CN102428174A

CN102428174A - 工程再造mRNA一级结构以增强蛋白质产生

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Publication number: CN102428174A
Application number: CN2010800180818A
Authority: CN
Inventors: V·P·莫罗; S·A·查佩尔; 周伟; G·M·伊德尔曼
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2009-02-24
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2012-04-25
Also published as: EP2401365A1; EP2401365A4; US20140370545A1; JP2013520158A; US20120053333A1; JP5735927B2; KR20110126717A; SG174150A1; AU2010218388A1; EP2401365B1; WO2010098861A1; US8853179B2; AU2010218388B2; CA2753362A1; CA2753362C

Abstract

本发明公开用于修饰天然mRNA或工程改造合成mRNA以提高其翻译效率的规则。这些规则描述对mRNA编码序列和3′UTR序列的修饰，旨在通过以下途径增强蛋白质合成：1)通过编码序列中的AUG或非规范起始密码子来减少核糖体转移，和/或2)通过消除编码序列中的一个或多个miRNA结合位点来规避miRNA介导的下调作用。

Description

工程再造mRNA一级结构以增强蛋白质产生

优先权文件引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)主张2009年2月24日申请的题为“Reengineering mRNA Primary Structure for Enhanced Protein Production”的美国临时申请第61/155,049号的优先权权益。上述申请的主题以全文引用的方式并入本文。

背景技术

真核生物中的翻译起始包括通过mRNA在5′帽结构或内部核糖体进入位点(IRES)上募集40S核糖体亚基和翻译机构的其它组分。40S亚基在被募集后移动到起始密码子处。关于翻译起始的一个被广泛接受的观点假设，40S亚基从募集位点移动到起始密码子，所述亚基以5′至3′方向扫描通过5′前导序列，直到遇到存在于良好核苷酸背景中的第一个AUG密码子为止(Kozak“The ScanningModel for Translation：An Update”J.Cell Biol.108：229-241(1989))。最近，已经假设翻译起始不包含扫描，但可能包含核糖体亚基束缚于帽结构或IERS上，或核糖体亚基群集于内部位点上(Chappell等人“Ribosomal shunting mediatedby a translational enhancer element that base pairs to 18S rRNA”PNAS USA103(25)：9488-9493(2006)；Chappell等人，“Ribosomal tethering and clustering asmechanisms for translation initiation”PNAS USA 103(48)：18077-82(2006))。40S亚基移动到可到达的AUG密码子处，所述AUG密码子未必是mRNA中的第一个AUG密码子。一旦亚基通过任何机制到达起始密码子处，与亚基结合的起始物甲硫氨酸-tRNA则和起始密码子进行碱基配对，大(60S)核糖体亚基进行连接，且肽合成开始发生。

因为一般认为翻译是由扫描机制起始，所以已经考虑了5′前导序列内所含的AUG密码子(称为上游AUG密码子)对翻译的影响，且已知5′前导序列内的AUG密码子可对蛋白质合成具有正面或负面影响，这取决于基因、核苷酸背景和细胞条件。举例来说，上游AUG密码子可通过使核糖体从真正起始密码子转移来抑制翻译起始。然而，翻译是由扫描机制起始的观点没有考虑编码序列中的潜在起始密码子对蛋白质合成的影响。与此相反，翻译起始的束缚/群集机制表明，编码序列中的推定起始密码子(其包括AUG密码子和非规范密码子)可被利用，从而通过与真正起始密码子竞争核糖体来降低蛋白质合成速率。

微RNA(miRNA)介导的下调作用也可对翻译效率造成负面影响。miRNA的长度一般介于21至23个核苷酸之间，并且是核糖核蛋白复合物的组分。已经表明miRNA可通过与mRNA进行碱基配对并降低mRNA稳定性、新生肽稳定性和翻译效率而对蛋白质含量造成负面影响(Eulalio等人“Getting to the Root ofmiRNA-Mediated Gene Silencing”Cell 132：9-14(1998))。虽然miRNA一般通过和mRNA的3′非翻译区(UTR)中的结合位点进行碱基配对来介导其作用，但已经显示所述miRNA从编码序列和5′前导序列内所含的结合位点也具有类似的阻抑作用。碱基配对是通过所谓的“种子序列”来发生，所述种子序列包括miRNA的核苷酸2至8。在人类中存在超过1,000种不同的miRNA。

mRNA编码序列和mRNA中的miRNA结合位点中的推定起始密码子的负面影响对医药工业带来挑战。举例来说，用于抗原生产、常规研究目的和基因疗法应用的蛋白质药物、DNA疫苗的工业生产都受到蛋白质合成的未达最佳速率或序列稳定性影响。蛋白质产量增加和蛋白质浓度提高可减少与工业规模培养有关的成本，降低生产药物的成本，且可促进蛋白质纯化。不佳的蛋白质表达会限制某些技术的大规模应用，例如在从DNA疫苗表达足够的抗原方面有问题，从而无法产生免疫应答以用于进行3期临床试验。

发明内容

在本领域中需要提高蛋白质翻译的效率和稳定性并提高蛋白质产量和浓度，例如在蛋白质药物的工业生产中。

公开了一种提高全长蛋白质表达效率的方法。所述方法包括提供多核苷酸，其具有蛋白质的编码序列；在编码序列上游的一级起始密码子；和位于编码序列内的一个或多个二级起始密码子。所述方法还包括使一个或多个二级起始密码子发生突变，导致在所述一个或多个二级起始密码子处的蛋白质合成的起始发生减少，导致偏离一级起始密码子的核糖体转移(ribosomal diversion)减少，从而提高全长蛋白质表达效率。

所述方法还可包括使一个或多个核苷酸发生突变，使得氨基酸序列保持不变。一个或多个二级起始密码子可与编码序列处在相同的阅读框内，或与编码序列不同框。一个或多个二级起始密码子可位于核糖体募集位点上游或下游一个或多个核苷酸的位置。核糖体募集位点可包含帽或IRES。一个或多个二级起始密码子可选自AUG、ACG、GUG、UUG、CUG、AUA、AUC和AUU。所述方法可包括使编码序列内的超过一个二级起始密码子发生突变。所述方法可包括使编码序列内的所有二级起始密码子发生突变。侧翼核苷酸可突变成较不利的核苷酸背景。一个或多个二级起始密码子发生突变可避免引入新的起始密码子。一个或多个二级起始密码子发生突变可避免引入miRNA种子序列。一个或多个二级起始密码子发生突变可避免改变所突变密码子的使用偏好。除全长被编码蛋白质以外的截短蛋白质、多肽或肽的产生可得到减少。一个或多个二级起始密码子发生突变可避免引入miRNA种子序列、剪接供体或受体位点或mRNA去稳定元件。

还公开了一种提高全长蛋白质表达效率的方法。所述方法包括提供多核苷酸序列，其具有蛋白质的编码序列和位于编码序列内的一个或多个miRNA结合位点；和使一个或多个miRNA结合位点发生突变。突变导致一个或多个miRNA结合位点处的miRNA结合发生减少，导致由miRNA介导的蛋白质翻译下调作用发生减少，从而提高全长蛋白质表达效率。

所述方法还可包括使一个或多个核苷酸发生突变，使得氨基酸序列保持不变。所述方法可包括使miRNA种子序列中的一个或多个核苷酸发生突变。所述方法可包括使一个或多个核苷酸发生突变，使得起始密码子不被引入多核苷酸序列中。所述方法可包括使一个或多个核苷酸发生突变，使得稀有密码子不被引入多核苷酸序列中。所述方法可包括使一个或多个核苷酸发生突变，使得额外的miRNA种子序列不被引入多核苷酸序列中。一个或多个miRNA结合位点可位于编码序列内。一个或多个miRNA结合位点可位于3′非翻译区内。一个或多个miRNA结合位点可位于5′前导序列内。

参照说明书的剩余部分和权利要求书，可对本公开书的本质和优点有进一步了解。

附图说明

图1A-1B显示用CAT(菱形)或mCAT表达构建体(正方形)转化的大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞培养物的生长曲线；

图2显示从用CAT(C)或mCAT(mC)表达构建体转化的大肠杆菌DH5α细胞收集的溶菌物的蛋白质印迹分析(Western blot analysis)；

图3显示用野生型CAT或经修饰的CAT表达构建体转化的DG44细胞的提取物的蛋白质印迹分析；

图4显示用野生型CD5(cd5-1)或经修饰的CD5信号肽α-甲状腺球蛋白轻链表达构建体(cd5-2至cd5-5)转化的DG44细胞的上清液的蛋白质印迹分析。

具体实施方式

I.综述

本文描述用于修饰天然mRNA或工程改造合成mRNA以提高被编码蛋白质的含量的方法。这些规则描述对mRNA编码序列和3′UTR序列的修饰，旨在通过以下途径增强蛋白质合成：1)通过编码序列中的AUG或非规范(non-canonical)起始密码子来减少核糖体转移，和/或2)通过消除编码序列中的miRNA结合位点来规避miRNA介导的下调作用。

还描述了工程再造mRNA一级结构的方法，其可用于提高特定蛋白质在真核细胞和细菌细胞中的产量。本文所述的方法可应用于蛋白质药物的工业生产，以及研究目的、基因疗法应用和DNA疫苗以用于增加抗原生产。蛋白质产量增加会最小化与工业规模培养有关的成本并降低药物成本。此外，较高的蛋白质浓度有利于蛋白质纯化。此外，使用本文所述的方法，先前因为较差的蛋白质表达而无法实施的过程(例如在3期临床试验的实施中，或在从DNA疫苗表达足够抗原以产生免疫反应中)可变得可能。

II.定义

本说明书不限于所描述的特定方法、实验方案和试剂，它们可以变化。还应了解本文所用的方法仅用于描述特定实施方案的目的，而不打算限制本发明方法的范围，所述范围将由随附权利要求书描述。

除非上下文明确指示，否则如本文所用的单数形式“一”和“所述”包括复数个指代物。因此，举例来说，提及“一细胞”时包括多个所述细胞，且提及“一蛋白质”时包括一种或多种本领域技术人员已知的蛋白质和等同物，诸如此类。

除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本公开书所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。以下参考文献为所属领域技术人员提供了本公开书中所用的许多术语的一般定义：Academic Press Dictionary ofScience and Technology，Morris(编)，Academic Press(第1版，1992)；OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Smith等人(编)，OxfordUniversity Press(修订版，2000)；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry，Kumar(编)，Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；Dictionary of Microbiology andMolecular Biology，Singleton等人(编)，John Wiley & Sons(第3版，2002)；Dictionary of Chemistry，Hunt(编)，Routledge(第1版，1999)；Dictionary ofPharmaceutical Medicine，Nahler(编)，Springer-Verlag Telos(1994)；Dictionary ofOrganic Chemistry，Kumar和Anandand(编)，Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；和A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference)，Martin和Hine(编)，Oxford University Press(第4版，2000)。这些术语中的部分术语在其具体地应用于本公开书时得到进一步解释。

术语“试剂”包括任何物质、分子、元件、化合物、实体或其组合。其包括(但不限于)例如蛋白质、多肽、小有机分子、多糖、多核苷酸等。其可以是天然产物、合成化合物(synthetic compound)、或化学化合物(chemicalcoumpound)，或两种或更多种物质的组合。除非另外说明，否则术语“试剂”、“物质”和“化合物”在本文中可互换使用。

术语“顺反子”意思是编码单一多肽或蛋白质的DNA单元。术语“转录单元”是指在其中发生RNA合成的DNA片段。

术语“DNA疫苗”是指可引入宿主细胞或组织中并在其中由细胞表达以产生信使核糖核酸(mRNA)分子的DNA，mRNA然后被翻译以产生由所述DNA编码的疫苗抗原。

术语“目的基因”旨在包括顺反子、开放阅读框(ORF)或编码其产生将被调节的蛋白质产物(目的蛋白质)的多核苷酸序列。目的基因的实例包括编码治疗蛋白质、营养蛋白质和工业用途蛋白质的基因。目的基因还可包括报告基因或选择标记基因，例如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶基因(海肾(Renilla)或萤火虫(Photinus))。

表达是从DNA产生多肽的过程。所述过程涉及基因转录为mRNA和mRNA随后翻译为多肽。

如本文所用的术语“内源”是指通常在野生型宿主中发现的基因，而术语“外源”则是指通常不在野生型宿主中发现的基因。

“宿主细胞”是指拟引入或已经引入异源多核苷酸序列的活细胞。活细胞包括培养的细胞和活生物体内的细胞。将异源多核苷酸序列引入细胞中的方式众所周知，例如转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染等。拟引入细胞中的异源多核苷酸序列通常是复制表达载体或克隆载体。在一些实施方案中，宿主细胞可被工程改造成在其染色体上或在其基因组内并入期望基因。可用于实施本发明方法的许多宿主细胞(例如CHO细胞)是用作此项技术中众所周知的宿主。参看例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press(第3版，2001)；和Brent等人，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(Ringbou编，2003)。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。

术语“诱导剂”用于表示可实现从诱导型翻译调节元件进行翻译的化学、生物或物理试剂。暴露于诱导剂之后作出反应，从元件的翻译一般从头开始或增加至大于基础表达或组成型表达水平的程度。诱导剂可以是例如细胞所暴露的压力条件，例如热激或冷激；毒性剂，例如重金属离子；或营养物、激素、生长因子等的缺乏；或者可以是影响细胞生长或分化状态的化合物，例如激素或生长因子。

短语“分离或纯化的多核苷酸”旨在包括一段多核苷酸序列(例如DNA)，其已经在两端与其在生物体天然存在的基因组中直接邻近的序列相分离。纯化的多核苷酸可以是双链或单链寡核苷酸；并入载体中的多核苷酸片段；插入真核或原核生物体的基因组中的片段；或用作探针的片段。短语“基本上纯”当涉及多核苷酸时意谓分子已经与其它伴随生物组分分离，因此典型地其具有样品的至少85％或更高百分比。

术语“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸”或“多核苷酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，且除非另外限制，否则涵盖以与天然存在的核苷酸类似的方式和核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。核酸序列可以是例如原核生物序列、真核生物mRNA序列、来自真核生物mRNA的cDNA序列、来自真核生物DNA(例如哺乳动物DNA)的基因组DNA序列、和合成DNA或RNA序列，但不限于此。

术语“启动子”意谓能引导转录并自其开始转录的核酸序列。在本领域中已知许多启动子序列。举例来说，所述元件可包括(但不限于)TATA盒、CCAAT盒、噬菌体RNA聚合酶特异性启动子(例如T7、SP6和T3启动子)、SP1位点和环AMP反应元件。如果启动子是诱导型，那么其活性会对诱导剂作出反应而增加。

5′(five prime)前导序列或非翻译区(5′前导、5′前导序列或5′UTR)是信使RNA(mRNA)和编码其的DNA的特定片段。其始于+1位置(转录在此处开始)且结束于编码区的起始密码子(典型地是AUG)之前。在细菌中，其可含有被称为Shine-Delgarno序列的核糖体结合位点(RBS)。5′前导序列的长度可在零核苷酸(在罕见的无前导序列信使中)至＞1,000个核苷酸的范围内。3′UTR往往更长(长达几千碱基)。

术语“可操作地连接”或“可操作地结合”是指遗传元件之间的功能性连接，所述元件以允许其执行正常功能的方式接合。举例来说，如果基因的转录处于启动子的控制下且所产生的转录物被正确地翻译成通常由所述基因编码的蛋白质，那么所述基因可操作地连接于启动子。类似地，如果翻译增强子元件允许从基因转录的mRNA的翻译被上调，那么所述翻译增强子元件与所述基因可操作地结合。

适用于定向连接的核苷酸序列(例如多聚接头)是表达载体中可为多核苷酸序列定向连接至载体中而提供位点或手段的区域。典型地，定向多聚接头是定义两个或两个以上限制性核酸内切酶识别序列或限制位点的核苷酸序列。在限制性切割之后，所述两个位点产生粘性末端，多核苷酸序列可通过所述粘性末端连接于表达载体。在一实施方案中，所述两个限制性位点在限制性切割之后提供非互补且从而允许多核苷酸序列定向插入序列盒中的粘性末端。举例来说，适用于定向连接的核苷酸序列可含有定义多个定向克隆手段的核苷酸序列。当适用于定向连接的核苷酸序列定义多个限制性位点时，其被称为多克隆位点。

用于治疗目的的术语“受试对象”是指分类为哺乳动物(例如人)和非人哺乳动物的任何动物。非人动物的实例包括狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试对象”在本文中可互换使用。在一实施方案中，受试对象是人。

转录因子是指开始或调控转录所必需的任何多肽。举例来说，所述因子包括(但不限于)c-Myc、c-Fos、c-Jun、CREB、cEts、GATA、GAL4、GAL4/Vp16、c-Myb、MyoD、NF-κB、噬菌体特异性RNA聚合酶、Hif-1和TRE。编码所述因子的序列的实例包括(但不限于)GenBank登记号K02276(c-Myc)、K00650(c-fos)、BC002981(c-jun)、M27691(CREB)、X14798(cEts)、M77810(GATA)、K01486(GAL4)、AY136632(GAL4/Vp16)、M95584(c-Myb)、M84918(MyoD)、2006293A(NF-κB)、NP 853568(SP6RNA聚合酶)、AAB28111(T7RNA聚合酶)、NP 523301(T3RNA聚合酶)、AF364604(HIF-1)和X63547(TRE)。

“基本上同一的”核酸或氨基酸序列是指如通过本文所述的众所周知的程序(例如BLAST)之一、使用标准参数所测量，包含与参考序列具有至少90％序列同一性的序列的核酸或氨基酸序列。序列同一性可为至少95％、至少98％和至少99％。在一些实施方案中，目标序列的长度与参考序列相比大致相同，即它们由大致相同数目的连续氨基酸残基(对于多肽序列来说)或核苷酸残基(对于多核苷酸序列来说)组成。

序列同一性可通过所属领域中已知的各种方法来容易地确定。举例来说，BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下默认值：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，和两条链都比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下默认值：字长(W)为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62得分矩阵(参看Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。序列同一性百分比是通过在比较窗口上比较两个最佳联配的序列来确定，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可包含添加或缺失(即空位)，以进行这两个序列的最佳联配。百分比是如下计算：确定在两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口中的总位置数目，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

术语“治疗”或“减轻”包括对受试对象施用化合物或试剂以预防或延迟疾病(例如心脏功能障碍)的症状、并发症或生化指标的开始，减轻症状，或阻止或抑制疾病、病症或紊乱的进一步发展。需要治疗的受试对象包括已经罹患疾病或病症的患者，以及容易患上病症的受试对象或待预防病症的受试对象。

治疗可以是预防性的(用于预防或延迟疾病的开始，或用于预防其临床或临床前症状的表现)，或疾病表现后的症状的治疗性抑制或减轻。在心脏重构和/或心脏衰竭的治疗中，治疗剂可直接减轻疾病的病理，或使疾病更容易被其它治疗剂所治疗。

术语“载体”或“构建体”是指多核苷酸序列元件，其以确定的组织模式排列，以便可操作地连接于这些元件的基因/基因产物的表达可预测地受到控制。典型地，它们是可传递的多核苷酸序列(例如质粒或病毒)，外来DNA的片段可被剪接入其中，以便将外来DNA引入宿主细胞以促进所述片段的复制和/或转录。

克隆载体是DNA序列(典型地是质粒或噬菌体)，其可在宿主细胞中自主复制，且特征是具有一个或少量的限制性核酸内切酶识别位点。外来DNA片段可在这些位点上剪接入载体中，以便实现片段的复制和克隆。载体可含有一个或多个适用于鉴别被转化细胞的标志物。举例来说，标志物可提供四环素或氨苄西林抗性。

表达载体类似于克隆载体，但能诱导已经克隆入其中的DNA在转化入宿主中之后进行表达。克隆的DNA通常处于特定调控序列(例如启动子或增强子)的控制下(即可操作地连接于所述调控序列)。启动子序列可以是组成型、诱导型或阻抑型的。

“起始密码子”或“起始三联体”是顺反子内开始蛋白质合成的位置。其一般位于编码序列的5′端。在真核生物mRNA中，起始密码子典型地由编码氨基酸甲硫氨酸(Met)的三个核苷酸(腺嘌呤、尿嘧啶和鸟嘌呤(AUG)核苷酸)组成。在细菌中，起始密码子典型地也是AUG，但此密码子编码经修饰的甲硫氨酸(N-甲酰基甲硫氨酸(fMet))。在真核生物和细菌中，除AUG以外的核苷酸三联体有时也用作起始密码子。

“下游起始密码子”是指位于真正起始密码子下游的起始密码子，典型地在基因的编码区中。“上游起始密码子”是指在5′前导区中位于真正起始密码子上游的起始密码子。

如本文所用，“上游”和“下游”是指相对于真正起始密码子的位置。举例来说，mRNA序列上的上游密码子是相对于序列中的另一个位置(例如真正起始密码子)朝向mRNA序列5′端的密码子，且下游密码子是指相对于序列中的另一个位置朝向mRNA序列3′端的密码子。

如本文所用，“真正起始密码子”或“一级起始密码子”是指顺反子中的起始密码子，其编码产生待被调节的被编码目的蛋白质的编码序列的第一个氨基酸。“二级起始密码子”是指除一级或真正起始密码子以外的用于被编码目的蛋白质的起始密码子。二级起始密码子一般处在一级或真正起始密码子的下游且位于编码序列内。

如本文所用，“增加的蛋白质表达”是指其中一个或多个二级起始密码子被突变的被修饰mRNA的翻译所产生的多肽浓度比从其中一个或多个二级起始密码子未被突变的野生型mRNA获得的多肽浓度高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％或以上。增加的蛋白质表达也可以指被突变mRNA的蛋白质表达是野生型mRNA的1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍或以上。

如本文所用，“核糖体募集位点”是指mRNA内的位点，在被编码蛋白质的翻译起始之前，核糖体亚基与所述位点结合。核糖体募集位点可包括帽结构(一种在mRNA的5′端发现的经修饰核苷酸(m⁷G帽-结构))，和包含在mRNA中的被称为内部核糖体进入位点(IRES)的序列。其它核糖体募集位点可包括Gtx同源异型域mRNA的9核苷酸序列。核糖体募集位点通常在真正起始密码子的上游，但也可在真正起始密码子的下游。

如本文所用，“使用偏好”是指生物体对编码相同氨基酸的几种密码子中的一种显示特定偏好。改变使用偏好是指进行突变，导致对于相同氨基酸以高于或低于原始密码子的优先性使用不同的密码子。

如本文所用，“全长蛋白质”是指涵盖编码蛋白质的基因所编码的基本上每一个氨基酸的蛋白质。所属领域技术人员已知在活细胞中一些蛋白质存在细微修饰，因此蛋白质实际上是一组具有细微变化的紧密相关的蛋白质。举例来说，一些但并非所有蛋白质a)在氨基端去除氨基酸，和/或b)添加有可增加分子量的化学基团。所编码的大多数细菌蛋白质在蛋白质的氨基端含有甲硫氨酸和丙氨酸残基；在细菌细胞中，这些残基中的一个或两个经常从蛋白质的活性形式去除。这些类型的修饰典型地是异源的，因此并非所有修饰都对每个分子发生。因此，天然“全长”分子实际上是始于相同氨基酸序列但修饰方式有细微差别的分子家族。术语“全长蛋白质”涵盖这样的分子家族。

如本文所用，“拯救”或“修饰”是指从编码区去除大部分至所有二级起始密码子的核苷酸变化。“部分修饰”是指从编码区去除二级起始密码子的所有可能突变的子集的核苷酸变化。

III.经由下游起始密码子减少核糖体转移

如上所述，众所周知包含于5′前导序列内的特征可影响翻译效率。举例来说，5′前导序列内的AUG密码子(称为上游AUG密码子)对蛋白质合成可具有正面或负面影响，这取决于基因、核苷酸背景和细胞条件。上游AUG密码子可通过使核糖体从真正起始密码子转移来抑制翻译起始(Meijer等人，“Translational Control of the Xenopus laevis Connexin-41 5′-Untranslated Region byThree Upstream Open Reading Frames”J.Biol.Chem.275(40)：30787-30793(2000))。举例来说，Meijer等人的图6和图8显示5′前导序列内的上游AUG密码子的核糖体转移效应。

虽然AUG/ATG是许多物种中常用的翻译起始密码子，但是已知翻译在体内有时候也可在其它上游密码子处起始，包括ACG、GUG/GTG、UUG/TTG、CUG/CTG、AUA/ATA、AUC/ATC和AUU/ATT。举例来说，已经显示，当小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)的起始密码子被突变为ACG时，哺乳动物核糖体可在非AUG三联体处开始翻译(Peabody，D.S.(1987)J.Biol.Chem.262，11847-11851)。Peabody所进行的进一步研究显示，dhfr的突变型起始密码子AUG(GUG、UUG、CUG、AUA、AUC和AUU)都能够引导表面上正常的dhfr的合成(Peabody，D.S.(1989)J.Biol.Chem.264，5031-5035)。

翻译起始的束缚和群集模型假设翻译可在易得到的起始密码子处起始，且研究已经显示起始密码子可在核糖体募集位点(帽或IRES)下游以距离依赖性方式使用(Chappell等人“Ribosomal tethering and clustering as mechanisms fortranslation initiation”PNAS USA 103(48)：18077-822006)。这表明也可使用编码序列中的推定起始密码子。在下游起始密码子或二级起始位点处的翻译起始可与真正起始密码子或一级起始位点竞争核糖体，且降低被编码蛋白质的表达。降低这些二级起始位点的可用性(例如通过使其突变成非起始密码子)可提高一级起始位点对于核糖体的可用性并得到更有效的被编码蛋白质的表达。

本发明方法允许改良且更有效的蛋白质表达，且降低各种起始密码子之间对于翻译机构的竞争。通过消除编码序列中与被编码蛋白质处于相同阅读框中的下游起始密码子，功能可能改变的截短蛋白质的产生也会被消除。此外，通过消除与编码序列不同框的下游起始密码子，各种肽的产生也会被消除，其中一些可能对细胞生理学或蛋白质制造具有负面影响。这种优势对于DNA疫苗或基因疗法中的应用可能尤其重要。

下游起始密码子可发生直接突变，使得被编码氨基酸序列保持不变。因为遗传密码是简并的且大多数氨基酸是由两种或两种以上密码子编码，所以这在许多情况下是可能的。唯一的例外是甲硫氨酸和色氨酸，它们分别仅由一种密码子AUG和UGG编码。同样也会考虑改变氨基酸序列的下游起始密码子突变。在这些情况下，可评估改变氨基酸序列的影响。或者，如果氨基酸序列打算保持不变，那么推定起始密码子的侧翼核苷酸有时候可经突变以降低起始密码子的效率。对于AUG密码子来说，这可根据由Marilyn Kozak(Kozak，M.(1984)Nature 308，241-246)制定的核苷酸背景规则(nucleotide context rule)来进行，所述文献描述，在优异背景中的AUG在位置-3含有嘌呤且在+4含有G，其中AUG被编号成+1、+2、+3。

对于非AUG密码子，类似规则似乎适用于来自位置+5和+6的核苷酸的其它决定子。在设计突变时，密码子使用偏好在许多情况下可保持相对不变，例如通过引入与野生型密码子具有类似密码子偏好的突变密码子。因为不同的生物体具有不同的密码子使用频率，所以针对不同生物体的细胞中的表达的特定突变也会相应改变。

应了解本文所公开的方法不限于真核细胞，同样适用于细菌。虽然细菌翻译起始被认为与真核生物不同，但是核糖体募集仍然是通过mRNA中的顺式元件发生，所述元件包括所谓的Shine-Delgarno序列。细菌中的非AUG起始密码子包括ACG、GUG、UUG、CUG、AUA、AUC和AUU。

在一实施方案中，公开了对编码序列的修饰，其通过经由下游起始密码子减少核糖体转移来促进蛋白质合成。这些密码子可包括AUG/ATG和其它已知在细胞中用作起始密码子的核苷酸三联体密码子，包括(但不限于)ACG、GUG/GTG、UUG/TTG、CUG/CTG、AUA/ATA、AUC/ATC和AUU/ATT。在一个实施方案中，下游起始密码子被突变。工程再造mRNA编码序列以增加蛋白质产生可包括使所有下游起始密码子突变，或可包括仅使一些下游起始密码子突变。在另一个实施方案中，侧翼核苷酸被突变成较不利的核苷酸背景。在一实施方案中，信号肽中的ATG密码子可突变成ATC密码子，导致甲硫氨酸被异亮氨酸取代。在另一个实施方案中，信号肽中的CTG密码子可突变成CTC。在另一个实施方案中，ATG密码子可突变成ATC密码子，导致从甲硫氨酸(M)到异亮氨酸(I)的氨基酸取代，且CTG密码子可突变成CTC。在另一个实施方案中，ATG密码子可突变成ATC密码子，CTG密码子可突变成CTC密码子，且起始物AUG的背景可通过将起始物的3′密码子由CCC改变为GCT从而导致脯氨酸(P)到精氨酸(R)的氨基酸取代而获得改善。在其它实施方案中，可对信号肽进行修饰，其中可去除一个或多个AUG和CUG密码子。进行的修饰可包括：通过去除大部分潜在起始密码子来修饰信号肽；去除信号肽的ATG和CTG；去除ATG、CTG和ACG密码子，导致谷氨酸(E)到谷氨酰胺(Q)的氨基酸取代或组氨酸(H)到精氨酸(R)的氨基酸取代。

可使用标准分子生物学技术来产生突变的核酸序列。所述技术包括各种核酸操作技术、核酸转移实验方案、核酸扩增实验方案和所属领域中已知的其它分子生物学技术。举例来说，可通过使用寡核苷酸介导的定点诱变将点突变引入目的基因中。也可通过使用所合成的具有期望突变的寡核苷酸，以合成方法产生被修饰的序列。这些方法可用于在一个位点或在整个编码区中引入突变。或者，可使用同源重组将突变或外来序列引入目的靶序列中。核酸转移实验方案包括氯化钙转化/转染、电穿孔、脂质体介导的核酸转移、N-[1-(2，3-二油氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵甲基硫酸盐介导的转化等。在一替代性诱变实验方案中，也可使用正选择压力来选择特定基因的点突变。参看例如Current Techniques inMolecular Biology(Ausubel等人编)。核酸扩增实验方案包括(但不限于)聚合酶链式反应(PCR)。所属领域中众所周知，对于各种各样的病毒和细胞生物体可使用核酸工具，例如质粒、载体、启动子和其它调控序列。此外，许多核酸工具可从多种不同来源获得，包括ATCC和各种商业来源。所属领域技术人员根据所属领域中的知识和设计选择，可容易地选择适当工具和方法用于任何特定病毒或细胞生物体的遗传修饰。也可使用各种标准方法测量蛋白质表达。这些方法包括(但不限于)蛋白质印迹分析、ELISA、代谢标记和酶活性测量法。

IV.规避miRNA介导的下调作用

微RNA是一类含量丰富的非编码小RNA，其一般用作负基因调节剂。在一实施方案中，可对包括5′前导序列、编码序列和3′UTR在内的mRNA序列进行修饰，以规避miRNA介导的下调作用。所述修饰因此可改变mRNA或新生肽稳定性，并增强蛋白质合成和翻译效率。

miRNA可以是一般介于21至23个核苷酸之间的RNA，其是核糖核蛋白复合物的组分。miRNA可通过与mRNA的碱基配对来影响mRNA稳定性或蛋白质合成。miRNA一般通过与mRNA的3′UTR中的结合位点的碱基配对来介导其作用。然而，已经显示其对编码序列和5′前导序列内的结合位点具有类似的阻抑作用。碱基配对是通过所谓的“种子序列”来发生，所述种子序列由miRNA的核苷酸2至8组成。在人类中存在超过1,000种不同的miRNA。

工程再造mRNA以规避miRNA介导的阻抑作用可包括使mRNA内的所有种子序列突变。如同上文所述的起始密码子突变一样，这些突变可确保所编码的氨基酸序列保持不变，且不会引入起始密码子、稀有密码子或其它miRNA种子序列。

可使用计算机程序根据目的细胞类型(例如用于在中国仓鼠卵巢细胞中表达的啮齿动物细胞，或用于在人细胞系中表达或用于在DNA疫苗中应用的人细胞)来工程再造mRNA序列。此程序可重新编码mRNA以消除除所述起始密码子以外的潜在起始密码子。在编码序列中的同框AUG密码子的情况下，如有可能，这些下游起始密码子的背景可被弱化。突变可根据目的细胞系的密码子偏好来进行，例如对于人细胞系可使用人密码子偏好信息，对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可使用酿酒酵母密码子偏好信息，且对于大肠杆菌(E.coli)可使用大肠杆菌密码子偏好信息。在高等真核生物mRNA中，则可在重新编码的mRNA中搜索目的生物体中的所有已知种子序列，例如用于人细胞系的人种子序列。种子序列可基于以下考虑因素突变：1)不破坏氨基酸序列，2)不显著改变被突变密码子的使用偏好，3)不引入新的推定起始密码子。

虽然本说明书含有许多细节且已参考其优选实施方案而被描述，但是这些实施方案不应视为限制所要求保护的方法或可能要求保护的主题的范围，而是描述特定实施方案所特有的特征。所属领域技术人员应了解，在不偏离所描述的标的物的含义的情况下，可在本发明中进行形式和细节上的各种变化。在本说明书中于单独实施方案的情形下描述的某些特征也可在单一实施方案中组合实施。相反，在单一实施方案的情形下描述的各种特征也可在多个实施方案中分开实施或以任何合适的子组合实施。此外，虽然特征被上文描述为以特定组合且甚至如最初所主张的那样起作用，但是所主张组合中的一个或多个特征在有些情况下可以从所述组合中去除，且所主张组合可针对子组合或子组合的变体。所述主题的范围是由以下权利要求书限定。

本说明书中引用的所有出版物、数据库、GenBank序列、专利和专利申请以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同各自具体地且个别地以引用的方式并入一般。

实施例

以下实施例用于进一步说明，而不是限制范围。其它变体对于所属领域的普通技术人员具有显而易见性，且被随附权利要求书所涵盖。

实施例1：修饰mRNA转录物内的多个翻译起始位点

mRNA转录物的5’-UTR和编码区内存在多个翻译起始位点可降低翻译效率，例如通过使核糖体从真正或已被证实的翻译起始密码子转移。或者或另外，在真正或已被证实的翻译起始密码子下游存在多个翻译起始位点可诱导一种或多种降低全长蛋白质翻译效率的蛋白质同种型的翻译。为了提高编码有商业价值的人蛋白质的mRNA转录物的翻译效率，真正或已被证实的翻译起始密码子上游和下游的所有阅读框内的潜在翻译起始位点被突变以消除这些位点。在此方法的优选方面中，mRNA序列被改变，但编码的所得氨基酸保持相同。或者，诱导保守性变化，其取代具有类似物理性质的氨基酸。

规范翻译起始密码子是AUG/ATG。其它被鉴别的起始密码子包括(但不限于)ACG、GUG/GTG、UUG/TTG、CUG/CTG、AUA/ATA、AUC/ATC和AUU/ATT。

细胞内蛋白质：氯霉素乙酰转移酶(CAT)

氯霉素是一种通过结合50S核糖体亚基并防止肽键形成来干扰细菌蛋白质合成的抗生素。抗性基因(cat)编码乙酰转移酶，所述酶通过乙酰化氯霉素的一个或两个羟基来乙酰化该药物并从而使其失活。CAT的未经修饰的开放阅读框含有113个潜在起始密码子(20个ATG(包括真正起始密码子)、8个ATC、8个ACG、12个GTG、8个TTG、11个CTG、6个AGG、10个AAG、16个ATA和14个ATT密码子)(SEQ ID NO：120)。SEQ ID NO：121是经完全修饰的CAT ORF，且SEQ ID NO：122是经部分修饰的CAT ORF，其中只进行部分潜在修饰。

图1A-1B显示产生了细菌表达构建体，其含有CAT顺反子(CAT)和经部分修饰的CAT顺反子(mCAT)，且所述构建体在大肠杆菌菌株DH5α进行测试。DH5α细胞用CAT和mCAT表达构建体转化，并铺板于LB/氨苄西林培养板上。从单一菌落获得培养物，并在LB/氨苄西林(～50μg/ml)中在37℃于220rpm下振荡培养，直到通过测量培养物的A₆₀₀而确定了达到对数生长为止。培养物然后用LB/氨苄西林稀释以获得相当的A₆₀₀。从用CAT表达构建体转化的DH5α细胞获得的培养物的A₆₀₀是0.3，而从用mCAT表达构建体转化的DH5α细胞获得的培养物的A₆₀₀是0.25。通过引入异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，最终浓度为0.4mM)，通过CAT和mCAT质粒内所含的lac操纵子来诱导氯霉素乙酰转移酶表达。将3毫升的每种培养物转移到含有氯霉素的新鲜试管中，导致最终浓度为20、40、80、160、320、640、1280和2560μg/ml。培养物在37℃在220rpm下振荡培养，并以1小时的间隔测量每种培养物的A₆₀₀。

图1A-1B显示用CAT(菱形)和mCAT(正方形)表达构建体转化的DH5α细胞培养物的生长曲线。通过加入IPTG(0.4mM终浓度)来诱导氯霉素乙酰转移酶表达。将3毫升的含IPTG的培养物加入含有氯霉素的新鲜试管中，导致最终浓度为0、40、80、160、320、640、1280和2560μg/ml。培养物在37℃在220rpm下振荡培养，并随着时间测量每种培养物的A₆₀₀。显示了在320和640μg/ml氯霉素存在下生长的培养物的结果。X轴代表时间(小时)，Y轴代表经归一化(normalized)的A₆₀₀(相对于起始A₆₀₀)。

结果显示在所有浓度下，用mCAT表达构建体转化的细菌的生长都要好于用CAT表达构建体转化的细菌。如图1A-1B所示，在高浓度的氯霉素(320和640μg/ml)下，具有被修饰CAT的细胞仍然生长，而具有野生型CAT的细胞则不生长。这些结果表明，从mCAT构建体表达了更多的功能性氯霉素乙酰转移酶，从而允许用此种表达构建体转化的细菌在此种抗生素存在下更好地生长。

为了确定从用CAT和mCAT表达构建体转化的DH5α细胞合成的氯霉素乙酰转移酶的相对量，在IPTG诱导后5、30、60和90分钟时对细胞提取物进行蛋白质印迹分析。离心每个时间点的50μl培养物，并将细菌颗粒再悬浮于30μl的TE缓冲液和10μl的4×SDS凝胶上样缓冲液中。样品在95℃下加热3分钟，并上样于10％Bis-Tris/SDS聚酰胺凝胶上。蛋白质转移到PVDF膜上并用抗CAT抗体探测。图2是在IPTG诱导后各个时间点，从用CAT(C)和mCAT(mCAT)表达构建体转化的DH5α细胞获得的溶菌物的蛋白质印迹分析。结果显示，在测试的所有时间点，在用mCAT表达构建体(mC)转化的DH5α细胞中，氯霉素乙酰转移酶蛋白(19kDa标志物之上)的量有明显增加。

在哺乳动物细胞中进行氯霉素乙酰转移酶ORF的分析。将CAT ORF和经部分修饰的CAT ORF克隆到含有CMV启动子的哺乳动物表达构建体中，并通过瞬时转染到中国仓鼠卵巢(DG44)细胞中来进行测试。简言之，使用Fugene 6(Roche)转染试剂，根据制造商的说明书，将0.5μg每种表达构建体和20ng表达β-半乳糖苷酶报告蛋白的共转染对照质粒(pCMVβ，Clontech)转染到100,000个DG44细胞中。在转染后24小时，使用250μl裂解缓冲液裂解细胞。执行Lac Z报告基因分析以确保样品之间的转染效率相等。将30μl溶菌物加入10μl的4×SDS凝胶上样缓冲液中。样品在72℃下加热10分钟，并上样于10％Bis-Tris/SDS聚酰胺凝胶上。蛋白质转移到PVDF膜上并用抗α-CAT抗体探测。

图3显示用野生型CAT和经修饰的CAT表达构建体转化的DG44细胞的提取物的蛋白质印迹分析。细胞提取物于1×MOPS/SDS中在10％Bis-Tris凝胶上分级分离，转移到PVDF膜上并用抗CAT抗体探测。使用从细胞获得的提取物一式三份地进行实验，其中转染效率相同。

对使用野生型CAT的3个转染和使用经修饰CAT的3个转染进行比较。CAT蛋白(19kDa标志物之上)的量在用经修饰构建体转染的细胞中有明显增加。结果显示，CAT蛋白(19kDa标志物之上)的量在用mCAT构建体转染的DG44细胞中有明显增加。通过消除所得mRNA转录物内的多个翻译起始位点而对CAT ORF的修饰证明，这种技术可在除哺乳动物和细菌细胞以外的多种生物体中具有实际应用。

分泌蛋白质

这种技术的有用性也用分泌蛋白质来研究。针对在智人CD5分子(CD5)mRNA内编码的信号肽产生哺乳动物表达构建体。产生哺乳动物表达构建体，其中转录由CMV启动子驱动，且其中cd5信号肽位于编码针对甲状腺球蛋白的抗体的轻链的ORF的5′端(cd5-1，SEQ ID NO：123)。CD5信号肽序列含有7个潜在起始密码子，包括3个ATG、1个TTG和3个CTG密码子。产生一系列表达构建体。在一种变体中，cd5信号肽中的ATG密码子改变为ATC密码子，导致甲硫氨酸被异亮氨酸取代(cd5-2，SEQ ID NO：124)。在另一种变体中，cd5信号肽中的CTG密码子改变为CTC(cd5-3，SEQ ID NO：125)。在另一种变体中，ATG密码子突变成ATC密码子，导致甲硫氨酸(M)到异亮氨酸(I)的氨基酸取代，且CTG密码子改变为CTC(cd5-4，SEQ ID NO：126)。在另一种变体中，ATG密码子改变为ATC密码子，导致氨基酸甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，CTG密码子改变为CTC密码子，且起始物AUG的背景通过将其3′端的密码子由CCC改变为GCT从而导致氨基酸脯氨酸(P)被精氨酸(R)取代而得到改善(cd5-5，SEQ ID NO：127)。

这些构建体然后通过瞬时转染到中国仓鼠卵巢(DG44)细胞中来测试。简言之，使用Fugene 6(Roche)转染试剂，根据制造商的说明书，将0.5μg每种表达构建体和20ng表达β-半乳糖苷酶报告蛋白的共转染对照质粒(pCMVβ，Clontech)转染到100,000个DG44细胞中。在转染后24小时，使用250μl裂解缓冲液裂解细胞。执行Lac Z报告基因分析以确保样品之间的转染效率相等。将30μl上清液加入10μl的4×SDS凝胶上样缓冲液中。样品在72℃下加热10分钟，并上样于10％Bis-Tris/SDS聚酰胺凝胶上。蛋白质转移到PVDF膜上并用α-κ轻链抗体探测。

图4显示用野生型(cd5-1)和经修饰的cd5信号肽α-甲状腺球蛋白轻链表达构建体(cd5-2至cd5-5)转化的DG44细胞的上清液的蛋白质印迹分析。细胞提取物于1×MOPS/SDS中在10％Bis-Tris凝胶上分级分离，转移到PVDF膜上并用α-κ轻链抗体探测。使用细胞上清液进行实验，其中转染效率相同。结果显示，在信号肽中缺少CTG密码子的表达构建体(cd5-3)的情况下，细胞上清液中分泌抗体轻链产物(28kDa之上)的含量有明显增加。在信号肽中缺乏CTG、ATG密码子且在真正起始密码子周围具有改善的核苷酸背景的表达构建体(完全拯救)在上清液中也具有明显增加的蛋白质产物含量。

含有轻链信号肽1的Thy-1可变轻链ORF(SEQ ID NO：128)含有104个潜在起始密码子，包括8个ATG(包括真正起始密码子)、15个ATC、6个ACG、14个GTG、4个TTG、26个CTG、16个AGG、10个AAG、3个ATA和2个ATT密码子。在信号肽中进行修饰，其中去除AUG和CUG密码子(SEQ ID NO：129)。含有轻链信号肽2的Thy-1可变轻链ORF(SEQ ID NO：130)含有104个潜在起始密码子，包括7个ATG(包括真正起始密码子)、16个ATC、6个ACG、13个GTG、4个TTG、27个CTG、15个AGG、10个AAG、4个ATA和2个ATT密码子。含有重链信号肽1的Thy-1可变重链ORF含有225个潜在起始密码子，包括18个ATG(包括真正起始密码子)、14个ATC、18个ACG、42个GTG、7个TTG、43个CTG、43个AGG、33个AAG、5个ATA和2个ATT密码子(SEQ ID NO：131)。通过去除AUG和CUG密码子(SEQ ID NO：132)而在信号肽中进行修饰。含有重链信号肽2的Thy-1可变重链ORF含有227个潜在起始密码子，包括18个ATG(包括真正起始密码子)、14个ATC、18个ACG、43个GTG、9个TTG、41个CTG、43个AGG、33个AAG、5个ATA和3个ATT密码子(SEQ ID NO：133)。

其中信号肽被CD5信号肽置换的Thy-1可变轻链ORF(SEQ ID NO：137)含有104个潜在起始密码子，包括8个ATG(包括真正起始密码子)、15个ATC、6个ACG、13个GTG、5个TTG、27个CTG、14个AGG、10个AAG、3个ATA和2个ATT密码子。进行其中ATG密码子改变为ATC密码子的修饰，导致氨基酸甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代(SEQ ID NO：138)。也进行其中CTG密码子改变为CTC密码子的修饰(SEQ ID NO：139)。进行另一种修饰，ATG密码子突变成ATC密码子，导致氨基酸甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，且CTG密码子改变为CTC密码子(SEQ ID NO：140)。进行另一种修饰，其中ATG密码子改变为ATC密码子，导致氨基酸甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，CTG密码子改变为CTC密码子，且起始物AUG的背景通过将其3′端的密码子由CCC改变为GCT从而导致氨基酸脯氨酸(P)被精氨酸(R)取代而得到改善(SEQID NO：141)。

来自其它生物体的信号肽同样也被突变(参看表1)。分析在酵母和哺乳动物细胞中起作用的信号肽的DNA序列，并使其突变以产生突变版本(SEQ ID NO：145-156)。应理解，在从蛋白质切割下来的信号肽中，同框ATG密码子可被例如突变成ATT或ATC，以编码异亮氨酸，它是另一种疏水氨基酸。可产生DNA构建体，其含有与人单克隆抗体的轻链同框融合的这些信号序列。在不同生物体(例如毕赤酵母(Pichia pastoris)和哺乳动物细胞系)中表达时，可使用蛋白凝胶和Western分析来检查人轻链抗体的表达水平。

表1：在酵母和哺乳动物细胞中起作用的信号肽的DNA序列

HcRed 1

HcRed1编码远红色荧光蛋白，其激发和发射分别在558nm和618nm+/-4nm下达到最大值。HcRed1是通过珊瑚礁紫点海葵(Heteractis crispa)的非荧光色蛋白的诱变来产生。随后对HcRed1编码序列进行人密码子优化以便在哺乳动物细胞中获得更高的表达。所述ORF含有99个潜在起始密码子，包括9个ATG(包括真正起始密码子)、8个ATC、12个ACG、16个GTG、21个CTG、18个AGG和15个AAG密码子(SEQ ID NO：134)。产生了HcRed1 ORF的完全和部分修饰体(分别是SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136)。

红细胞生成素(EPO)

人红细胞生成素(EPO)是一种有价值的治疗剂。使用本文所述的方法，对编码人EPO(下文提供，且作为GenBank登记号NM_000799获得)的mRNA序列进行优化，以消除此mRNA转录物内的多个翻译起始位点。

示例性人红细胞生成素(EPO)蛋白由以下mRNA转录物编码，其中编码成熟肽的序列加下划线，所有三个阅读框内的所有潜在翻译起始位点为粗体，对应于甲硫氨酸的规范起始密码子为大写，且尿嘧啶(u)取代胸腺嘧啶(t)(SEQ ID NO：111)。

1 cccggagccggaccggggccaccgcgcccgctctgctccgacaccgcgccccctggacag

61 ccgccctctcctccaggcccgtggggctggccctgcaccgccgagcttcccgggATGagg

121 gcccccggtgtggtcacccggcgcgccccaggtcgctgagggaccccggccaggcgcgga

181 gATGggggtgcacgaATGtcctgcctggctgtggcttctcctgtccctgctgtcgctccc

241 tctgggcctcccagtcctgggcgccccaccacgcctcatctgtgacagccgagtcctgga

301 gaggtacctcttggaggccaaggaggccgagaatatcacgacgggctgtgctgaacactg

361 cagcttgaATGagaatatcactgtcccagacaccaaagttaatttctATGcctggaagag

421 gATGgaggtcgggcagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtcggaagc

481 tgtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcccctgcagct

541 gcATGtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcaccactctgcttcgggctctggg

601 agcccagaaggaagccatctcccctccagATGcggcctcagctgctccactccgaacaat

661 cactgctgacactttccgcaaactcttccgagtctactccaatttcctccggggaaagct

721 gaagctgtacacaggggaggcctgcaggacaggggacagATGaccaggtgtgtccacctg

781 ggcatatccaccacctccctcaccaacattgcttgtgccacaccctcccccgccactcct

841 gaaccccgtcgaggggctctcagctcagcgccagcctgtcccATGgacactccagtgcca

901 gcaATGacatctcaggggccagaggaactgtccagagagcaactctgagatctaaggATG

961 tcacagggccaacttgagggcccagagcaggaagcattcagagagcagctttaaactcag

1021 ggacagagccATGctgggaagacgcctgagctcactcggcaccctgcaaaatttgATGcc

1081 aggacacgctttggaggcgatttacctgttttcgcacctaccatcagggacaggATGacc

1141 tggagaacttaggtggcaagctgtgacttctccaggtctcacgggcATGggcactccctt

1201 ggtggcaagagcccccttgacaccggggtggtgggaaccATGaagacaggATGggggctg

1261 gcctctggctctcATGgggtccaagttttgtgtattcttcaacctcattgacaagaactg

1321 aaaccaccaaaaaaaaaaaa

为了保护获得的氨基酸序列，在任何可能的地方进行沉默或保守取代。在分别仅由一种密码子(aug/atg)和(ugg/tgg)编码的甲硫氨酸和色氨酸的情况下，取代用编码具有类似物理性质的氨基酸的序列替换编码甲硫氨酸或色氨酸的序列。当进行保守氨基酸取代时，被认为重要的物理性质包括(但不限于)侧链几何结构、大小和分支；疏水性；极性；酸度；芳香族对脂肪族结构；和范德华体积。举例来说，氨基酸亮氨酸或异亮氨酸可取代甲硫氨酸，因为这些氨基酸类似地都是疏水的，非极性且占据相等的范德华体积。因此，亮氨酸或异亮氨酸取代甲硫氨酸不会影响蛋白质折叠。亮氨酸是用于甲硫氨酸取代的优选氨基酸。或者，氨基酸酪氨酸或苯丙氨酸可取代色氨酸，因为这些氨基酸类似地都是芳香族且占据相等的范德华体积。

以下序列是编码人红细胞生成素(EPO)的经修饰mRNA转录物的一个实例，其中编码区内已被证实的起始物甲硫氨酸(由核苷酸182-184编码)上游的所有潜在翻译起始位点和已被证实的起始物甲硫氨酸下游的那些潜在翻译起始位点发生突变(突变以斜体字显示)(SEQ ID NO：113)。

1 cccggagccggaccggggccaccgcgcccgctctactccgacaccgcgccccctagacag

61 ccgccctctcctccaggcccgtagggctagccctacaccgccgagcttcccgggTTAagg

121 gcccccggtctagtcacccggcgcgccccaggtcgctaagggaccccggccaggcgcgga

181 gATGggggtacacaaTTAtcctacctagctctagcttctcctatccctactatcgctccc

241 tctaggcctcccagtcctaggcgccccaccacacctcctctttaacagccgagtcctaga

301 gaggtacctcttagaggccaaggaggccgagaatatcacgacgggctgtgctgaacactg

361 cagcttgaTTAagattttaactatcccagacaccaaagttattatctTTAcctagaagag

421 gTTAgaggtcgggcagcaggccgtagaagtctagcagggcctagccctactatcggaagc

481 tgtcctacggggccaggccctattagtcaactcttcccagccgtaggagcccctacagct

541 gcCTCtagttaaagccgtcagtagccttcgcagcctcaccactctacttcgggctctagg

601 agcccagaaggaagccctctcccctccagTTAcggcctcagctactccactccgaacaat

661 cactactaacactttccgcaaactcttccgagtctactccaatatcctccggggaaagct

721 gaagctatacacaggggaggcctacaggacaggggacagTTAaccagttttatccaccta

781 ggcttttacaccacctccctcaccaacttaccttttaccacaccctcccccgccactcct

841 gaaccccgtcgaggggctctcagctcagcgccagcctatcccTTAgacactccagtacca

901 gcaTTAacttatcaggggccagaggaactatccagagagcaactctaagttataaggTTA

961 tcacagggccaacttaagggcccagagcaggaagcttacagagagcagctttaaactcag

1021 ggacagagccTTActaggaagacacctaagctcactcggcaccctacaaattttaTTAcc

1081 aggacacactttagaggcgttatacctattttcgcacctaccttaagggacaggTTAacc

1141 tggagaacttaggtagcaagctctcacttctccaggtctcacaggcTTAggcactccctt

1201 ggtagcaagagcccccttaacaccggggtagtaggaaccTTAaagacaggTTAggggcta

1261 gcctctagctctcTTAgggtccaagttctttatttacttcaacctcttacacaagaacta

1321 aaaccaccaaaaaaaaaaaa

红细胞生成素的未经修饰的开放阅读框含有88个潜在起始密码子(8个ATG(包括真正起始密码子)、5个ATC、4个ACG、7个GTG、3个TTG、32个CTG、14个AGG、10个AAG、3个ATA和2个ATT密码子)(SEQ ID NO：112)。进行的修饰包括：通过去除大部分潜在起始密码子来修饰信号肽(SEQ ID NO：116)；去除信号肽的ATG和CTG(SEQ ID NO：211)；去除ATG、CTG和ACG密码子，导致氨基酸谷氨酸(E)被谷氨酰胺(Q)取代(SEQ ID NO：118)或氨基酸组氨酸(H)被精氨酸(R)取代(SEQ ID NO：119)。

实施例2：修饰mRNA转录物内的miRNA结合位点

与靶mRNA转录物结合的微RNA(miRNA)通过诱导靶mRNA转录物降解或通过阻止靶mRNA转录物翻译来降低翻译效率。为了提高编码有商业价值的人蛋白质的mRNA转录物的翻译效率，首先鉴别靶mRNA的5′前导序列、5′非翻译区(UTR)序列、编码序列和3′非翻译区(UTR)序列内的所有已知的或预测的miRNA结合位点，然后使其突变或改变以便抑制miRNA结合。

在所述方法的一优选方面中，包含成熟miRNA序列的前8个5′-核苷酸的种子序列被特异性地靶向。种子序列包含成熟miRNA序列的5′核苷酸1-7或2-8。因此，用于此方法中的种子序列涵盖两种替代物。miRNA种子序列在功能上很重要，因为它是miRNA中根据沃森-克里克碱基配对原则(Watson-Crickbase-pairing rule)发生结合的唯一部分。如果在miRNA的种子序列区域内没有绝对结合互补性，那么miRNA与其靶mRNA的结合不会发生。然而，与大多数核苷酸配对不同，miRNA的种子序列能够和靶mRNA配对，使得鸟嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸配对，这称为G:U摆动。

举例来说，人红细胞生成素(EPO)是有价值的治疗剂，但其难以足量制造。使用本方法，对编码所述蛋白质(GenBank登记号NM_000799)的mRNA序列的序列进行优化以抑制miRNA下调作用。PicTar网站界面(公众可在pictar.mdc_berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi获得)预测了人miRNAhsa-miR-328和hsa-miR-122a是以编码人EPO的mRNA为靶标(这些miRNA的成熟和种子序列在以下表2中提供)。因此，在例如具有种子序列uggagugu的hsa-miR-122a的情况下，一个或多个核苷酸被突变，使得hsa-miR-122a不再结合，且另一种已知miRNA的种子序列未产生出来。可能防止结合的一种可能的被突变hsa-miR-122a种子序列是“uagagugu”。这种被突变种子序列不可能属于另一种已知miRNA，因为这种序列在例如以下表2中没有被表示出来。

类似地，PicTar网站界面预测了人miRNA hsa-miR-149、hsa-let7f、hsa-let7c、hsa-let7b、hsa-let7g、hsa-let7a、hsa-miR-98、hsa-let7i、hsa-let7e和hsa-miR-26b是以编码人干扰素β2(也称为IL-6，Genbank登记号NM_000600)的mRNA为靶标(这些miRNA的成熟和种子序列在以下表2中提供)。

miRNA结合位点也可通过将小于1000个碱基对的任何序列输入桑格研究院(Sanger Institute)的miRNA：序列数据库(公众可在microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtml获得)来鉴别。

表2：已知的人miRNA、成熟序列和种子序列

miR-183结合序列(SEQ ID NO：59)发生突变(SEQ ID NO：142)，并嵌入报告基因的编码序列中，例如在还含有FLAG标签的CAT基因(SEQ ID NO：143)中。这允许使用抗FLAG标签抗体，通过蛋白质印迹分析来评估细胞中的表达，其中在miR-183结合序列中进行突变(SEQ ID NO：144)。