CN114958910A - DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统包括CRISPR/Cas‑GCN4融合蛋白系统、相分离转录激活因子和向导RNA。Cas包括dLbCas12a、dAsCas12a、dspCas9和dUn1Cas12f1；IDRs包括DDX4、FUS和TAF15；转录激活因子包括VP64、P65和VPR。本发明系统实现在哺乳动物细胞内和动物体内靶向基因激活；提高靶向基因的RNA转录效率；广泛的覆盖各种基因的位点；解决了体内体外使用中体系太大的困难；基因激活选择性高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统及其构建方法和应用。由CRISPR/Cas(Cas12a、Cas9和Cas12f1)系统的精准靶向目标基因和相分离转录激活因子激活目标基因，实现在哺乳动物细胞和哺乳动物体内高效靶向激活及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated systems)，全名是常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统，是细菌及古生菌的一种获得性免疫系统，能够通过单链RNA识别外来双链DNA，并借助Cas核酸酶切割外来DNA，抵御外来DNA侵袭。CRISPR/Cas系统大体可以分为两大类，Class 1包含I、IV和III三个亚型和Class 2包含II、V和VI三个亚型。本发明所涉及的是Class 2中的DNA靶向系统，是目前应用最为广泛的系统，其特点是通过一个Cas蛋白和其匹配的sgRNA靶向基因组进行切割，亚型中代表Cas蛋白包括：II型Cas9、V型Cas12a(也称Cas12a)和Cas12f(也称Cas14)。
Cas12a核酸酶，大小为1200aa，具有以下三个特点：第一点，Cas12a核酸酶切割底物仅需要crRNA介导即可，不需要tracrRNA；第二点，Cas12a的PAM序列是TTN且位于5’端；第三点，Cas12a切割位点是PAM下游靶向DNA的第23位核苷酸和靶向互补DNA链的18位核苷酸处形成是黏性末端；第四点，Cas12a具有自我剪切pre-crRNA形成成熟的crRNA(gRNA)，因此可以用于多基因串联的编辑。Cas9是CRISPR家族中应用最早和最广泛的基因编辑工具，最常用的是spCas9蛋白，来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)，大小为1368aa，主是通过spCas9蛋白与sgRNA形成复合物特异性的靶向基因组位点并进行切割，其PAM序列为NGG位于3’端，切割点位于PAM上游的第3位的DNA序列，形成平末端，已经大量的被应用于基础和临床转化研究。Cas12f是属于CRISPR系统中V-F亚型的效应因子具有最小的分子尺寸，通常在400-700个氨基酸左右，目前发现在哺乳动物细胞中具有基因编辑活性的是Un1Cas12f1，大小为529aa，通过tracrRNA-crRNA(gRNA前体)靶向基因，其PAM序列为TTTR位于5’端，切割位点是PAM下游靶向DNA的第24位核苷酸和靶向互补DNA链的22位核苷酸。以上三种核酸酶的剪切位置和蛋白大小的不同，提供了更大选择余地，且均已经应用于基因激活。
液-液相分离(LLPS，liquid-liquid phase separation)是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础，类似于油和水的分离，高度依赖溶液中生物大分子(蛋白，DNA以及RNA等)的浓度、温度、pH、盐离子浓度、盐离子类型以及溶液中存在其它的生物大分子。生物体内发生相分离机制主要有两个：第一是具有低氨基酸序列复杂度的固有无序区域(IDRs，intrinsically disordered regions)之间的多价相互作用和串联重复之间的多价相互作用，LLPS广泛参与多种细胞生理和病理活动，包括细胞膜信号传导、膜结合蛋白质组装、染色质重塑、RNA代谢、突触传递、活跃转录中心形成、有丝分裂结构形成，以及蛋白质病理性转变等多种重要的细胞内信号调控过程，其中目前已经报道了很多蛋白具有IDRs结构，包括DDX4、FUS和TAF15等。
CRISPR基因激活系统(CRISPRa，CRISPR Activation)是一种可以避免造成基因组改变而精准诱导内源性基因表达的技术，主要是通过将核酸酶失活的Cas蛋白结合转录激活因子(VP64、P65、VPR)，可以在mRNA水平有效促进基因组特定位点的转录，达到激活某个基因上调十倍乃至千倍。区别于外源转入基因过表达，CRISPRa系统的应用打破了外源性过表达的局限性，可以同时激活多个本底基因表达，该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。SunTag基因激活系统，是一种信号放大系统，其可通过在Cas蛋白的C’-端融合多(本发明中使用了10和24份)拷贝GCN4抗原表位，招募荧光标记的转录激活因子scFv-sfGFP-TA(Transcriptional activator，TA))，通过靶向基因的启动子区激活基因表达。
本发明结合CRISPRa系统和LLPS系统，人工构建了一个具有相分离特性的DropCRISPRa基因激活系统，利用IDRs之间的多价相互作用在靶位点处人工构建相分离环境，形成无膜细胞器，进而在靶位点处募集转录激活相关因子，促进靶向基因的高效激活。
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供了DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统及其应用。本发明系统可以实现在哺乳动物细胞内和动物体内实现靶向基因的高效激活，包括测试所用的基因和其它基因。本发明系统利用其相分离特性，募集机体内部的转录相关因子并使其形成相分离区域，提高了靶向基因的RNA的转录效率。本发明包括多种CRISPR/Cas蛋白，拥有不同的识别序列和PAM，因此可以广泛的覆盖各种基因的位点，具有大的广泛使用性。本发明系统包括目前较为小的dCas12f1(529aa)核酸酶，这也解决了体内体外使用中体系太大的困难。此外，本发明的提供的不同的相分离转录激活因子，也为基因的激活提供了更多的选择性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于包括CRISPR/dCas-GCN4融合蛋白系统、相分离转录激活因子和向导RNA。
所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述CRISPR/Cas-GCN4融合蛋白系统包括EF1α或CAG启动子、Cas-GCN4融合蛋白表达序列；
所述Cas-GCN4融合蛋白表达序列为无核酸酶活性的Cas与多拷贝的GCN4相融合；
所述Cas包括dLbCas12a、dAsCas12a、dspCas9和dUn1Cas12f1中的一种。所述的Cas蛋白，拥有不同的PAM区，具有广泛的基因组位点识别特性；较小的dUn1Cas12f1蛋白，其大小为529aa，解决了体内外应用中体系太大的困难。
所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述dUn1Cas12f1的大小为529aa，所述dLbCas12a具有多基因同时激活特性。
所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述相分离转录激活因子为特异性结合GCN4的scFv-GCN4序列、绿色荧光蛋白sfGFP、IDRs和转录激活因子相融合的蛋白系统。
所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述IDRs包括DDX4、FUS和TAF15中的一种，所述转录激活因子包括VP64、P65和VPR中的一种，所述相分离转录激活因子包括scFv-GCN4-DDX4-VP64、scFv-GCN4-FUS-VP64、scFv-GCN4-TAF15-VP64、scFv-GCN4-DDX4-P65、scFv-GCN4-FUS-P65、scFv-GCN4-TAF15-P65、scFv-GCN4-DDX4-VPR、scFv-GCN4-FUS-VPR或scFv-GCN4-TAF15-VPR。
所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述相分离转录激活因子具有相分离特性。
所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述向导RNA为靶向基因组区域20-23bp的长序列，所述向导RNA包括U6启动子、gRNA识别序列、gRNA骨架序列、U6启动子的终止序列，所述向导RNA的靶向识别基因包括HBG1、IL1RN、TTN、CD69和Fgf21。其中使用dLbCas12a和dAsCas12a Cas蛋白的向导RNA的长度是23bp，dSpCas9和dUn1Cas12f1的向导RNA的长度是20bp。
任一所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统在基因工程、生物技术和临床中的应用。
任一所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统在哺乳动物细胞和哺乳动物体内实现高效靶向基因激活的应用。
任一所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统在募集RNA聚合酶Ⅱ和BRD4，提高RNA转录效率中的应用；
所述RNA聚合酶Ⅱ包括RNAPⅡ、RNAPII-CTD-S2。
上述构建的高效靶向激活系统DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，包括以下12个大类系统，以及每个大类中形成LLPS存在3个不同的IDR(DDX4、FUS和TAF15)，即总共包括36个系统。
1.DropCRISPRa-LbCas12a-VP64
2.DropCRISPRa-AsCas12a-VP64
3.DropCRISPRa-SpCas9-VP64
4.DropCRISPRa-Un1Cas12f1-VP64
5.DropCRISPRa-LbCas12a-VPR
6.DropCRISPRa-AsCas12a-VPR
7.DropCRISPRa-SpCas9-VPR
8.DropCRISPRa-Un1Cas12f1-VPR
9.DropCRISPRa-LbCas12a-P65
10.DropCRISPRa-AsCas12a-P65
11.DropCRISPRa-SpCas9-P65
12.DropCRISPRa-Un1Cas12f1-P65
DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统在生命体体内和体外中的应用。
本系统在细胞内激活，构建针对目标基因的启动子区的sgRNA，包括HBG1、IL1RN、TTN、CD69和Fgf21，通过脂质体转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)将已经构建的质粒系统转入细胞内，均成功更高效的激活了目标基因。
本系统在动物体内的基因激活应用，包括荧光素酶报告系统的激活和内源性基因的激活。
构建荧光素酶报告系统TRE-Luciferase-GSGP2A-mCherry，此系统包括一个诱导型启动子TRE启动表达的荧光素报告系统，再利用小鼠尾静脉水动力注射的方式将TRE-Luciferase-GSGP2A-mCherry、DropCRISPRa和靶向TRE的gRNA导入到小鼠肝细胞中，通过荧光素底物检测荧光酶激活表达水平，本发明可以高效的激活荧光素酶表达。
小鼠体内的内源性基因的激活，构建可以稳定整合DropCRISPRa-PB系统，此系统包括表达PB转座子酶质粒、表达DropCRISPRa的转座子供体质粒和靶向Fgf21的sgRNA。利用小鼠尾静脉水动力静脉注射方法，将DropCRISPRa-PB系统导入小鼠肝脏内部，成功实现小鼠内源性基因的激活。
因此，本发明的DropCRISPRa高效基因激活系统为基础研究和未来的临床应用奠定基础。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明是首次人工构建的一种具有相分离特性的基因激活系统，本系统可以在靶标区形成相分离区域，且此区域可以有效的募集机体内部的转录相关因子，提高了靶向基因的RNA的转录效率。
2、本发明可以实现更高效的体内体外基因的激活。
3、本发明涉及多种转录激活因子，具有较好的普适性和广泛性。
4、本发明利用不同的Cas蛋白，其特异性靶向位点和识别的PAM序列各不同，使其应用更广泛。
5、本发明系统包括一种最小的Cas12f蛋白，其大小仅有529aa，解决了体内外应用中体系太大的难题。
附图说明
图1为本发明系统结构图；
图2为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图3为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图4为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VP64-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图5为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图6为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VP64-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图7为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-164aa-VP64-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图8为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-27YS-VP64-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图9为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-G156E-VP64-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图10为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-P65-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图11为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-P65-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图12为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-P65-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图13为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-P65-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图14为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VPR-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图15为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VPR-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图16为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VPR-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图17为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VPR-GB1-NLS-PA质粒图谱；
图18为pEF1a-dLbCas12a-10XGCN4质粒图谱；
图19为pEF1a-dUn1Cas12f1-10XGCN4质粒图谱；
图20为pCAG-dAsCas12a-10XGCN4质粒图谱；
图21为pCAG-dCas9-24XGCN4质粒图谱；
图22为pBluSKP-TRE-Luciferase-GSGP2A-mCherry质粒图谱；
图23为PB-Fgf21-LbCas12aE925A-10XGCN4-P2A-mCherry质粒图谱；
图24为PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP质粒图谱；
图25为PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP-VP64质粒图谱；
图26为PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64质粒图谱；
图27中a为IUPred相分离预测软件预测目标蛋白的IDR结构区域；b为光漂白荧光恢复技术检测相分离点中蛋白具有流动性；c为共聚焦荧光显微镜观察图；d为相分离液滴溶解情况图；
图28中a为DropCRISPRa模式图；b为FRAP检测流动性情况图；c为聚焦荧光显微镜观察相点图；d为靶向激活情况图；e，RNA测序检测高效特异性的靶向激活目标基因；
图29中a为异常相分离系统的模式图；b为免疫荧光显示图；c为免疫荧光显示图；d为FRAP检测流动性图；e为靶点激活显示；
图30是a为DropCRISPRaP65相分离的基因激活系统的模式图；b为免疫荧光显示图；c为靶向基因激活图；d为DropCRISPRa-VPR的相分离的基因激活系统的模式图；e为免疫荧光显示图；f为靶向基因激活图；
图31中a为构建多基因串联的向导RNA，利用Cas12a自我剪切前体-crRNA形成成熟的向导RNA，基因包括HBG1、IL1RN和TTN；b-c为基于不同的转录激活因子利用DropCRISPRa系统，实现多基因的激活，转录因子，包括VP64(b)、VPR(c)和P65(d)；
图32中a-c为基于VP64构建不同的Cas蛋白的相分离基因激活系统，靶向激活目标基因HBG1和IL1RN；d-f为基于P65构建不同的Cas蛋白的相分离基因激活系统，靶向激活目标基因HBG1和IL1RN；g-i为基于VP6R构建不同的Cas蛋白的相分离基因激活系统，靶向激活目标基因HBG1和IL1RN；
图33中a为免疫荧光染色显示图；b为RT-PCR检测结果图；
图34中a为荧光素报告系统模式图；b和c为小鼠体内检测荧光酶的表达的情况；
图35中a为RT-PCR检测细胞水平内源性Fgf21激活结果图；b为RT-PCR检测在小鼠体内分别短期和长期内源性Fgf21激活结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
如图1为本发明系统结构图。
质粒Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-PA(图谱如图2)；
质粒Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA(图谱如图3)。
1、设计构建Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VP64-GB1-NLS-PA(图谱如图4)；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA(图谱如图5)；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VP64-GB1-NLS-PA(图谱如图6)；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-164aa-VP64-GB1-NLS-PA(图谱如图7)；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-27YS-VP64-GB1-NLS-PA(图谱如图8)；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-G156E-VP64-GB1-NLS-PA(图谱如图9)；
设计合成包括以下序列的模板质粒，包括P-DDX4-VP64，其核苷酸序列如SED IDNO.1所示；P-FUS-VP64，其核苷酸序列如SED ID NO.2所示；P-TAF15-VP64，其核苷酸序列如SED ID NO.3所示；P-FUS164aa-VP64，其核苷酸序列如SED ID NO.4所示；P-FUS27YS-VP64，其核苷酸序列如SED ID NO.5所示；P-FUSG156E-VP64，其核苷酸序列如SED ID NO.6所示。
用AgeI+SpeI限制性内切酶切割(具体见下文)Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA质粒、P-DDX4-VP64、P-FUS-VP64、P-TAF15-VP64、P-FUS164aa-VP64、P-FUS27YS-VP64和P-FUSG156E-VP64质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物(具体见下文)产物，切胶回收分别4959bp、1167bp、1101bp、1083bp、948bp、1104bp和1101bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA质粒分别与线性化的P-DDX4-VP64、P-FUS-VP64、P-TAF15-VP64、P-FUS164aa-VP64、P-FUS27YS-VP64和P-FUSG156E-VP64质粒通过NEB公司购买的T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VP64-GB1-NLS-PA；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VP64-GB1-NLS-PA；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-164aa-VP64-GB1-NLS-PA；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-27YS-VP64-GB1-NLS-PA和
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-G156E-VP64-GB1-NLS-PA质粒。
2、具体操作体系如下：
酶切体系50μL，具体包括：
AgeI-HF: 0.5μL
SpeI-HF: 0.5μL
10ⅹcutsmart buffer:5μL
质粒： 3μg
DdH2O: 至50μL
T4连接体系10μL，具体如下：
T4 ligase: 1μL
10x T4ligase buffer: 1μL
线性化Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA质粒: 2μL
线性化P-DDX4-VP64或P-FUS-VP64或P-TAF15-VP64或P-FUS164aa-VP64或P-FUS27YS-VP64或P-FUSG156E-VP64质粒:2μL
DdH2O: 4μL
反应条件：25℃水浴1h。
实施例2：
1、构建Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-P65-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图10)。
设计合成模板质粒P-P65，其核苷酸序列为SED ID NO.7：
用AgeI+SpeI限制性内切酶切割(具体见下文)Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA、P-P65质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物(具体见下文)产物，切胶回收分别4959bp和846bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA质粒与线性化的P-P65质粒通过NEB公司购买的T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-P65-GB1-NLS-PA质粒。
2、具体操作体系如下：
酶切体系50μL，具体包括：
AgeI-HF: 0.5μL
SpeI-HF: 0.5μL
10ⅹcutsmart buffer:5μL
质粒： 3μg
DdH2O: 至50μL
T4连接体系10μL，具体如下：
T4 ligase: 1μL
10x T4ligase buffer: 1μL
线性化Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA质粒: 2μL
线性化P-P65质粒:2μL
DdH2O:4μL
反应条件：25℃水浴1h。
实施例3：
1、构建Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-P65-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图11)、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-P65-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图12)、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-P65-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图13)。
分别以P-DDX4-VP64、P-FUS-VP64和P-TAF15-VP64为模板进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：P65-OL-F，其核苷酸序列为SED ID NO.8，
CCTCCTCCTCCGCTTCCTCCACCGCCTCCACCAGAACCGTTTA；
P65-OL-R，其核苷酸序列为SED ID NO.9，
TGAGCTCTACAAAGGTGGAGGTCGGACCGGTGGTTCAGGAGGCGGCGGAAGC。
用NheI+AgeI限制性内切酶切割(具体见下文)Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-P65-GB1-NLS-PA质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别5793bp、810bp、744bp和726bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度,将线性化的Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-P65-GB1-NLS-PA质粒分别也与PCR产物通过NEB公司购买的GibsionAssembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-P65-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-P65-GB1-NLS-PA和Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-P65-GB1-NLS-PA。
2、具体操作体系如下：
酶切体系50μL，具体包括：
AgeI-HF: 0.5μL
NheI-HF: 0.5μL
10ⅹcutsmart buffer:5μL
质粒： 3μg
DdH2O: 至50μL
PCR体系如下：
模版质粒: 1μL(10ng)
前向引物: 1μL(10μM)
后向引物: 1μL(10μM)
2ⅹTaq酶混合物:25μL
ddH2O:至50μL
PCR程序如下：
①95℃:2min
②95℃:30s
③58℃:30s
④72℃:3min
②③④循环39次
⑤72℃2min
⑥16℃保存
Gibsion assembly反应体系如下：
Gibsion assembly混合物：3μL
PCR产物： 1μL
酶切产物： 2μL
实施例4：
1、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VPR-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图14)。
构建Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VPR-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图15)；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VPR-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图16)；
Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VPR-GB1-NLS-PA质粒(图谱如图17)。
合成P-VPR模板质粒，其核苷酸序列为SED ID NO.10。
用HpaI+PmeI限制性内切酶切割Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VP64-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VP64-GB1-NLS-PA和P-VPR质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物产物，切胶回收分别5918bp、5852bp、5834bp和1033bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度,将线性化的P-VPR质粒分别与线性化的Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VP64-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA和Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VP64-GB1-NLS-PA质粒通过NEB公司购买的T4DNA连接酶连接，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VPR-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VPR-GB1-NLS-PA和Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VPR-GB1-NLS-PA质粒。
2、具体操作体系如下：
酶切体系50μL，具体包括：
PmeI-HF: 0.5μL
HpaI-HF: 0.5μL
10ⅹcutsmart buffer:5μL
质粒： 3μg
DdH2O: 至50μL
T4连接体系10μL，具体如下：
T4 ligase: 1μL
10x T4ligase buffer: 1μL
线性化Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-DDX4-VP64-GB1-NLS-PA或Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA或Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-TAF15-VP64-GB1-NLS-PA质粒: 2μL
线性化P-VPR质粒: 2μL
DdH2O: 4μL
反应条件：25℃水浴1h.
实施例5：
构建pEF1a-LbCas12aE925A-10XGCN4质粒(图谱如图18)。
合成包括如下序列的质粒pEF1a-LbCas12aE925A-10XGCN4，其核苷酸序列为SEDID NO.11。将其转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pEF1a-LbCas12aE925A-10XGCN4质粒。
实施例6：
构建pEF1a-Un1Cas12f1-10XGCN4质粒(图谱如图19)。
合成包括如下序列的模板质粒pEF1a-Un1Cas12f1-10XGCN4，其核苷酸序列为SEDID NO.12。将其转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pEF1a-Un1Cas12f1-10XGCN4-NLS质粒。
实施例7：
构建pCAG-dAsCas12a-10XGCN4质粒(图谱如图20)。
合成包括如下序列的质粒pCAG-dAsCas12a-10XGCN4，其核苷酸序列为SED IDNO.13。将其转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pCAG-dAsCas12a-10XGCN4质粒。
实施例8：
构建pCAG-dCas9-24XGCN4质粒(图谱如图21)。
合成包括如下序列的质粒pCAG-dCas9-24XGCN4，其核苷酸序列为SED ID NO.14。将其转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pCAG-dCas9-24XGCN4质粒。
实施例9：
构建pBluSKP-TRE-Luciferase-GSGP2A-mCherry质粒(图谱如图22)。
合成包括如下序列的质粒pBluSKP-TRE-Luciferase-GSGP2A-mCherry，其核苷酸序列为SED ID NO.15。将其转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBluSKP-TRE-Luciferase-GSGP2A-mCherry质粒。
实施例10：
PB-Fgf21-LbCas12aE925A-10XGCN4-P2A-mCherry质粒(图谱如图23)。
1、构建PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP(图谱如图24)；
PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP-VP64(图谱如图25)；
PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64(图谱如图26)。
合成包括PB(LTR)-U6-Fgf21-CAG-PolyA的骨架质粒，用EcoRI+NheI限制性内切酶切割Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA和PB(LTR)-U6-Fgf21-CAG-PolyA，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物产物，切胶回收分别1866bp、2031bp、2471bp和6267bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度,将线性化的PB(LTR)-U6-Fgf21-CAG-PolyA质粒分别与线性化的Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA和Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA质粒通过NEB公司购买的T4DNA连接酶连接，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP、PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP-VP64和PB-Fgf21-CAG-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64。
2、具体操作体系：
酶切体系50μL，具体包括：
EcoRI-HF: 0.5μL
NheI-HF: 0.5μL
10ⅹcutsmart buffer:5μL
质粒： 3μg
DdH2O: 至50μL
T4连接体系10μL，具体如下：
T4 ligase: 1μL
10x T4ligase buffer: 1μL
线性化质粒PB(LTR)-U6-Fgf21-CAG-PolyA: 2μL
线性化质粒Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-GB1-NLS-PA、Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS-PA和Pblu-EF1-scFv-GCN4-sfGFP-FUS-VP64-GB1-NLS-PA:2μL
DdH2O: 4μL
反应条件：25℃水浴1h.
实施例11：
1、构建PB-Fgf21-LbCas12aE925A-10XGCN4-P2A-mCherry质粒。
用EcoRI+BsrGI限制性内切酶切割pEF1a-dLbCas12a-10XGCN4和PB(LTR)-U6-Fgf21-CAG-PolyA，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物产物，切胶回收分别5521bp和6267bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的质粒通过NEB公司购买的T4DNA连接酶连接，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为PB-Fgf21-LbCas12aE925A-10XGCN4-P2A-mCherry。
2、具体操作体系
酶切体系50μL,具体包括：
EcoRI-HF: 0.5μL
BsrGI-HF: 0.5μL
10ⅹcutsmart buffer:5μL
质粒： 3μg
DdH2O: 至50μL
T4连接体系10μL,具体如下：
T4 ligase: 1μL
10x T4ligase buffer: 1μL
线性化质粒PB(LTR)-U6-Fgf21-CAG-PolyA: 2μL
线性化质粒pEF1a-dLbCas12a-10XGCN4:2μL
DdH2O: 4μL
反应条件：25℃水浴1h。
本发明实施例中所使用的向导RNA(sgRNA)的序列具体如下表1：
表1向导RNA(sgRNA)的序列
实施例12：细胞水平靶向基因激活检测
质粒转染细胞实验，此步骤适用于后续所有细胞体系。
制备脂质体转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)：1mg/ml，PH:7.0
转染条件如表2：PEI：total DNA＝5:1(g/g)
表2转染条件
转染过程：培养人肾上皮细胞293T于DMEM全培中，种植特定数量的细胞于培养皿中，置于37℃，5％CO2孵箱培养18-28小时，至细胞密度为65-70％待用。先将待转染质粒预混于30μl OPTI-MEN中，室温静置5min，再与PEI混合，室温静置15min后，置于37℃，5％CO2孵箱培养，8h后换新鲜的全培基，后续用于不同的实验过程。
此步骤适用于后续所有细胞内靶基因激活检测：质粒转入细胞48h后收取细胞，利用Trizol法提取细胞中的总RNA，再利用Takara公司购买的试剂盒进行RT-PCR检测靶向基因的表达情况，具体如下：
第一：总RNA的提取：
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解：提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5～106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；
2.将上述Trizol裂解液转入1.5ml的EP管中，加入0.2倍Trizol裂解液体积的氯仿，震荡15秒，室温放置2min后，12000g(4℃)离心15分钟；
3.取上清水相于新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，室温下放置10分钟，12000g(4℃)离心15分钟；
4.弃上清，加入1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(4℃)离心5分钟；
5.弃上清，沉淀的RNA在室温在自然干燥3-5min；
7.用Rnase-free water溶解RNA沉淀，使用NanoDrop测量RNA浓度。
第二：RT-PCR检测靶基因的激活：
1.去除基因组DNA反应体系如下表3：
表3去除基因组DNA反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| 5×gDNAEraserBuffer | 2.0μl |
| gDNAEraser | 1.0μl |
| TotalRNA | 1μg |
| RNaseFreedH2O | upto10μl |
反应条件：42℃2min；4℃。
2.反转录反应：(反应液配制请在冰上进行，配制Master Mix，然后再分装10μL到每个反应管中，轻柔混匀后立即进行反转录反应)，体系见表4。
表4反转录体系
反应条件：37℃15min；85℃5sec；4℃。
3.RT-PCR反应体系见表5。
表5RT-PCR反应体系
两步法反应条件：
第一步：预变性
95℃30s
第二步：PCR反应
95℃5s
60℃34s
进行40个循环
RT-PCR中使用的引物列表如下表6：
表6RT-PCR中使用的引物
筛选形成LLPS的IDR(DDX4、FUS和TAF15)元件
如图27，选择具有相分离特性的IDR。首先筛选DDX4、FUS和TAF15蛋白，利用在线相分离预测工具IUPred进行目标蛋白的IDR结构区域的预测(图27a)，并构建表达目标蛋白IDRs(DDX4-IDR、FUS-IDR和TAF15-IDR)的质粒；其次，在活体细胞内验证所筛选的IDR具有相分离特性，将表达IDRs的质粒转入35mm共聚焦培养皿中，36h后使用FRAP技术检测相分离点中蛋白具有流动性(图27b)，以及观察到细胞中的相点具有融合和分离特性(图27c)，以及小分子1，6-HD可以去除IDRs的相分离的特点(图27d)。
构建高效靶向基因激活的DropCRISPRa-LbCas12a-VP64系统
如图28，构建DropCRISPRa-LbCas12a-VP64高效靶向相分离基因激活系统。此系统包括IDRs-VP64、dLbCas12a-10XGCN4和sgRNA(HBG1、IL1RN、CD69和TTN)。
首先，设计并构建表达IDRs-VP64的质粒，包括DDX4-VP64、FUS-VP64和TAF15-VP64；其次，将表达DropCRISPRa-LbCas12a-VP64系统的质粒转入35mm共聚焦培养皿中，DropCRISPRa-LbCas12a-VP64模式图如图28a，36h后使用FRAP技术检测相分离点中蛋白具有流动性，如图28b；观察到细胞中的相点具有融合和分离特性，如图28c；再次，将表达DropCRISPRa-LbCas12a-VP64系统的质粒转入24孔板中(具体如下)，48h后收取细胞RT-PCR检测靶基因的激活，结果显示本发明成功实现HBG1、IL1RN、TTN和CD69的靶向基因的高效激活(图28d)，最后选取IL1RN位点进行RNA测序，结果显示本发明系统成功实验特性靶向激活基因(图28e)。
在24孔板中转染质粒的系统如表7：
表7转染质粒的系统
相分离特性驱动DropCRISPRa高效激活作用
如图29所示，选取本发明中IDR-FUS驱动的相分离系统作为研究目标，首先设计并构建两个已经报导的去相分离和异常相分离的突变体包括mdFUS(FUS27YS)和maFUS(FUSG156E)，其次转入细胞内进行验证，免疫荧光显示mdFUS无相点，maFUS兼有相分离特性的相点和非流动性的固态状的聚合物。基于此，构建降低和异常相分离的FUS-VP64表达质粒，包括mdFUS-VP64和maFUS-VP64，如图29a为异常相分离系统的模式图，转入细胞后，荧光显微镜下观察mdFUS-VP64无相点，maFUS-VP64具有相点，同时兼有流动性的相点和固体相点(如图29b和c)，分别用FRAP和小分子1，6-HD进行证实，如图29c和d，maFUS-VP64中存在1，6-HD无法去除的非流动性的绿色荧光聚点，maFUS-VP64存在具有流动性的相分离点，且这些相点具有融合和分裂特性。利用上述系统激活HBG1、IL1RN、TTN和CD69靶点，结果显示，去除相分离后，基因的激活效果明显下降，异常相分离也会影响基因的激活效果(图29e)。
构建基于转录激活因子P65和VPR的相分离激活系统
拓展DropCRISPRa系统，构建基于转录激活因子P65和VPR的相分离激活系统(如图30)，包DropCRISPRa-P65和DropCRISPRa-VPR，并利用新的系统靶向激活目标基因，利用此系统实现高效的HBG1、IL1RN、TTN和CD69的靶向基因的激活。具体如下：
利用DropCRISPRa-P65靶向基因激活(如图30a-c)，基因激活体系见表8：
表8DropCRISPRa-P65靶向基因激活体系
利用DropCRISPRa-VPR靶向基因激活(如图30d-f)，体系见表9：
表9DropCRISPRa-VPR靶向基因激活体系
利用DropCRISPRa-LbCas12a实现多基因激活
基于Cas12a可以自剪切自身前体-crRNA形成成熟的向导RNA的特性，构建包括包含HBG1、IL1RN和TTN的三基因串联的前体-crRNA(如图31a)，利用DropCRISPRa-LbCas12a实现高效的多基因的同时激活，其转录因子包括VP64、VPR和P65(如图31b)，DropCRISPRa-LbCas12a实现多基因激活体系如下表10。
表10DropCRISPRa-LbCas12a实现多基因激活体系
构建不同CRISPR/Cas蛋白和转录激活因子的相分离靶向激活系统
基于不同的Cas蛋白，拓展DropCRISPRa系统，所涉及CRISPR/Cas蛋白包括spCas9、AsCas12a和Un1Cas12f1，所涉及转录激活因子包括VP64(如图32a-c)、P65(如图32d-f)和VPR(图32g-i)，且均可实现靶向基因的激活，包括HBG1和IL1RN(如图32)。如下表11。
表11不同CRISPR/Cas蛋白和转录激活因子的DropCRISPRa靶向基因激活体系
实施例13：本发明系统可以募集RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ、RNAPII-CTD-S2)和BRD4到系统自身的相点内部，并形成相分离点，提高RNA的转录的效率
如图33，利用本发明DropCRISPRa系统靶向HBG1启动子位点(具体转染系统如下)，同时结合免疫荧光染色显示，相分离转录激活因子相点可以募集RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ、RNAPII-CTD-S2)和BRD4，且也呈现相点形态(如图33a)，说明本发明系统可以人工局部形成一个高浓度RNA聚合酶Ⅱ-BRD4聚集环境，将有利于高效特异性靶向基因的激活。我们使用小分子化合物DRB可逆阻断基因转录延伸过程，结合RT-PCR分析内含子较长的靶向基因CD69的RNA的转录效率(具体转染系统如下)。在利用本系统靶向激活CD6948h后，使用DRB处理3h，阻断CD69的转录延伸和充分的消耗已生成的Pre-mRNA，然后RT-PCR检测撤药后不同时间点Pre-mRNA的恢复(如图33b)。
靶向HBG1位点进行免疫荧光染色转染体系见表12：
表12靶向HBG1位点进行免疫荧光染色转染体系
靶向激活CD69转录效率检测的质粒转染体系见表13：
表13靶向激活CD69转录效率检测的质粒转染体系
实施例14：本发明可以实现动物体内基因激活，包括外源转入的荧光素报告系统和内源性基因
本发明实现动物体内外源转入的荧光素报告系统的激活，将上述已经构建好的表达荧光素酶的报告系统的质粒与本发明DropCRISPRa相分离激活系统(具体质粒如下)，通过尾静脉水动力方式导入小鼠肝脏内部，分别于12h、24h、48h和72h进行小鼠活体成像，检测体内荧光素酶的水平(如图34a-c)，结果显示，本发明的相分激活系统，明显更优于普通激活系统。激活荧光素报告系统如下表14：
表14激活荧光素报告系统
实施例15：实现动物体内的内源性基因激活
设计并构建靶向激活Fgf21基因，首先利用此系统在小鼠细胞B16细胞上测试了基因激活的效果，结果显示，成功实现更高效的靶向基因激活(如图35a)。其次，设计并构建DropCRISPRa-PB系统，利用hyPiggyBac(PB)转座子系统将本发明系统整合到体内，实现Fgf21基因的激活。同样利用尾静脉水动力方式将PB系统导入小鼠肝脏内部，分别于D6天和D30天检测Fgf21的基因的表达(如图35b)，结果显示，本发明的相分激活系统可以更高效的激活靶基因。体内激活内源性Fgf21基因的体系如下表15：
表15体内激活内源性Fgf21基因的体系
综上，本发明系统可以实现高效靶向基因的激活，可以成功的实现体内体外的高效靶向基因的激活，将为临床转化研究的基因治疗供了新的手段。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统及其构建方法和应用
<130> CP122010374C
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1173
<212> DNA
<213> P-DDX4-VP64
<400> 1
accggtggtt caggaggcgg cggaagcttg atgggagatg aagattggga agcagaaatc 60
aaccctcata tgtcttccta tgttcccata tttgagaagg ataggtattc tggagaaaat 120
ggagacaatt ttaacaggac tccagcttca tcatcagaaa tggatgatgg accttctcga 180
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tttggaaaca gaggtttttc aaacagcagg tttgaagatg gtgatagctc tggtttctgg 360
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ggcgataatg acttagaccc agacgaatgt atgcagcgca ctggtggcct ttttggttct 480
agaagaccag tattaagtgg cacaggtaat ggtgatactt ctcaaagcag aagtggcagt 540
ggaagtgaac gaggtggtta caaaggttta aatgaagaag taataacagg ctctggaaag 600
aattcttgga agtcagaagc agaaggagga gaaagtagtg atactcaagg accaaaagtg 660
acctacatac cccctcctcc acctgaggat gaggactcca tctttgcaca ttatcagaca 720
ggcataaact tcgacaaacg tttaaacggt tctggtggag gcggttcagg tggaggcggt 780
agtggtggag gcatcgatga tgctttagac gattttgact tagatatgct tggttcagac 840
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gatatgttgg gctccgatgc cctagatgac tttgatctag atatgctagt taacggtagt 960
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gaaaccacca ccgaagctgt tgacgctgct accgcggaaa aagttttcaa acagtacgct 1080
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accggtggtt caggaggcgg cggaagcttg atggcctcaa acgattatac ccaacaagca 60
acccaaagct atggggccta ccccacccag cccgggcagg gctattccca gcagagcagt 120
cagccctacg gacagcagag ttacagtggt tatagccagt ccacggacac ttcaggctat 180
ggccagagca gctattcttc ttatggccag agccagaaca gctatggaac tcagtcaact 240
ccccagggat atggctcgac tggcggctat ggcagtagcc agagctccca atcgtcttac 300
gggcagcagt cctcctaccc tggctatggc cagcagccag ctcccagcag cacctcggga 360
agttacggta gcagttctca gagcagcagc tatgggcagc cccagagtgg gagctacagc 420
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cctcagggct atggacagca gaaccagtac aacagcagca gtggtggtgg aggtggaggt 540
ggaggtggag gtaactatgg ccaagatcaa tcctccatga gtagtggtgg tggcagtggt 600
ggcggttatg gcaatcaaga ccagagtggt ggaggtggca gcggtggcta tggacagcag 660
gaccgtggag gccgtttaaa cggttctggt ggaggcggtt caggtggagg cggtagtggt 720
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accggtggtt caggaggcgg cggaagcttg atgagcgaca gcggctccta tgggcagtcc 60
gggggcgagc agcaaagcta cagcacctac ggcaaccccg gctcccaagg ctacggccaa 120
gcctcccaaa gctactccgg gtacgggcag accaccgaca gcagctacgg gcagaactat 180
agcgggtaca gctcctatgg gcagtcccaa agcggctaca gccaatccta cggcggctac 240
gagaatcaga agcagagctc ctactcccaa cagccctaca acaaccaagg gcagcaacag 300
aatatggaga gcagcggcag ccaaggcggg agagctccta gctacgatca gcccgactac 360
gggcagcaag actcctatga tcagcagtcc gggtacgatc aacaccaagg cagctacgac 420
gagcagagca actatgacca acagcacgac agctatagcc aaaatcagca gagctaccac 480
agccaaagag agaactacag ccaccacacc caagacgaca gaagagacgt gagcagatac 540
ggcgaggaca atagagggta tgggggctcc caaggcgggg gcagaggcag aggcggctac 600
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atgttaggct cagatgcatt ggacgacttc gatttagata tgttgggctc cgatgcccta 840
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gctgctaccg cggaaaaagt tttcaaacag tacgctaacg acaacggtgt tgacggtgaa 1020
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ggtactagt 1089
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accggtggtt caggaggcgg cggaagcatg gcctcaaacg attataccca acaagcaacc 60
caaagctatg gggcctaccc cacccagccc gggcagggct attcccagca gagcagtcag 120
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accggtggtt caggaggcgg cggaagcgct agcatggcct ccaacgattc cacacagcaa 60
gccacacaga gctccggcgc ttcccctaca caacccggcc aaggcagcag ccaacagtcc 120
tcccaaccta gcgggcagca gtcctcctcc ggcagcagcc aaagcaccga tacaagcggc 180
tccgggcaga gcagcagcag cagctccggg cagtcccaaa ataccggcag cggcacacag 240
tccacacctc aaggctccgg gagcaccggg gggtccggca gcagccaaag ctcccaaagc 300
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ccctacggac agcagagtta cagtggttat agccagtcca cggacacttc aggctatggc 180
cagagcagct attcttctta tggccagagc cagaacacag gctatggaac tcagtcaact 240
ccccagggat atggctcgac tggcggctat ggcagtagcc agagctccca atcgtcttac 300
gggcagcagt cctcctatcc tggctatggc cagcagccag ctcccagcag cacctcggga 360
agttacggta gcagttctca gagcagcagc tatgggcagc cccagagtgg gagctacagc 420
cagcagccta gctatggtgg acagcagcaa agctatggac agcagcaaag ctataatccc 480
cctcagggct atgagcagca gaaccagtac aacagcagca gtggtggtgg aggtggaggt 540
ggaggtggag gtaactatgg ccaagatcaa tcctccatga gtagtggtgg tggcagtggt 600
ggcggttatg gcaatcaaga ccagagtggt ggaggtggca gcggtggcta tggacagcag 660
gaccgtggag gccgtttaaa cggttctggt ggaggcggtt caggtggagg cggtagtggt 720
ggaggcatcg atgatgcttt agacgatttt gacttagata tgcttggttc agacgcgtta 780
gacgacttcg acctagacat gttaggctca gatgcattgg acgacttcga tttagatatg 840
ttgggctccg atgccctaga tgactttgat ctagatatgc tagttaacgg tagtggagga 900
ggatctcgga ccgaagagta caagcttatc ctgaacggta aaaccctgaa aggtgaaacc 960
accaccgaag ctgttgacgc tgctaccgcg gaaaaagttt tcaaacagta cgctaacgac 1020
aacggtgttg acggtgaatg gacctacgac gacgctacca aaaccttcac ggtaaccgaa 1080
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aggaaggtgg cggccgctgg atccccttca gggcagatca gcaaccaggc cctggctctg 120
gcccctagct ccgctccagt gctggcccag actatggtgc cctctagtgc tatggtgcct 180
ctggcccagc cacctgctcc agcccctgtg ctgaccccag gaccacccca gtcactgagc 240
gctccagtgc ccaagtctac acaggccggc gaggggactc tgagtgaagc tctgctgcac 300
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gtgttcacag atctggcctc cgtggacaac tctgagtttc agcagctgct gaatcagggc 420
gtgtccatgt ctcatagtac agccgaacca atgctgatgg agtaccccga agccattacc 480
cggctggtga ccggcagcca gcggcccccc gaccccgctc caactcccct gggaaccagc 540
ggcctgccta atgggctgtc cggagatgaa gacttctcaa gcatcgctga tatggacttt 600
agtgccctgc tgtcacagat ttcctctgtt aacggtagtg gaggaggatc tcggaccgaa 660
gagtacaagc ttatcctgaa cggtaaaacc ctgaaaggtg aaaccaccac cgaagctgtt 720
gacgctgcta ccgcggaaaa agttttcaaa cagtacgcta acgacaacgg tgttgacggt 780
gaatggacct acgacgacgc taccaaaacc ttcacggtaa ccgaaggtgg tggtagcggt 840
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tgagctctac aaaggtggag gtcggaccgg tggttcagga ggcggcggaa gc 52
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<213> P-VPR
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gtttaaacgg ttctggtgga ggcggttcag gtggaggcgg tagtggtgga ggcatcgatg 60
atgctttaga cgattttgac ttagatatgc ttggttcaga cgcgttagac gacttcgacc 120
tagacatgtt aggctcagat gcattggacg acttcgattt agatatgttg ggctccgatg 180
ccctagatga ctttgatcta gatatgctag gaggaagcgg aggaggaggt agcggaccta 240
agaaaaagag gaaggtggcg gccgctggat ccccttcagg gcagatcagc aaccaggccc 300
tggctctggc ccctagctcc gctccagtgc tggcccagac tatggtgccc tctagtgcta 360
tggtgcctct ggcccagcca cctgctccag cccctgtgct gaccccagga ccaccccagt 420
cactgagcgc tccagtgccc aagtctacac aggccggcga ggggactctg agtgaagctc 480
tgctgcacct gcagttcgac gctgatgagg acctgggagc tctgctgggg aacagcaccg 540
atcccggagt gttcacagat ctggcctccg tggacaactc tgagtttcag cagctgctga 600
atcagggcgt gtccatgtct catagtacag ccgaaccaat gctgatggag taccccgaag 660
ccattacccg gctggtgacc ggcagccagc ggccccccga ccccgctcca actcccctgg 720
gaaccagcgg cctgcctaat gggctgtccg gagatgaaga cttctcaagc atcgctgata 780
tggactttag tgccctgctg tcacagattt cctctagtgg gtctggcagc ggcagcgacc 840
tttcccatcc gcccccaagg ggccatctgg atgagctgac aaccacactt gagtccatga 900
ccgaggatct gaacctggac tcacccctga ccccggaatt gaacgagatt ctggatacct 960
tcctgaacga cgagtgcctc ttgcatgcca tgcatatcag cacaggactg tccatcttcg 1020
acacatctct gtttgttaac 1040
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<211> 5196
<212> DNA
<213> pEF1a-LbCas12aE925A-10XGCN4
<400> 11
gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgat 60
ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120
gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180
tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggaattcat ttaggtgaca ctatagataa 240
tacgactcac tatagggatg agcaagctgg agaagtttac aaactgctac tccctgtcta 300
agaccctgag gttcaaggcc atccctgtgg gcaagaccca ggagaacatc gacaataagc 360
ggctgctggt ggaggacgag aagagagccg aggattataa gggcgtgaag aagctgctgg 420
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acaattacat cagcctgttc cggaagaaaa ccagaaccga gaaggagaat aaggagctgg 540
agaacctgga gatcaatctg cggaaggaga tcgccaaggc cttcaagggc aacgagggct 600
acaagtccct gtttaagaag gatatcatcg agacaatcct gccagagttc ctggacgata 660
aggacgagat cgccctggtg aacagcttca atggctttac cacagccttc accggcttct 720
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gtatcaacga gaatctgacc cgctacatct ctaatatgga catcttcgag aaggtggacg 840
ccatctttga taagcacgag gtgcaggaga tcaaggagaa gatcctgaac agcgactatg 900
atgtggagga tttctttgag ggcgagttct ttaactttgt gctgacacag gagggcatcg 960
acgtgtataa cgccatcatc ggcggcttcg tgaccgagag cggcgagaag atcaagggcc 1020
tgaacgagta catcaacctg tataatcaga aaaccaagca gaagctgcct aagtttaagc 1080
cactgtataa gcaggtgctg agcgatcggg agtctctgag cttctacggc gagggctata 1140
catccgatga ggaggtgctg gaggtgttta gaaacaccct gaacaagaac agcgagatct 1200
tcagctccat caagaagctg gagaagctgt tcaagaattt tgacgagtac tctagcgccg 1260
gcatctttgt gaagaacggc cccgccatca gcacaatctc caaggatatc ttcggcgagt 1320
ggaacgtgat ccgggacaag tggaatgccg agtatgacga tatccacctg aagaagaagg 1380
ccgtggtgac cgagaagtac gaggacgatc ggagaaagtc cttcaagaag atcggctcct 1440
tttctctgga gcagctgcag gagtacgccg acgccgatct gtctgtggtg gagaagctga 1500
aggagatcat catccagaag gtggatgaga tctacaaggt gtatggctcc tctgagaagc 1560
tgttcgacgc cgattttgtg ctggagaaga gcctgaagaa gaacgacgcc gtggtggcca 1620
tcatgaagga cctgctggat tctgtgaaga gcttcgagaa ttacatcaag gccttctttg 1680
gcgagggcaa ggagacaaac agggacgagt ccttctatgg cgattttgtg ctggcctacg 1740
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cctactctaa ggataagttc aagctgtatt ttcagaaccc tcagttcatg ggcggctggg 1860
acaaggataa ggagacagac tatcgggcca ccatcctgag atacggctcc aagtactatc 1920
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aggtgttctt ttctaagaag tggatggcct actataaccc cagcgaggac atccagaaga 2100
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tgatcgactt ctttaaggat agcatctccc ggtatccaaa gtggtccaat gcctacgatt 2220
tcaacttttc tgagacagag aagtataagg acatcgccgg cttttacaga gaggtggagg 2280
agcagggcta taaggtgagc ttcgagtctg ccagcaagaa ggaggtggat aagctggtgg 2340
aggagggcaa gctgtatatg ttccagatct ataacaagga cttttccgat aagtctcacg 2400
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agatcaggct gagcggagga gcagagctgt tcatgaggcg cgcctccctg aagaaggagg 2520
agctggtggt gcacccagcc aactccccta tcgccaacaa gaatccagat aatcccaaga 2580
aaaccacaac cctgtcctac gacgtgtata aggataagag gttttctgag gaccagtacg 2640
agctgcacat cccaatcgcc atcaataagt gccccaagaa catcttcaag atcaatacag 2700
aggtgcgcgt gctgctgaag cacgacgata acccctatgt gatcggcatc gataggggcg 2760
agcgcaatct gctgtatatc gtggtggtgg acggcaaggg caacatcgtg gagcagtatt 2820
ccctgaacga gatcatcaac aacttcaacg gcatcaggat caagacagat taccactctc 2880
tgctggacaa gaaggagaag gagaggttcg aggcccgcca gaactggacc tccatcgaga 2940
atatcaagga gctgaaggcc ggctatatct ctcaggtggt gcacaagatc tgcgagctgg 3000
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aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg caagagatct tcagcaacga 2040
gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa gagtccttcc tggtggaaga 2100
ggataagaag cacgagcggc accccatctt cggcaacatc gtggacgagg tggcctacca 2160
cgagaagtac cccaccatct accacctgag aaagaaactg gtggacagca ccgacaaggc 2220
cgacctgcgg ctgatctatc tggccctggc ccacatgatc aagttccggg gccacttcct 2280
gatcgagggc gacctgaacc ccgacaacag cgacgtggac aagctgttca tccagctggt 2340
gcagacctac aaccagctgt tcgaggaaaa ccccatcaac gccagcggcg tggacgccaa 2400
ggccatcctg tctgccagac tgagcaagag cagacggctg gaaaatctga tcgcccagct 2460
gcccggcgag aagaagaatg gcctgttcgg caacctgatt gccctgagcc tgggcctgac 2520
ccccaacttc aagagcaact tcgacctggc cgaggatgcc aaactgcagc tgagcaagga 2580
cacctacgac gacgacctgg acaacctgct ggcccagatc ggcgaccagt acgccgacct 2640
gtttctggcc gccaagaacc tgtccgacgc catcctgctg agcgacatcc tgagagtgaa 2700
caccgagatc accaaggccc ccctgagcgc ctctatgatc aagagatacg acgagcacca 2760
ccaggacctg accctgctga aagctctcgt gcggcagcag ctgcctgaga agtacaaaga 2820
gattttcttc gaccagagca agaacggcta cgccggctac attgacggcg gagccagcca 2880
ggaagagttc tacaagttca tcaagcccat cctggaaaag atggacggca ccgaggaact 2940
gctcgtgaag ctgaacagag aggacctgct gcggaagcag cggaccttcg acaacggcag 3000
catcccccac cagatccacc tgggagagct gcacgccatt ctgcggcggc aggaagattt 3060
ttacccattc ctgaaggaca accgggaaaa gatcgagaag atcctgacct tccgcatccc 3120
ctactacgtg ggccctctgg ccaggggaaa cagcagattc gcctggatga ccagaaagag 3180
cgaggaaacc atcaccccct ggaacttcga ggaagtggtg gacaagggcg cttccgccca 3240
gagcttcatc gagcggatga ccaacttcga taagaacctg cccaacgaga aggtgctgcc 3300
caagcacagc ctgctgtacg agtacttcac cgtgtataac gagctgacca aagtgaaata 3360
cgtgaccgag ggaatgagaa agcccgcctt cctgagcggc gagcagaaaa aggccatcgt 3420
ggacctgctg ttcaagacca accggaaagt gaccgtgaag cagctgaaag aggactactt 3480
caagaaaatc gagtgcttcg actccgtgga aatctccggc gtggaagatc ggttcaacgc 3540
ctccctgggc acataccacg atctgctgaa aattatcaag gacaaggact tcctggacaa 3600
tgaggaaaac gaggacattc tggaagatat cgtgctgacc ctgacactgt ttgaggacag 3660
agagatgatc gaggaacggc tgaaaaccta tgcccacctg ttcgacgaca aagtgatgaa 3720
gcagctgaag cggcggagat acaccggctg gggcaggctg agccggaagc tgatcaacgg 3780
catccgggac aagcagtccg gcaagacaat cctggatttc ctgaagtccg acggcttcgc 3840
caacagaaac ttcatgcagc tgatccacga cgacagcctg acctttaaag aggacatcca 3900
gaaagcccag gtgtccggcc agggcgatag cctgcacgag cacattgcca atctggccgg 3960
cagccccgcc attaagaagg gcatcctgca gacagtgaag gtggtggacg agctcgtgaa 4020
agtgatgggc cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa atggccagag agaaccagac 4080
cacccagaag ggacagaaga acagccgcga gagaatgaag cggatcgaag agggcatcaa 4140
agagctgggc agccagatcc tgaaagaaca ccccgtggaa aacacccagc tgcagaacga 4200
gaagctgtac ctgtactacc tgcagaatgg gcgggatatg tacgtggacc aggaactgga 4260
catcaaccgg ctgtccgact acgatgtgga ccacatcgtg cctcagagct ttctgaagga 4320
cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag gcccggggca agagcgacaa 4380
cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac tggcggcagc tgctgaacgc 4440
caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag gccgagagag gcggcctgag 4500
cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg gaaacccggc agatcacaaa 4560
gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag tacgacgaga atgacaagct 4620
gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg gtgtccgatt tccggaagga 4680
tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac cacgcccacg acgcctacct 4740
gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct aagctggaaa gcgagttcgt 4800
gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc gccaagagcg agcaggaaat 4860
cggcaaggct accgccaagt acttcttcta cagcaacatc atgaactttt tcaagaccga 4920
gattaccctg gccaacggcg agatccggaa gcggcctctg atcgagacaa acggcgaaac 4980
cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc gtgcggaaag tgctgagcat 5040
gccccaagtg aatatcgtga aaaagaccga ggtgcagaca ggcggcttca gcaaagagtc 5100
tatcctgccc aagaggaaca gcgataagct gatcgccaga aagaaggact gggaccctaa 5160
gaagtacggc ggcttcgaca gccccaccgt ggcctattct gtgctggtgg tggccaaagt 5220
ggaaaagggc aagtccaaga aactgaagag tgtgaaagag ctgctgggga tcaccatcat 5280
ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg gaagccaagg gctacaaaga 5340
agtgaaaaag gacctgatca tcaagctgcc taagtactcc ctgttcgagc tggaaaacgg 5400
ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag ggaaacgaac tggccctgcc 5460
ctccaaatat gtgaacttcc tgtacctggc cagccactat gagaagctga agggctcccc 5520
cgaggataat gagcagaaac agctgtttgt ggaacagcac aagcactacc tggacgagat 5580
catcgagcag atcagcgaat tctccaagag agtgatcctg gccgacgcta atctggacaa 5640
ggtgctgagc gcctacaaca agcacagaga caagcctatc agagagcagg ccgagaatat 5700
catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc gccttcaagt actttgacac 5760
caccatcgac cggaagaggt acaccagcac caaagaggtg ctggacgcca ccctgatcca 5820
ccagagcatc accggcctgt acgagacacg gatcgacctg tctcagctgg gaggcgacgc 5880
ctatccctat gacgtgcccg attatgccag cctgggcagc ggctccccca agaaaaaacg 5940
caaggtggaa gatcctaaga aaaagcggaa agtggacggc attggtagtg ggagcaacgg 6000
cagcagcgga tccaacggtc cgggtggatc tggaggtgga ggttctggag gagaagaact 6060
tttgagcaag aattatcatc ttgagaacga agtggctcgt cttaagaaag gttctggcag 6120
tggagaagaa ctgctttcaa agaattacca cctggaaaat gaggtagcta gactgaaaaa 6180
ggggagcgga agtggggagg agttgctgag caaaaattat catttggaga acgaagtagc 6240
acgactaaag aaagggtccg gatcgggtga ggagttactc tcgaaaaatt atcatctcga 6300
aaacgaagtg gctcggctaa aaaagggcag tggttctgga gaagagctat tatctaaaaa 6360
ctaccacctc gaaaatgagg tggcacgctt aaaaaaggga agtggcagtg gtgaagagct 6420
actatccaag aattatcatc ttgagaacga ggtagcgcgt ttgaagaagg gttccggctc 6480
aggagaggaa ctgctctcga agaactatca tcttgaaaat gaggtcgctc gattaaaaaa 6540
gggatcgggc agtggtgagg aactactttc aaagaattac cacctcgaaa acgaagtagc 6600
tcgattaaag aaaggttcag ggtcgggtga agaattactg agtaaaaatt atcatctgga 6660
aaatgaggta gcgagactaa aaaaggggag tggttctggc gaagagttgc tatcgaaaaa 6720
ttatcatctt gagaacgaag ttgctaggct caaaaagggc tcaggctcag gcgaggagtt 6780
gctctcgaaa aactaccact tggaaaatga ggtcgcgagg ttgaaaaagg ggagcgggtc 6840
gggcgaggag ttattgagca aaaactatca tttagagaac gaagtcgcgc gcttaaagaa 6900
aggctcgggc tcgggcgaag aactcttatc gaagaactac cacctcgaaa atgaggtcgc 6960
caggttgaaa aagggcagtg gcagcgggga ggaactcttg agcaagaact accacttgga 7020
gaatgaggtc gcgagattga agaaagggtc ggggagcggc gaggaattgc tcagcaagaa 7080
ttatcatttg gagaacgaag tcgccaggct caagaaaggc tcggggtcgg gggaggaatt 7140
gttgagtaaa aactaccact tggaaaatga agtcgccagg ctcaaaaaag ggagtgggag 7200
cggcgaagag ttattgagca aaaattacca cttggagaac gaagtggcaa ggctcaagaa 7260
agggagcggc agcggggagg agctcttatc gaagaactac cacttagaga atgaagtcgc 7320
ccgcttgaag aaaggctcgg ggagcgggga agagctcttg agcaagaact accacttgga 7380
aaatgaggtg gcgcgcttga agaaagggag cgggagcggg gaagagttac tatctaagaa 7440
ttatcatctc gagaacgagg tggctcgact aaagaagggc tccggcagtg gggaggaact 7500
cctgtcgaag aactatcatc ttgaaaatga ggttgcaaga cttaaaaagg ggtccggatc 7560
aggtgaggaa ctactcagta agaattacca cctggaaaac gaagttgcac gtttgaagaa 7620
aggatcagga tcaggcgaag aactgctctc aaaagattat catttggaaa atgaggttgc 7680
acgtttaaaa aagggaagtg gcagtggtga ggaacttctg tcgaaaaatt atcatctcga 7740
gaatgaagta gcccgactta aaaagggttc tggctcgggt 7780
<210> 15
<211> 2913
<212> DNA
<213> pBluSKP-TRE-Luciferase-GSGP2A-mCherry
<400> 15
gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt ttactcccta tcagtgatag 60
agaacgatgt cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct 120
atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg 180
agtttatccc tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag 240
aacgtatgtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 300
aaccgtcaga tcgcctggag aattccgatc aacaagtttg tacaaaaaag caggctccgc 360
ggttttcagg ttggaccgga gctagcatgg aagacgccaa aaacataaag aaaggcccgg 420
cgccattcta tccgctggaa gatggaaccg ctggagagca actgcataag gctatgaaga 480
gatacgccct ggttcctgga acaattgctt ttacagatgc acatatcgag gtggacatca 540
cttacgctga gtacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga agctatgaaa cgatatgggc 600
tgaatacaaa tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc tcttcaattc tttatgccgg 660
tgttgggcgc gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc gaacgacatt tataatgaac 720
gtgaattgct caacagtatg ggcatttcgc agcctaccgt ggtgttcgtt tccaaaaagg 780
ggttgcaaaa aattttgaac gtgcaaaaaa agctcccaat catccaaaaa attattatca 840
tggattctaa aacggattac cagggatttc agtcgatgta cacgttcgtc acatctcatc 900
tacctcccgg ttttaatgaa tacgattttg tgccagagtc cttcgatagg gacaagacaa 960
ttgcactgat catgaactcc tctggatcta ctggtctgcc taaaggtgtc gctctgcctc 1020
atagaactgc ctgcgtgaga ttctcgcatg ccagagatcc tatttttggc aatcaaatca 1080
ttccggatac tgcgatttta agtgttgttc cattccatca cggttttgga atgtttacta 1140
cactcggata tttgatatgt ggatttcgag tcgtcttaat gtatagattt gaagaagagc 1200
tgtttctgag gagccttcag gattacaaga ttcaaagtgc gctgctggtg ccaaccctat 1260
tctccttctt cgccaaaagc actctgattg acaaatacga tttatctaat ttacacgaaa 1320
ttgcttctgg tggcgctccc ctctctaagg aagtcgggga agcggttgcc aagaggttcc 1380
atctgccagg tatcaggcaa ggatatgggc tcactgagac tacatcagct attctgatta 1440
cacccgaggg ggatgataaa ccgggcgcgg tcggtaaagt tgttccattt tttgaagcga 1500
aggttgtgga tctggatacc gggaaaacgc tgggcgttaa tcaaagaggc gaactgtgtg 1560
tgagaggtcc tatgattatg tccggttatg taaacaatcc ggaagcgacc aacgccttga 1620
ttgacaagga tggatggcta cattctggag acatagctta ctgggacgaa gacgaacact 1680
tcttcatcgt tgaccgcctg aagtctctga ttaagtacaa aggctatcag gtggctcccg 1740
ctgaattgga atccatcttg ctccaacacc ccaacatctt cgacgcaggt gtcgcaggtc 1800
ttcccgacga tgacgccggt gaacttcccg ccgccgttgt tgttttggag cacggaaaga 1860
cgatgacgga aaaagagatc gtggattacg tcgccagtca agtaacaacc gcgaaaaagt 1920
tgcgcggagg agttgtgttt gtggacgaag taccgaaagg tcttaccgga aaactcgacg 1980
caagaaaaat cagagagatc ctcataaagg ccaagaaggg cggaaagatc gccgtggaat 2040
tcggcagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc 2100
ctggacctgc cggtatggtg agcaagggcg aggaggataa catggccatc atcaaggagt 2160
tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg 2220
gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg 2280
gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg 2340
cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc cccgagggct 2400
tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact 2460
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gccactacga cgctgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg 2700
gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg 2760
tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc actccaccgg cggcatggac gagctgtaca 2820
agtaagatat caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 2880
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgc 2913
Claims (10)
1.DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于包括CRISPR/dCas-GCN4融合蛋白系统、相分离转录激活因子和向导RNA。
2.如权利要求1所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述CRISPR/dCas-GCN4融合蛋白系统包括EF1α或CAG启动子、dCas-GCN4融合蛋白表达序列；
所述dCas-GCN4融合蛋白表达序列为无核酸酶活性的dCas与多拷贝的GCN4相融合；
所述dCas包括dLbCas12a、dAsCas12a、dspCas9和dUn1Cas12f1中的一种。
3.如权利要求2所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述dUn1Cas12f1的大小为529aa，所述dLbCas12a具有多基因同时激活特性。
4.如权利要求1所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述相分离转录激活因子为特异性结合GCN4的scFv-GCN4序列、绿色荧光蛋白sfGFP、IDRs和转录激活因子相融合的蛋白系统。
5.如权利要求4所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述IDRs包括DDX4、FUS和TAF15中的一种，所述转录激活因子包括VP64、P65和VPR中的一种，所述相分离转录激活因子包括scFv-GCN4-DDX4-VP64、scFv-GCN4-FUS-VP64、scFv-GCN4-TAF15-VP64、scFv-GCN4-DDX4-P65、scFv-GCN4-FUS-P65、scFv-GCN4-TAF15-P65、scFv-GCN4-DDX4-VPR、scFv-GCN4-FUS-VPR或scFv-GCN4-TAF15-VPR。
6.如权利要求1所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述相分离转录激活因子具有相分离特性。
7.如权利要求1所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统，其特征在于所述向导RNA为靶向基因组区域20-23bp的长序列，所述向导RNA包括U6启动子、gRNA识别序列、gRNA骨架序列、U6启动子的终止序列，所述向导RNA的靶向识别基因包括HBG1、IL1RN、TTN、CD69和Fgf21。
8.如权利要求1-5任一所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统在基因工程、生物技术和临床中的应用。
9.如权利要求1-5任一所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统在哺乳动物细胞和哺乳动物体内实现高效靶向基因激活的应用。
10.如权利要求1-5任一所述的DropCRISPRa高效靶向相分离基因激活系统在募集RNA聚合酶Ⅱ和BRD4，提高RNA转录效率中的应用；
所述RNA聚合酶Ⅱ包括RNAPⅡ、RNAPII-CTD-S2。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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