＴＣＴＴＡＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＡＧＧＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＣＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号１）

いくつかの実施形態では、操作されたイントロンは、以下の配列を有する：
ＧＴＧＡＧＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＧＡＣＣＡＡＡＴＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＣＡＡＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＴＡＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＴＧＣＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＡＧＧＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＡＣＣＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号４９）

本明細書で使用される場合、イントロンは、ＤＮＡ配列またはその対応するＲＮＡ配列のいずれかを指すことができる。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、ポリＡアプタマーポリヌクレオチド内のポリＡシグナル切断を促進、調節、または補助するための追加の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５’かつポリＡ切断シグナルの３’にＧ－Ｕリッチ領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、ポリＡアプタマーポリヌクレオチド内のスプライシングを促進、調節、または補助するための追加の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、選択的スプライシングの強度を調節することができる核酸トリプレット配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸トリプレット配列は、５’ＵＴＲ中の第２の３’アクセプター部位に対して３’である。いくつかの実施形態では、核酸トリプレット配列は、操作されたイントロンの３’である。いくつかの実施形態では、核酸トリプレット配列の配列は、任意の３つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸トリプレット配列の配列は、ＴＡＧ、ＴＣＴ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＣＣ、ＡＣＡ、ＡＡＣ、ＡＣＣ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、ＴＧＡ、ＴＣＴ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、またはＣＡＴを含む。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５’かつポリＡ切断シグナルの３’にＧ－Ｕリッチ領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５’かつＧ－Ｕリッチ領域の３’にＧリッチ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｇリッチ領域は、当該技術分野においてＭＡＺ配列であると理解される。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上のＧリッチ領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上の連続したＧリッチ領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上のＭＡＺ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上の連続したＭＡＺ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つのＭＡＺ配列を含む。連続したＭＡＺは、１つ以上のスペーサー配列によって分離され得る。いくつかの実施形態では、Ｇリッチ領域の配列はＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡ（配列番号４７）である。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上の開始コドンを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上のフレーム外開始コドンを含む。いくつかの実施形態では、フレーム外開始コドンは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列のコード配列に対してフレーム外である。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、フレームの開始コドンのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、操作されたイントロンの３’の第１の３’スプライスアクセプター部位の３’のフレーム外開始コドンを少なくとも１つ含む。

発現可能なポリペプチド
いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列は、５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５‘ＵＴＲは、３’スプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５‘ＵＴＲは、分岐点及び３’スプライスアクセプター部位を含む。分岐点は、５’ドナースプライス部位に対する求核攻撃の開始に関与するヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを含むことが当該技術分野で理解されている。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５‘ＵＴＲは、分岐点を含まない。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５‘ＵＴＲは、スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、少なくとも１つのＣＡＡリピートを含む。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列の５‘ＵＴＲは、ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣ（配列番号４８）の配列を有する。

いくつかの実施形態では、本開示で企図される発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の核酸配列または任意のポリペプチドをコードする任意の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡをコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、本開示で企図される発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列は、外因性核酸であり得る。いくつかの実施形態では、本開示において企図される発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列は、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドが導入されている対象に内因性の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、目的の遺伝子の発現を調節する個体のゲノムの領域に導入される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドを使用して、個体に内因性の遺伝子の発現を調節することができる。いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列は、内因性核酸配列である。

いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドは、インスリンである。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドは、ヒト成長ホルモンである。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドは、凝固因子Ｘである。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドは、ジストロフィンである。いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドは、自殺タンパク質である。いくつかの実施形態では、自殺タンパク質は、細胞死を誘発するタンパク質である。例示的な自殺タンパク質としては、Ｍｉｘｅｄ Ｌｉｎｅａｇｅキナーゼドメイン様シュードキナーゼ（ＭＬＫＬ）、受容体相互作用セリン／トレオニン－タンパク質キナーゼ３（ＲＩＰＫ３）、受容体相互作用セリン／トレオニン－タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）、デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）、またはガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、システイン－アスパラギン酸プロテアーゼ、システインアスパラギンアーゼ、またはシステイン依存性アスパラギン酸指向性プロテアーゼ（カスパーゼ－１またはＣＡＳＰ－１）、カスパーゼ－４、カスパーゼ－５、カスパーゼ－１２、ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ（デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質を含むＰＹＤ及びＣＡＲＤドメイン）、またはそのバリアントが挙げられる。

いくつかの実施形態では、発現可能なポリペプチドは、検出可能な遺伝子産物である。いくつかの実施形態では、検出可能な遺伝子産物は、レポーターである。いくつかの実施形態では、レポーターは、検出可能なシグナルを提供することができ、及び／または検出可能なシグナルを生成する能力を含む（例えば、化合物を検出可能な生成物に変換する反応を触媒することによって）タンパク質である。検出可能なシグナルは、例えば、蛍光または発光を含むことができる。検出可能なシグナル、それらを検出する方法、及びそれらを試薬（例えば、レポータータンパク質を含むポリペプチド）に組み込む方法は、当該技術分野で周知である。態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、検出可能なシグナルとしては、分光、光化学、生化学、免疫化学、電磁、放射化学、または蛍光、化学蛍光、もしくは化学発光などの化学的手段、または任意の他の適切な手段によって検出され得るシグナルが挙げられ得る。態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、カタラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、トリプシン、プロテアーゼ、短縮化レポータータンパク質を補完及び活性化するペプチド、キナーゼからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの活性または機能は、発現可能なポリペプチドの発現によって測定される。いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドの活性または機能は、誘導倍率によって測定される。いくつかの実施形態では、誘導倍率は、リガンドの存在下での発現可能なポリペプチドと、リガンドの非存在下での発現可能なポリペプチドとの比率として計算される。いくつかの実施形態では、誘導倍率は、アプタマーの存在下での発現可能なポリペプチドと、異なるアプタマーの存在下での発現可能なポリペプチドとの比率として計算される。いくつかの実施形態では、誘導倍率は、少なくとも１つのスプライスアクセプター部位及び１つのスプライスドナー部位を含むアプタマーの存在下での発現可能なポリペプチドと、スプライス部位を有しない異なるアプタマーの存在下での発現可能なポリペプチドとの比率として計算される。いくつかの実施形態では、誘導倍率は、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの導入前の内因性遺伝子の発現と、同じ内因性遺伝子の発現を調節するポリＡアプタマーポリヌクレオチドの導入後の内因性遺伝子の発現との比率として計算される。

リガンド
種々の実施形態によれば、リガンドは、提供されるシステムの所望の最終目的を促進するように選択され得る。したがって、リガンドは、ポリペプチド、核酸、低分子、薬物、代謝産物、またはそれらの組み合わせであり得るか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞代謝産物、異常な細胞タンパク質、または病原性生物（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）によって発現されるタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、特定の治療コンテキストで必要に応じてシステムの投与及び機能が容易に調節され得るように、外因的に投与される小分子であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、テトラサイクリンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、リガンドは、発現可能なポリペプチドの発現が特定の生物学的状態（例えば、感染、腫瘍形成、高または低グルコース）に応答して、例えば、細胞、組織、または対象内の１つ以上の細胞内「サイン」を検出することができるバイオセンサーシステムとして生じるように選択され得る。したがって、いくつかの実施形態では、リガンドは、対象に内因性である（例えば、内因性タンパク質）。いくつかの実施形態では、リガンドは、ネオマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、リガンドは、テオフィリンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、リガンドは、グルコースである。いくつかの実施形態では、リガンドは、がんバイオマーカーである。

ベクター
いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、ベクターによって導入され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。好適なウイルスベクターとして、限定されないが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルス、ピコルナル（例えば、ポリオ）ワクシニア、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び鳥痘ウイルスベクターが挙げられる。

治療を含む例示的な使用
本開示によれば、ポリＡアプタマーポリヌクレオチド及び／または１つ以上のポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含むシステムは、様々な用途のいずれかにおいて使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、例えば、発現可能なポリヌクレオチドによってコードされる治療用タンパク質の制御可能な発現を提供することによって、疾患に罹患している個体の治療に使用される。いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝的障害によって引き起こされる特定のタンパク質（複数可）の欠如である。いくつかの実施形態では、疾患は、糖尿病、糖尿病前症、または糖尿病による合併症である。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝性第Ｘ因子欠乏症である。いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、疾患の他の治療と併用して提供される。いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞またはｉＰＳＣ）への細胞のリプログラミングを誘導するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示のポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、疾患の他の治療の前、治療中、または治療後に導入または投与される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、インスリン、成長ホルモン、ジストロフィン、アルブミン、第ＩＸ因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、及びそれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらを含む。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含むシステムを使用して、療法が特定の対象において有効であるかどうかに関する情報を提供してもよい。１つ以上の療法が対象において有効であるかどうかを決定することが望ましいいくつかの実施形態では、療法が提供される前に、例えば、療法のための特定の指示性化合物の存在または非存在を検出するためにシステムが対象において使用され得、次いで、療法が１回以上提供された後に、特定の指示性化合物の存在または非存在を検出するために、システムが対象において使用され得る。他の実施形態では、本システムは、療法の有効性を示す特定の化合物の存在または非存在を識別するように、療法が対象に１回以上提供される後まで、療法をモニターするために使用されない。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチド及び／または１つ以上のポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含むシステムを、バイオセンサーとして使用してもよい。様々な実施形態によれば、提供されるシステムは、特定の環境（例えば、細胞内、細胞外、及び／または環境）に関する空間的及び／または時間的情報を提供し得る。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含むシステムを使用して、対象における１つ以上の特定の分子サインを検出し、分子サイン（複数可）の存在に応答して所望の生物学的状態を達成するために所望の発現可能なポリペプチドの産生を可能にしてもよい。いくつかの実施形態では、分子サインは、特定の内因性遺伝子産物（例えば、疾患関連遺伝子産物／タンパク質）の存在、毒素の存在、外因性遺伝子産物の存在、代謝産物（例えば、環境汚染物質由来の代謝産物）の存在、及びそれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドは、１つ以上のレポーター部分（例えば、レポーター遺伝子産物、例えば、イメージングレポーター）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドに含まれる発現可能なポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子産物は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、赤外線蛍光タンパク質、近赤外線蛍光タンパク質、オプシン、及びそれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。

いくつかの実施形態では、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含むシステムは、レポーター遺伝子産物と治療用遺伝子産物の両方をコードし得る。いくつかのそのような実施形態では、レポーター遺伝子産物及び治療用遺伝子産物の発現は、同じアプタマーによって制御され得る。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子産物及び治療用遺伝子産物の発現は、異なるアプタマーによって制御され得る。

本実施例は、ポリＡ切断を制御するために薬物誘導性選択的スプライシングの力を利用する、応答性の高い遺伝子調節機構を記載する。図１は、本開示のいくつかの実施形態の描写を提供する。図１Ａに示すように、操作された短いイントロン（ミニＩＶＳ２）及び新しいポリＡシグナル（赤色）が導入遺伝子の５’ＵＴＲにおいて人工的に作製されるとき、イントロンの効率的なスプライシング及びポリＡシグナルの切断は、ｍＲＮＡの後半の破壊をもたらし、したがって遺伝子発現の喪失をもたらす。Ｙ字型スイッチ（緑色）の一部として操作されたアプタマーへの特異的リガンドの結合は、効率的に代替のスプライシングを誘導する。リガンド誘導の選択的スプライシングは、Ｙ字型構造及び人工の５’ＵＴＲポリＡシグナルの除去をもたらす。これは次いで、インタクトなｍＲＮＡの保存、したがって誘導された遺伝子発現をもたらす。なお、第２の３’スプライス部位（３’ｓｓ）は、５’ＵＴＲ配列に構築される。この３’スプライス部位は、アプタマーに結合したリガンド（例えば、テトラサイクリン、「Ｔｃ」）の後にのみ活性化される。Ｙ構造の隣の４ＭＡＺ配列は、リガンド結合時に選択的スプライシングを強化するためのものである。

図１Ｂは、本明細書に記載される３つのアプタマーを含むポリＡスイッチの実証を提供する。それぞれのアプタマーは、Ｙ字型ＲＮＡ構造の１つのアーム上に位置する。このＹ字型の設計には、いくつかの重要な利点がある。３つのアプタマーを組み込んで、中央のスリーウェイジャンクションに戦略的に配置されたポリＡシグナル（ｐＡ）を制御する。これにより、３つの異なるアプタマーから生成されるテトラサイクリン結合効果の組み合わされた力を利用する。Ｙ字型構造はコンパクトであり、３つのアプタマーを組み込むために全体的に短い配列を必要とする。Ｙ字型構造は、ＲＮＡ生合成中に本質的に折り畳まれるように設計される。３つのアプタマーは、アプタマー間の代替的な折り畳みの可能性を最小限に抑えるために、フォワード－フォワード－リバース方向に配置される。さらに、３５ｂｐよりも長い二本鎖ＲＮＡステムは、細胞において先天的な免疫応答を誘発することが知られている。したがって、Ｙ構造内の全てのステムは、先天性免疫応答を排除するために、３５ｐｂよりも大幅に短くされる。

図１Ｃは、本明細書に記載のポリＡスイッチの核酸配列の例（Ｙ１９６ＣＡＡ）を提供する。Ｙ字型構造の全ての構成要素の効果を広範囲にプローブするように、３７０以上の構築物を設計及び試験した。これらには、（１）それぞれのアームの長さ、（２）それぞれのアームの配列、（３）それぞれのアームのループ、ならびに（４）ポリＡシグナルが配置される中央のスリーウェイジャンクションの配列及びサイズが含まれる。これらの構成要素の改変の効果については、これらの非限定的な実施例にさらに記載される。

実施例１：ポリＡ切断シグナルの調節
位置
異なる構成であり、ポリＡ切断シグナルが異なる位置に位置付けされている追加のＹ字型構造を試験するために構築物を作製した。４つの異なる構築物を作製した：ポリＡシグナル（赤色）をアプタマーＣの近くに配置し、スリーウェイジャンクションによってクランプするＢ１～Ｂ４（図２Ａ；Ｂ１構築物を示す）。これらは誘導を示さなかったか、または最小限の誘導を示した。スリーウェイジャンクション付近で、さらに４つのポリＡシグナルを有する構築物を作製した：Ｔ１～Ｔ４（図２Ｂ）。これらはまた、最小または中程度の誘導を示した。図２Ｃは、３つのアプタマーがスリーウェイジャンクションなしで互いに積み重なっているポリＡスイッチを例示する。この構成については最小限の誘導が観察された。図１Ｂに示す、ポリＡシグナルがスリーウェイジャンクションの近くに配置された特定のＹ字型の構成は、追加の試験に使用される。この構成では、スリーウェイジャンクションは異なる向きで曲がり、ポリＡシグナルをクランプするためのユニークな形状を提供する。それぞれのアームの安定性は、塩基対の数及び塩基対の組成（例えば、Ｇ－Ｃは、Ａ－ＵまたはＧ－Ｕペアよりも安定である）の２つの因子によって決定される。

ポリＡ切断シグナルの数
試験を実施して、Ｙ字型構造におけるポリＡシグナル（複数可）の最適数を評価した。図３Ａは、赤いボックスによって示される２つのポリＡシグナルを用いたＹシリーズからの３つの構造の試験を示す。Ｙ１は、これらの３つの構築物において最も高い約１２倍の誘導を示す。この群では、アーム３－１の大部分はＡ－ＵまたはＧ－Ｕペアであるため、一定の安定性に達するためにはより長いステムが必要である。図において実証されるように、本明細書に例示される構築物のアームは、二本鎖核酸ステムを含む。アームを短くすると、３－１はより低い誘導をもたらす。図３Ｂは、アームの長さの効果をさらに示す。Ｙ５～Ｙ９は、アーム３－１（青色のボックス）及びアーム２－１（緑色のボックス）の可変長を持つ１つのポリＡシグナル（赤色のボックス）のみを有する。アーム３－１及びアーム２－１の長さは、Ｙ５からＹ９まで１ｂｐずつ短くなる。この１つのポリＡ構成は、より良い誘導をもたらす。図３Ｃは、アーム１－２に２つのポリＡシグナル（Ｙ６ｍｕｔ）が連続して存在する場合、誘導が約半減することを示す。Ｙ６ｍｕｔ：２つのポリＡシグナル（赤いボックス）がアーム１－２に埋め込まれていることを除いて、Ｙ６と同じである。これらの結果に基づいて、ポリＡシグナルの最適な数及び位置が決定される：単一のポリＡシグナルが、アーム１－２及びスリーウェイジャンクションに部分的に埋め込まれている。構成は、さらなる最適化の基礎として使用される。

実施例２：スリーウェイジャンクションの最適化
スリーウェイジャンクションの環境を改変すると、ポリＡシグナルのクランプに直接影響を及ぼす。したがって、Ｙ字型スイッチの性能は、スリーウェイジャンクションの変化に非常に敏感である。最良の配列を同定するために、スリーウェイジャンクション周辺の広範な変異／挿入／欠失試験を行った。図４Ａは、おそらくこの変異が、ポリＡシグナルのクランプを締め付ける新しいＧ－Ｕ塩基ペアをアーム３－１上で生成するために、Ｙ２２におけるＵからＧへの変異が誘導を２倍にすることを示す。図４Ｂは、誘導に対する異なるスリーウェイジャンクション配列の効果を示す実施例を提供する。図４Ｃは、スリーウェイジャンクションのボックス－１に３塩基対１塩基を有する構築物を比較する。Ｙ１０７～Ｙ１１０は、ボックス１に３つの塩基を有するＹ７９の誘導体である。Ｙ１０７～Ｙ１１０は、ボックス１に１つの塩基のみを有する。Ｙ１０７はＹ７９と同様の性能を発揮し、ボックス１内の１つのペアになっていない塩基で十分であることを示している。図４Ｄは、スリーウェイジャンクションのボックス２に１つの塩基を挿入した結果を示しており、これはスリーウェイジャンクションにおけるフォールディングの微妙な変化をもたらす。結果から、最良の構成はボックス２内の１つの対形成していない塩基であることが示唆される。図４Ｅの構築物については、ボックス１及びボックス２の単一塩基をランダム化した。１６個の組み合わせを試験し、結果は、同日に試験した親Ｙ７９と比較した場合、Ｙ１２７、Ｙ１３０、及びＹ１３４がそれらの中で最良であることを示した。図４Ｆは、Ｙ１３０を基礎として用いた構築物のさらなる最適化を示す。試験した改変のいずれも、大幅な改善をもたらさなかった。図４Ｇは、ほとんど誘導の変化をもたらさなかったＹ１４３に対して行われた追加の改変を示す。図４Ｈは、Ｙ１４７に対して行われた追加の改変を示す。Ｙ１６３はＹ１４７と比較してわずかに誘導性が向上するが、Ｙ１６２はわずかに誘導性が低下する。図４Ｉは、Ｙ１６３に対して行われた追加の改変を示す。Ｙ１７７はＹ１６３と比較して誘導性が向上するが、Ｙ１７８は誘導性が低下する。図４Ｊは、Ｙ１５２に対して行われた改変を示す。これらの改変は、Ｙ１５２と比較して大幅な改善をもたらす。特に、Ｙ１６６は誘導が２倍近くになる。Ｙ１６６は、さらなる最適化のための新たなベースとなる。図４Ｋは、Ｙ１６６に対して行われた追加の改変を示す。これらの改変は、Ｙ１６６と比較して大幅な改善をもたらす。また、最適化のための新しいベースとしても機能する。

Ｙ１７４、Ｙ１７５、Ｙ１７６、及びＹ１７７（図４Ｌを参照されたい）は、最良のスリーウェイジャンクション配列のうちの１つである。これらの構築物は全て、ボックス１及びボックス２中に単一の塩基ＣまたはＡを有する。これらの構築物において、ポリＡシグナルＡＡＵＡＡＡ（赤色ボックス）の最初の３塩基は、スリーウェイジャンクションのポケットに開いている。ポリＡシグナルの最後の２つの塩基は、アーム１－２に埋め込まれる。

スリーウェイジャンクションのポケットに対するポリＡシグナルの位置を変更すると、誘導能力を変化させることができる（図５）。Ｙ１３５～Ｙ１４０では、Ｙ１０１に対して、スリーウェイジャンクションのポケットをポリＡシグナルに沿って移動させる。その結果、ポリＡシグナルはアーム１－２の奥深くに埋め込まれる。これらの改変は、より低い誘導をもたらす。Ｙ１０１の誘導体であるＹ１０１ｍｕｔは、潜在的な３’スプライス部位を除去する、アーム２－１内の反転Ｃ－Ｇペア（赤い矢印で示される）を含む。構築物Ｙ１４１～Ｙ１５９はＹ１０１ｍｕｔに基づく。スリーウェイジャンクションポケットは、ポリＡシグナルに沿って移動される。スリーウェイジャンクションポケットをポリＡシグナルに沿って移動させた誘導結果を図５の最後の部分に示す。

実施例３：二本鎖ステム
本明細書に記載のポリＡアプタマーポリヌクレオチド構築物は、核酸（例えば、ＲＮＡ）二本鎖ステムを含む。このような二本鎖領域は、本開示ではアームとも称される。長さ、安定性、及びヌクレオチド組成物の改変は、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの強度及び有効性に影響を及ぼし得る。

以前の結果（構築物Ｙ１～Ｙ９を使用した、図３）は、アーム３－１の安定性が一定の範囲内である必要があることを示した。アーム３は、ポリＡシグナルに非常に近いため、非常に敏感な領域である。アーム３の安定性のわずかな変化は、ポリＡシグナルクランプの有意な変化をもたらし得るため、誘導をもたらす。Ｙ３５をベースに、アーム３を最適化するために多くの改変を行った。図６Ａ～６Ｂは、アーム３の変化に基づく誘導変動を示す。これらの図において、親構築物は右側にあり、改変の結果は左側に示される。図６Ａは、アーム３－１の改変の結果を示す。アーム３－２の強度が低下した構築物Ｙ４３～Ｙ４５は、Ｙ３５に基づく。アーム３－２の強度が低下した構築物Ｙ１８８Ｃ及びＹ１８９Ｃは、Ｙ１７５に基づく。アーム３－２の強度が低下した構築物Ｙ１８８Ｄ及びＹ１８９Ｄは、Ｙ１７６に基づく。様々な場所でＧ－ＣペアをＧ－Ｕペアに変更することによって、より弱い強度のアーム３－２を有する構築物Ｙ２１９Ａ～２２４Ａは、Ｙ１９７に基づく。図６Ｂは、アーム３－２の改変の結果を示す。構築物Ｙ２０１～Ｙ２０３はＹ１７５に基づく。より弱いアーム３－２を持つ構築物Ｙ２１６Ｂ～２１７ＢはＹ２０８に基づく。結果は、アーム３－２の長さを増大させ、ループ配列を変化させることが、誘導を大幅に低減することを示す。

これらの改変の大部分は誘導を有意に低減させ、いずれもＹ３５を上回るものではない。したがって、Ｙ３５のアーム３は、試験したもののＹ字型構造の最適なアーム３配列を表す。Ｙ１７５、Ｙ１９７、及びＹ２１０等の、アーム３改変に使用されるいくつかの他の親構築物は、全て、Ｙ３５の同一のアーム３配列を共有する。

アーム２（すなわち、アーム２－１及びアーム２－２）である二本鎖ステムへの改変は、アーム２の安定性を変化させる。この改変には、長さ、配列の変化、ならびにステムにミスマッチを生じさせる点変異が含まれる（図７）。図７Ａは、アーム２－２の改変の結果を示す。構築物Ｙ４８～Ｙ５３はＹ３５に基づく。図７Ｂは、アーム２－１改変の結果を示す。これらの改変の結果は、誘導が、アーム３のものと比較して、アーム２の安定性の変化に対して感受性が低いことを示す。これは、そのアーム２がポリＡシグナルに直接接続されていないためであると推測される。それにもかかわらず、アーム２は、良好な誘導を達成するために特定のレベルの安定性を必要とする。不安定なアーム２は、非常に低い誘導をもたらす。これらの結果に示されるアーム２の配列を経験的に決定する。アーム２配列のいくつかは、すでに最適な安定性範囲内にあり、非常に効率的な誘導をもたらすほぼ最適な配列を表す。安定性のさらなる増加は、誘導を増加または減少させる。

図８は、様々な改変のアーム１－２の結果を示す。図９は、アーム１－１の様々な改変の結果を示す。

実施例４：アプタマーの方向
他のアプタマーと比較したそれぞれのアプタマーの方向は、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドの機能の効果を有し得る。図１０Ａは、アプタマーＢの向きが逆である、Ｙ３５に基づく構築物Ｙ５４～Ｙ５７の結果を示す。アプタマーＢの方向を反転させることは、誘導をほとんど排除する。図１０Ｂは、アプタマーＡの向きが逆である、Ｙ１９６ＣＡＡに基づく構築物Ｙ２４０～Ｙ２５２の誘導結果を示す。アプタマーＡの方向を逆転させることは、アーム１－２の長さに関係なく、誘導を完全に排除する。

実施例５：それぞれのアプタマーの誘導への寄与
図１１Ａは、Ｙ字型構造のそれぞれのアプタマーの誘導への寄与を示す。Ｙ字型構造のそれぞれのアプタマーは、そのリガンドテトラサイクリンへの結合を排除する結合ポケット内のＡからＣの変異（矢印）によって無効にすることができる。ＮＡ：アプタマーＡは無効である。ＮＢ：アプタマーＢは無効である。ＮＣ：アプタマーＣは無効である。ＮＡＢ：アプタマーＡ及びＢは無効である。ＮＢＣ：アプタマーＢ及びＣは無効である。ＮＡＣ：アプタマーＡ及びＣは無効である。これらの結果は、アプタマーＣが最終誘導に最も大きく寄与することを示す。この後、アプタマーＢ、次いでアプタマーＡが続く。

図１１Ｂは、Ｙ字型構造からアプタマーＡを除去する効果を示す。ボックスは、それぞれの構築物について除去された配列を示す。アプタマーＡを除去することは、親Ｙ１９６ＣＡＡと比較してレベルが有意に低減するが、中程度の誘導を保持する。

実施例６：５’ＵＴＲの改変
図１２Ａは、５’ＵＴＲにＣＡＡリピート（下線）を挿入することにより、誘導レベルを変化させることができることを実証する。ここで、Ｙ１９６、Ｙ２０８、Ｙ２０９、及びＹ２１１にＣＡＡリピートを挿入することは、全て、より高い誘導をもたらす。Ｙ３０１の５’ＵＴＲにＣＡＡリピートを含むスペーサー配列を挿入すると、誘導に対する可変効果がもたらされる。これらのスペーサー配列は、互いにわずかに異なるに過ぎないが、誘導の大きな差異をもたらし、この領域が変化に非常に敏感であることを示す。図１２Ｂは、Ｓ５６を親構築物として使用した、強力な３’スプライス部位を有する新しい５’ＵＴＲ配列の試験のいくつかの例を示す。図１２Ｃは、ＣＡＡリピートを使用せずに翻訳開始ＡＴＧの近くの５’ＵＴＲに本質的に非構造化ＲＮＡ配列を付加した結果を示す。これらの構築物は、Ｙ３００及びＹ３０５に基づく。Ｙ３００ベースの構築物の中では、Ｙ３２９が最も優れている。Ｙ３０５の性能を上回るものではないが、ＣＡＡリピートを使用しないという利点がある。図１２Ｄは、ＣＡＡリピートの挿入位置が誘導にも著しく影響することを示す。

実施例７：Ｇクワッド配列の重要性
我々は、誘導に対するＧ－クワッド配列の効果を試験した。図１３Ａは、親としてＹ１９６ＣＡＡを使用した２ＭＡＺと比較して、３ＭＡＺまたはＣＤ４４のＧ－クワッドが同様の誘導レベルに達することを示す。しかしながら、４ＭＡＺは、選択的スプライシングを効果的に誘導する能力により、誘導を劇的に倍増させた。図１３Ｂは、Ｓ５６構築物を親として使用して、４ＭＡＺのＧ－クワッドを置き換えるために異なるＧ－クワッド配列を試験したときの誘導結果を示す。これらの構築物において、４ＭＡＺは、１つのＣＤ４４のＧ－クワッド「ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴ」（Ｓ１７７）、２つのＣＤ４４のＧ－クワッド「ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴ」（Ｓ１７８）、または４つのＣＤ４４Ｇ－クワッド「ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴ」（Ｓ１７９）によって置き換えられる。結果は、４ＭＡＺの効果が独自であり、他のＧ－クワッド配列によって置き換えることができないことを示す。４ＭＡＺ配列は、独自の特性を有し、効率的なポリＡシグナル切断とＴｃ誘導選択的スプライシングの両方を必要とするハイブリッドスイッチの重要な要素である。図１４は、４ＭＡＺ配列の重要性をさらに示す。ＲＴ－ＰＣＲは、薬物誘導性選択的スプライシングの機構を明らかにした。Ｔｃの非存在下では、ＩＶＳ２スプライシングＲＮＡはポリＡ切断によって分解される（レーン１及び３）。Ｔｃの存在は、Ｙ１９６ＣＡＡ－２ＭＡＺとＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの両方において選択的スプライシングを誘導する（レーン２及び４）。サンガー配列決定は、Ｔｃ誘導バンド（下位バンド）が、予想される選択的スプライスＲＮＡジャンクションを含むことを確認した。Ｔｃ誘導選択的スプライシングは、Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺにおいて、Ｙ１９６ＣＡＡ－２ＭＡＺと比較してはるかに顕著である（レーン４対２）。この誘導された選択的スプライシングでは、Ｔｃの存在下でポリＡシグナルとＹ字型構造の両方が除去され、タンパク質発現の誘導が有意に増加する。

実施例８：第１の３’スプライスアクセプター部位の調節
Ｔｃ誘導選択的スプライシングの機構をさらに最適化するために、ＩＶＳ２の３’スプライス部位位置及び周囲配列／構造の効果を広範囲にプローブした。改変としては、ＩＶＳ２３’スプライス部位をアーム１に埋め込むこと、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をアプタマー結合部位よりも近くまたは遠くに移動させること、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をアーム１の緩いバルジに入れること、ＩＶＳ２の３’スプライス部位を宿主とするアーム１の長さまたは安定性を変更すること、ＩＶＳ２の３’スプライス部位のスプライシング強度を変更することが挙げられる。図１５Ａは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位をＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺ（Ｓ１－Ｓ４）のアーム１－１内に徐々に移動させた結果を示す。また、ＩＶＳ２の３’スプライス部位がＣＡＧからＣＣＣに変異した場合（Ｓ５）、誘導がほぼ排除されることも示されている。図１５Ｂは、ＩＶＳの３’スプライス部位がアプタマーＡのＴｃ結合ポケット（赤矢印；Ｓ９）の近くのアーム１－１に完全に埋め込まれると、このスプライス部位が強く阻害され、非常に低い誘導をもたらすことを示す。これは、アプタマーによるＩＶＳ２の３’スプライス部位のクランプが強すぎないことを示す。さらに、アプタマーＡの配列（Ｓ９ｍ）の一部を欠失させることによって、アプタマーＡのクランプ効果を減少させることで、誘導を回復させる。ＩＶＳの３’スプライス部位をＳ９ｍのアーム１に沿って移動させると、親Ｓ９ｍと比較して短く、同様の誘導レベルを有するＳ１９をもたらす（図１５Ｃ）。図１５Ｄは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位ＣＡＧがアーム１－２のバルジ内に配置されるときの誘導に対する影響を示す。Ｓ４７～Ｓ５０はＳ１９に基づく。１ｕｇ／ｍＬのＴｃでは、それらのほとんどはより低い誘導をもたらす。５ｕｇ／ｍＬのＴｃでは、Ｓ５０を除いてＳ１９と同様またはより高い誘導をもたらす。図１５Ｅは、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の後の塩基を変異させることによるスプライシングの予測強度の変化の結果を示す。ＩＶＳ２の３’スプライス部位の強度を変更しても、Ｓ９ｍベース及びＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺベースの構成における誘導は著しくは変化しない。図１５Ｆは、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位をステムのさらに内または離れて移動させた結果を示し、これらは全て、より低い誘導をもたらす。図１５Ｇは、最高の性能を有する配列を選択するための、ミニＩＶＳ２の３’スプライス部位のＣＡＧ後の３つの塩基のランダム化による効果を示す。この構築物群（特に、Ｙ３６２、Ｙ３６６、及びＹ３６７）は、Ｙ３００及びＹ３０１の性能を上回る優れた切替効率を示した。試験によって同定された最良のＮＮＮ配列：Ｙ３４４ベース：Ｙ３５９（ＣＡＴ）、Ｙ３６０（ＴＴＴ）、Ｙ３６１（ＴＧＡ）、Ｙ３６２（ＴＣＴ）；Ｙ３５８ベース：Ｙ３６３（ＣＡＴ）、Ｙ３６６（ＴＡＣ）、Ｙ３６７（ＴＴＴ）

実施例９：５’ＵＴＲにおける第２の３’スプライスアクセプター部位の調節
アッセイを行い、５’ＵＴＲ中の第２の強度３’スプライスアクセプター部位を調節する効果を試験した。４ＭＡＺの後及び開始コドンＡＴＧの前に位置するＹ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺの５’ＵＴＲ配列は、以下の配列を有する：

追加の分岐点（Ｓ１０）、ｐｐｔ（Ｓ１１）を付加すること、またはＣＡＧをＣＣＣ（Ｓ１２）またはＡＡＧ（Ｓ１３）に変異させることはいずれも、誘導の低減をもたらす（図１６Ａ）。正しい３’スプライス部位（ＩＶＳ２の３’スプライス部位）を、Ｔｃの非存在下で、及びＴｃの存在下で（第２の選択的３’スプライス部位）、活性化するために、短いイントロンを開始点とする構築物を使用し、ランダム化アプローチを使用して、５’ＵＴＲ（ＴＡＧＮＮＮ）内のＴＡＧの後の最良の３塩基を選択し、誘導を改善した（図１６Ｂ）。また、これらの最良の３塩基（ＮＮＮ）をＹ３２９の５’ＵＴＲに挿入して、性能を評価した（図１６Ｃ）。これらの中で、Ｙ３４４は最も優れた性能を発揮した。

実施例１０：イントロンサイズ
ＩＶＳ２イントロンのサイズを縮小することにより、ハイブリッドスイッチ全体のサイズを縮小させる効果を試験した。図１７Ａは、例示的なイントロン配列を示す。構築物Ｓ１６４～Ｓ１６８は、Ｓ１５９～Ｓ１６３と同様であるが、ＩＶＳ２の３’スプライス部位の前の同じ位置に分岐点ＴＡＣＴＡＡＣが挿入されている。Ｓ１６４のイントロン配列を例として示す。

構築物Ｓ１６９～Ｓ１７３は、Ｓ１５９－Ｓ１６３と同様であるが、分岐点ＴＡＣＴＡＡＣ及びＩＶＳ２の３’スプライス部位の前の同じ位置に挿入されたさらに１つの３’スプライス部位ＣＡＧを有する。Ｓ１６９のイントロン配列を例として示す。

ＩＶＳ２イントロンサイズを４７６塩基から１２０～２００塩基に減少させると、誘導が著しく低減した（図１６Ｂ）。ＩＶＳ２イントロンスプライシングを強制するために異なるスプライシングエレメントを付加したＹ１６４～Ｙ１７３からの結果は、それらの付加されたエレメントを含まないものと比較してさらに低い誘導をもたらす。これは、ＩＶＳ２イントロンにエレメントを短縮または付加することにより、Ｔｃの存在下で３’スプライス部位活性化の選択が変化することを示す。以前に、我々は、ＣＡＡリピートが５’ＵＴＲにおける３’スプライス部位のスプライシング強度を変化させることを示した。ここで、ＣＡＡリピート（赤色）は、Ｓ１５９、Ｓ１６４、及びＳ１６９から除去される。Ｓ５６と比較して、Ｓ１９２（１２０塩基のイントロンを有する）は、１ｕｇ／ｍＬのＴｃでより優れた誘導をもたらし、５ｕｇ／ｍＬのＴｃで同様の誘導をもたらした。更なる改変のための新たなベースとして、イントロンの短縮によりコンパクトなＳ１９２が用いられる。

実施例１１：上流フレーム外ＡＵＧ（μＯＲＦ）の付加
フレーム外上流ＡＵＧを導入して、ＩＶＳ２スプライシング転写産物からのレポーター遺伝子翻訳に対する効果を試験するために、構築物Ｓ１９２を導入した。改変は以下を含む：（１）ＩＶＳ２の３’スプライス部位の直後でＴＡＣをＡＴＧに変更して新たな開始コドン（赤いボックス）を作製すること、（２）ステムにおける塩基対形成を維持するためにアーム１の反対側の対応する塩基を変更すること、ならびに（３）フレーム内停止コドンｔｇａをアーム２－１のａｇａに変異させること（赤い矢印）により、この新たなＡＴＧからの翻訳は、かなり長いタンパク質を作製することができるようになること。図１８Ａを参照されたい。

ＩＶＳ２の３’スプライス部位ＣＡＧ後の配列を示す。新しいμＯＲＦは下線が付される。

このアプローチは、ＩＶＳ２スプライシング転写産物からの漏出発現を著しく低下させ、したがって、Ｓ２０６の結果によって実証されるように、誘導を著しく増加させる。

この構築物は、Ｓ２０６に基づいて５’ＵＴＲ配列を微調整することによってさらに最適化される（図１８Ｂ）。これらの構築物は全て、非常に良好な誘導を示す。これらの構築物は、より短いイントロン及び部分的に欠失したアプタマーＡのためによりコンパクトであり、１ｕｇ／ｍＬの低いＴｃ濃度で非常に良好に機能し、５ｕｇ／ｍＬで約７００倍という高い誘導に達する。

要約すると、ＩＶＳ２の３’スプライス部位と選択的３’スプライス部位との間のスプライシング選択に対するＴｃ効果を最適化するプロセスにおいて、ＩＶＳ２の３’スプライス部位を配置するための最良の位置は、Ｙ構造のアーム１内にそれを埋め込むことであることを見出した。ＩＶＳ２の３’スプライス部位をその位置に配置するために、アプタマーＡをＹ構造から欠失させる。ＩＶＳ２スプライシング転写産物からのレポーター遺伝子翻訳を排除する上流フレーム外ＡＵＧ（μＯＲＦ）を作製することは、漏出発現を減少させる。Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺと比較して、Ｓ２２２（図１７Ｃ）は、より低い薬物濃度でより高い倍率での誘導、より高い遺伝子発現レベル、及びおそらくより重要であるが、Ｓ２２２は、Ｔｃに対して非常に感受性が高く、低いＴｃ濃度で良好に機能する。

構築物の性能
図１９Ａは、Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺに対する代表的なＳシリーズ構築物の性能の比較を示す。図１８Ｂは、顕微鏡検査によって可視化したハイブリッドスイッチ構築物からの発現の用量反応を示す。

上流のオープンリーディングフレーム（μＯＲＦ）のタンパク質翻訳によって生じる潜在的な免疫原性を回避するために、Ｓ２２２の性能を上回ることを目的としたμＯＲＦなしの別のハイブリッドスイッチを構築した。この新しいハイブリッドスイッチを構築するために、Ｓ２２２には２つのアプタマーと比較して３つのアプタマーがあるため、Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺ設計に戻った。Ｙ１９６ＣＡＡ－４ＭＡＺをさらに改善するために、（１）１２０塩基を有するミニＩＶＳ２イントロンを使用し、（２）ミニＩＶＳ２配列の３’スプライス部位を最適化し、（３）下流の選択的３’スプライス部位を含む５’ＵＴＲ配列を最適化する。これらの努力により、一群の構築物は性能的にＳ２２２を上回ることとなった。テトラサイクリンによる誘導は、０．５～１μｇ／ｍｌという低い薬物濃度で遺伝子発現を最大レベルの５０％（ＥＣ_５０）まで誘導するほど効率的である。このテトラサイクリン濃度は、ＦＤＡが承認した投与量を使用してヒト血清で日常的に達成することができ、いずれかのＲＮＡベースの遺伝子調節技術を使用して以前に達成されたものよりも低い桁である。図１９Ｃは、これらの新しい構築物の性能をＳ２２２の性能と比較することを示す。Ｙ３００の５’ＵＴＲ配列：

Ｙ３０１：５’ＵＴＲを改変したＹ３００をベースに基づく

図１９Ｄは、ルシフェラーゼアッセイによって決定されるＹ３６２及びＹ３６７の性能を示す。図１９Ｅは、ｅＧＦＰレポーターシグナルを使用した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって決定される、Ｙ３６２及びＹ３６７の１ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンに対する応答を示す。全ての結果における「誘導倍率」を、テトラサイクリンの存在下対非存在下での導入遺伝子発現の比率として計算した。

実施例１２：内因性部位におけるリボスイッチの挿入
Ｙ字型ポリＡスイッチは、ＣＲＩＳＰＲと組み合わせると、哺乳動物ゲノムにおける任意の内因性遺伝子の発現を制御するための強力な技術プラットフォームを作り出す。図２０は、原理を実証するために幹細胞膜タンパク質であるＣＤ１３３を使用する概略図を提供する。内因性ＣＤ１３３の条件的遺伝子発現は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及び修復マトリックスを使用して、ＣＤ１３３の５’ＵＴＲにＹ１９６リボスイッチを挿入することによって達成される。図２０Ａ上部：３つのｇＲＮＡ（ｇ１、ｇ２、及びｇ３）を用いて、ＣＤ１３３の翻訳開始付近のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断の位置を特定する。図２０Ａ下部：ＣＤ１３３に上流及び下流の相同配列に隣接するミニＣＭＶプロモーター、ＩＶＳ２イントロン、及びＹ１９６リボスイッチを含む修復マトリックスを修復に使用する。図２０Ｂは、実験手順の概略図を提供する。Ｙ１９６リボスイッチを、まず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって、親ＣＤ１３３^－細胞に挿入した。次に、正常に操作された細胞は、用量依存的様式でＴｃに応答してＣＤ１３３発現をオンにする。ＣＤ１３３タンパク質に対するＦＩＴＣコンジュゲート抗体を使用して、Ｔｃに応答する細胞を標識し、単離した。図１９Ｃは、内因性ＣＤ１３３の条件的発現がＴｃによって調節されたことを示す。遺伝子操作細胞クローン（この場合は２９３Ｔ細胞）におけるＣＤ１３３の発現は、バックグラウンド漏出をほとんどまたは全く示さなかった。ＣＤ１３３発現は、Ｔｃによって特異的に誘導されるが、その類似体Ｄｏｘｙによっては誘導されない。ＮＤ：薬物処理なし、Ｔｃ：テトラサイクリン、Ｄｏｘｙ：ドキシサイクリン。細胞クローンを、薬物を伴って、または薬物なしで２日間処理し、次いでフロー分析のために収穫した。Ｘ軸は、個々の細胞の抗体染色の強度を示した。図２０Ｄは、予想通り、Ｔｃによって誘導されたＣＤ１３３タンパク質（ＦＩＴＣ－抗ＣＤ１３３抗体によって明らかにされるように）を、正常な内因性ＣＤ１３３タンパク質と同様に、細胞膜に局在化したことを示す。安定した細胞クローンを、２μｇ／ｍｌの薬物で２日間、または薬物なしで処理し、次いで、画像フロー分析（Ａｍｎｉｓ）のために収穫した。同様に、誘導は明らかにＴｃに特異的であるが、Ｄｏｘｙには特異的ではない。

記載されるデータは、ポリＡ切断を制御するために薬物誘導性選択的スプライシングの力を利用する、応答性の高い遺伝子調節機構を提供する。操作された組み合わせは、低分子薬物によって制御され得る感受性ＲＮＡベースのスイッチを作製し、哺乳動物細胞における遺伝子発現の緊密な調節を可能にする。他の報告された方法とは対照的に、本明細書に記載のこのハイブリッドスイッチ技術は、非常に低い漏出性発現を示し、ヒト細胞における７００倍近くの導入遺伝子発現を効果的にオンにする。さらに、テトラサイクリンによる誘導は、０．５～１μｇ／ｍｌという低い薬物濃度で遺伝子発現を最大レベルの５０％（ＥＣ_５０）まで誘導するほど効率的である。このテトラサイクリン濃度は、ＦＤＡが承認した投与量を使用してヒト血清で日常的に達成することができ、他のＲＮＡベースの遺伝子調節技術を使用して以前に達成されたものよりも低い桁である。

したがって、このハイブリッドスイッチ技術は、治療用遺伝子または導入遺伝子の発現を制御するためにヒト患者において使用することが有利に安全である。したがって、本開示は、ヒトの摂取に安全な薬物濃度で細胞内の目的の遺伝子を調節するための高効率かつ非免疫原性技術を提供する当該技術分野における長年の要望を満たす。

実施例１３：３箇所での単一塩基変化の組み合わせ
Ｙ字型構造の配列に対する３つの塩基変化の組み合わせを試験し、ポリＡアプタマーの誘導性能に対する累積効果を決定した。図２１に記載されるように、３つの変異は、アーム１－１における「Ａ」欠失、アーム２－２における非対形成切断を閉じるための「Ａ」から「Ｇ」への変化、及びポリＡシグナルの前のスリーウェイジャンクションにおける「Ａ」挿入からなる。これらの変異は、ミニＩＶＳ２イントロンの後方に異なる塩基を有する４つの異なる親構築物を使用して実施した。全てにおいて、表１に記載されている１２個の構築物は、累積効果をプローブするように設計されている。

図２２は、３つの単一塩基変化の組み合わせが、低い薬物濃度で誘導を有意に増加させることを実証している。さらに、図２３Ａ及び２３Ｂは、構築物Ｙ３６２及びＹ３８７の用量反応分析を示す。Ｙ３６２及びＹ３８７は、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリンのみを使用して、２９３Ｔ細胞における最大６５０～７００倍の導入遺伝子発現を効果的にオンにする。両方の構築物について、テトラサイクリンによる誘導が、ＥＣ_１００参照としての最大誘導倍率を使用して、０．５～１μｇ／ｍｌのＴｃという低いレベルで、最大レベルの５０％（ＥＣ_５０）に達することを示す（図２３Ａ）。ＥＣ_１００参照としての親構築物（同様の配列を有するが、Ｙ字型構造を有しないＨＤＭ－Ｌｕｃ）の最大発現レベルを使用した計算も、０．５～１．２μｇ／ｍｌという低さで、同様のＥＣ_５０値を示す（図２３Ｂ）。Ｙ３８７は、使用されるＥＣ_１００参照にかかわらず、０．５μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を示すため、特に効果的な設計である。

実施例１４：方法
本明細書に提出された図に記載されているアッセイを以下のように行った：

ルシフェラーゼアッセイ
細胞を、２５０００～３００００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間のインキュベートの後、それぞれのウェルを５０ｎｇのＤＮＡベクターでトランスフェクトし、テトラサイクリンを含まないか、または様々な濃度を含む地と共にさらに１８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いて相対光単位（ＲＬＵ）で測定した。３６ｍＬのアッセイ緩衝液を作製するために、１４４μＬの１ＭのＤＴＴ、１０８μＬの０．１ＭのＡＴＰ、２５２μＬの０．１Ｍのルシフェリン、及び３６０μＬの０．０５ＭのＣｏＡを３５ｍＬの基本緩衝液（２５ｍＭのトリシン、０．５ｍＭのＥＤＴＡ－Ｎａ_２、０．５４ｍＭのＮａ－三リン酸塩、１６．３ｍＭのＭｇＳＯ４．７Ｈ_２Ｏ、及び０．８％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に添加した。細胞培地を除去した後、４０μＬのアッセイ緩衝液をそれぞれのウェルに添加し、ルシフェラーゼ活性をＰｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダーで２回読み取った。誘導倍率を、テトラサイクリンの存在下対非存在下での導入遺伝子発現の比率として計算した。

ＲＴ－ＰＣＲ
それぞれの構築物でトランスフェクトした細胞を、テトラサイクリンの非存在下または存在下で、培地中で３７℃で１８時間増殖させた。ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）ＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）と共に供給されるプロトコールに従って全ＲＮＡを単離した。ＲＴ－ＰＣＲについては、製造業者のプロトコールに従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＲＴを行い、転写物及びレポーター遺伝子の開始を標的とするプライマーを用いてＰＣＲを行った。

蛍光顕微鏡
細胞を１２ウェルプレートに、１．２×１０^５細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間のインキュベートの後、それぞれのウェルを５００ｎｇのＤＮＡベクターでトランスフェクトし、テトラサイクリンを含まないか、または様々な濃度を含む地と共にさらに１８時間インキュベートした。蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ＣＦＬ）で２００倍の倍率で画像を撮影した。

実施例１５：例示的な構築物配列
以下の配列は、本明細書に記載のシステムの構成要素の実施形態の追加の例である。配列は、ＲＮＡアプタマーの成分を転写するときのＤＮＡ配列として提供される。
＋１：転写開始
ブラック：５’リーディングＲＮＡ配列
下線：ＩＶＳ２イントロンまたはミニＩＶＳ２イントロン
太字：Ｙ字型ポリＡスイッチ（４ＭＡＺに下線を付す）
斜体：５’ＵＴＲ
ＡＴＧ：太字は翻訳開始

均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に記述されるようなものである。

Claims (61)

1. 遺伝子発現を調節するためのシステムであって、５’から３’の方向で、
   ａ）５’スプライスドナー部位と、
   ｂ）操作されたイントロンと、
   ｃ）第１の３’スプライスアクセプター部位と、
   ｄ）１つ以上のリガンド結合ポケットを有する２つ以上のリガンド結合アプタマー、及びその中に少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを含むポリＡスイッチと、
   ｅ）第２の３’スプライスアクセプター部位と、
   ｆ）発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列と、を含む、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドを含む、前記システム。
2. 前記ポリＡスイッチが、２つのリガンド結合アプタマーを含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記ポリＡスイッチが、３つのリガンド結合アプタマーを含む、請求項１に記載のシステム。
4. 前記ポリＡスイッチが、スリーウェイジャンクションを含む、請求項１に記載のシステム。
5. 前記スリーウェイジャンクションが、第１の二本鎖ＲＮＡステム、第２の二本鎖ＲＮＡステム、及び第３の二本鎖ＲＮＡステムのジャンクションを含む、請求項４に記載のシステム。
6. 前記第１の二本鎖ＲＮＡステムがリガンド結合アプタマーを含まない、請求項５に記載のシステム。
7. 前記第１、前記第２、及び前記第３の二本鎖ＲＮＡステムのそれぞれが、リガンド結合アプタマーを含む、請求項５に記載のシステム。
8. 前記スリーウェイジャンクションが少なくとも１つの一本鎖領域を含む、請求項５に記載のシステム。
9. 前記スリーウェイジャンクションが、第１の一本鎖領域、第２の一本鎖領域、及び第３の一本鎖領域を含む、請求項８に記載のシステム。
10. 前記第１の一本鎖領域が、前記第１の二本鎖ＲＮＡステムと前記第２の二本鎖ＲＮＡステムとの間に位置する、請求項９に記載のシステム。
11. 前記第２の一本鎖領域が、前記第２の二本鎖ＲＮＡステムと前記第３の二本鎖ＲＮＡステムとの間に位置する、請求項９に記載のシステム。
12. 前記第３の一本鎖領域が、第１のアプタマーの前記第３の二本鎖ＲＮＡステムと前記第１の二本鎖ＲＮＡステムとの間に位置する、請求項９に記載のシステム。
13. 前記第１のアプタマー及び第２のアプタマーが、５’から３’の方向で、同じ方向にある、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム。
14. 第３のアプタマーが、５’から３’の方向で、前記第１のアプタマー及び前記第２のアプタマーとは反対の方向にある、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム。
15. 前記ポリＡ切断シグナルの１つ以上のヌクレオチドが、スリーウェイジャンクション、第３の二本鎖ＲＮＡステム、第３の一本鎖領域、または第１の二本鎖ＲＮＡステム内にある、請求項１に記載のシステム。
16. 前記第３の一本鎖領域が、前記ポリＡ切断シグナルの最初の４つの塩基を含む、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記第１の二本鎖ＲＮＡステムが、前記ポリＡ切断シグナルの最後の２つの塩基を含む、請求項１５に記載のシステム。
18. 前記第１の二本鎖ＲＮＡステムが、前記ポリＡ切断シグナルの全体を含む、請求項１５に記載のシステム。
19. 第３のアプタマーの結合ポケットとスリーウェイジャンクションとの間の二本鎖ＲＮＡステムが、１０～１５塩基対の長さである、請求項３に記載のシステム。
20. 前記第１の一本鎖領域が、Ｃ及びＡから選択される少なくとも１つの塩基を含む、請求項１０に記載のシステム。
21. 前記第２の一本鎖領域が、Ｃ及びＡから選択される少なくとも１つの塩基を含む、請求項１１に記載のシステム。
22. 前記第２の二本鎖ＲＮＡステムの配列が、配列番号３である、請求項５に記載のシステム。
23. 前記第３の二本鎖ＲＮＡステムの配列が、配列番号２である、請求項５に記載のシステム。
24. 前記第１の二本鎖ＲＮＡステムの配列が、配列番号４である、請求項５に記載のシステム。
25. 前記第１の二本鎖ＲＮＡステムの配列が、配列番号５である、請求項５に記載のシステム。
26. 前記発現可能なポリペプチドをコードする前記核酸配列が、５’ＵＴＲをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
27. 前記５’ＵＴＲが、ＣＡＡリピートをさらに含む、請求項２６に記載のシステム。
28. 前記５’ＵＴＲが、１つ以上の３’スプライスアクセプター部位をさらに含む、請求項２６に記載のシステム。
29. 操作された５’ＵＴＲが、配列番号４８の配列を有する、請求項２６に記載のシステム。
30. 前記発現可能なポリペプチドをコードする前記核酸配列の５’かつ前記ポリＡ切断シグナルの３’に、Ｇ－Ｕリッチ領域をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
31. ３’アクセプター部位に、選択的スプライシングの強度を調節する核酸トリプレット配列が続く、請求項２９に記載のシステム。
32. 前記核酸トリプレットが、前記５’ＵＴＲにおける第２の３’アクセプター部位に対して３’にあり、ＴＡＧ、ＴＣＴ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＣＣ、ＡＣＡ、ＡＡＣ、ＡＣＣ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＣＣＴ、及びＣＣＣから選択される配列を有する、請求項３１に記載のシステム。
33. 前記発現可能なポリペプチドをコードする前記核酸配列の５’かつ前記Ｇ－Ｕリッチ領域の３’に、Ｇリッチ領域をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
34. 前記Ｇリッチ領域が、４個のＭＡＺ配列を含む、請求項３３に記載のシステム。
35. 前記操作されたイントロンが、１００～２００塩基の長さの配列を有する、請求項１に記載のシステム。
36. 前記操作されたイントロンが配列番号１の配列を有する、請求項１に記載のシステム。
37. 前記操作されたイントロンに、イントロンスプライシングの強度を調節する核酸トリプレット配列が続く、請求項１に記載のシステム。
38. 前記核酸トリプレット配列が、ＴＴＴ、ＴＧＡ、ＴＣＴ、ＴＡＣ、ＣＡＣ、及びＣＡＴから選択される、請求項３７に記載のシステム。
39. 前記システムが、配列番号６～配列番号５６の群から選択される配列を含む、請求項１に記載のシステム。
40. 前記システムが、配列番号６、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６の群から選択される配列を含む、請求項３９に記載のシステム。
41. 請求項１に記載のシステムの送達のためのベクター。
42. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４１に記載のベクター。
43. 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される、請求項４２に記載のベクター。
44. 細胞における遺伝子産物の発現を調節するための方法であって、
    前記細胞に、５’から３’の方向で、
    ａ）５’スプライスドナー部位と、
    ｂ）操作されたイントロンと、
    ｃ）第１の３’スプライスアクセプター部位と、
    ｄ）１つ以上のリガンド結合ポケットを有する２つ以上のリガンド結合アプタマー、及びその中に少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを含むポリＡスイッチと、
    ｅ）第２の３’スプライスアクセプター部位と、を含むシステムを導入するステップを含む、前記方法。
45. 前記遺伝子産物が前記細胞に対して外因性である、請求項４４に記載の方法。
46. 前記システムが、前記ｅ）のスプライス部位のすぐ３’に、前記遺伝子産物をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
47. 前記遺伝子産物が前記細胞に対して内因性である、請求項４４に記載の方法。
48. 前記方法が、内因性遺伝子産物の発現を阻害するためにリガンドを投与することを含まない、請求項４７に記載の方法。
49. 前記システムが、前記ａ）のスプライス部位の５’にプロモーターをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
50. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項４９に記載の方法。
51. 前記方法が、個体の１つ以上の細胞において生じ、前記リガンドがグルコースであり、前記個体が、糖尿病、糖尿病前症、または糖尿病による合併症を有し、及び／または発現可能なポリヌクレオチドがインスリンである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
52. 前記方法が、個体の１つ以上の細胞において生じ、前記リガンドが、がんバイオマーカーの遺伝子産物であり、前記発現可能なポリヌクレオチドが自殺遺伝子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記方法が、個体において生じ、前記発現可能なポリヌクレオチドがレポーター遺伝子であり、前記レポーター遺伝子の発現の位置及び／または強度が、前記個体の１つ以上の細胞におけるリガンドの空間分布、時間変動、またはその両方に関する情報を提供する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
54. 前記方法が、個体、組織、または細胞において生じ、前記発現可能なポリヌクレオチドが検出可能な遺伝子産物をコードし、前記個体、前記組織、または前記細胞のそれぞれが画像化される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記ａ）のベクター及び／または前記ｂ）の細胞が、療法の前、療法の間、及び／または療法の後に個体に提供される、請求項５０に記載の方法。
56. ５’から３’の方向で、
    ａ）５’スプライスドナー部位と、
    ｂ）操作されたイントロンと、
    ｃ）第１の３’スプライスアクセプター部位と、
    ｄ）１つ以上のリガンド結合ポケットを有する２つ以上のリガンド結合アプタマー、及びその中に少なくとも１つのポリＡ切断シグナルを含むポリＡスイッチと、
    ｅ）第２の３’スプライスアクセプター部位と、
    ｆ）発現可能なポリペプチドをコードする核酸配列と、を含む、ポリＡアプタマーポリヌクレオチドをコードする、核酸分子。
57. 前記核酸がＤＮＡである、請求項５６に記載の核酸分子。
58. 前記核酸がＲＮＡである、請求項５６に記載の核酸分子。
59. 請求項５６に記載の核酸の送達のためのベクター。
60. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項５９に記載のベクター。
61. 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される、請求項５９に記載のベクター。

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