CN117467589A - 一种高效生产3-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效生产3‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。通过在大肠杆菌的motA位点、fliR位点以及aptI位点整合α1,3‑岩藻糖基转移酶，敲除ptsG、lacZ以及编码转录阻遏物的基因lacI，用Ptac替换lacY的天然启动子，在flgG位点增加一个拷贝的lacY；敲除wcaJ、pfkA、nudD、lon，强化表达rcsA；在外源α1,3‑岩藻糖基转移酶其N端添加促溶标签SUMO并整合进基因组，最后通过在途径酶manB，manC上添加互作短肽RIAD，再转入带有互作短肽RIDD无序蛋白FUSN或RGG表达质粒获得了可高效生产3‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其胞外3‑FL的积累量最高达到13g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效生产3-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
人乳低聚糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是母乳中特有的复合碳水化合物，作为母乳中第三大固体成分，对新生儿的生长发育具有非常重要的作用。根据组成HMOs的单糖结构单元，HMOs可分为中性岩藻糖基乳糖，酸性唾液酸乳糖和中性非岩藻糖基化乳糖三种。其中，中性岩藻糖基乳糖约占50％，而3-岩藻糖基乳糖(3-Fucosyllactose，3-FL)作为其中重要的组分之一，在医药、食品、奶粉等行业应用前景广阔，具有抗菌活性，能有效保护肠道上皮细胞，增强肠道屏障功能，同时能参与免疫调节，以及促进婴幼儿大脑发育，改善学习能力的功能。目前，3-FL已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为安全的食品添加剂，可作为新型婴幼儿配方食品中的营养添加剂。
目前，3-FL的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和生物合成法。在化学合成法中，需要使用一些有毒的化学试剂，步骤繁琐，不仅使得后续纯化成本达，且会对环境造成一定的污染。而相较绿色环保的酶法合成，3-FL的催化合成需要昂贵的GDP-L-岩藻糖作为前体，生产成本较高。生物合成法是利用廉价的底物，在细胞内代谢合成GDP-L-岩藻糖，并在α-1,3-岩藻糖基转移酶的作用下合成3-FL。因此，生物合成法具有更好的工业应用前景，受到越来越多研究者的青睐。例如，研究者利用甘油作为底物，通过表达合成3-FL的途径酶，可以实现在大肠杆菌(Echerichia coli)中合成3-FL，但是目前微生物发酵生产3-FL产量仍然不太理想，限制了其在工业生产的广泛应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过代谢流的基础改造，再将无序蛋白与途径中的关键酶联系起来，提高微生物发酵生产3-FL的产量。
本发明的第一个目的是提供一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包括以下改造：敲除了葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因ptsG、β-半乳糖苷水解酶基因lacZ、转录阻遏物基因lacI、6-磷酸果糖激酶1基因pfkA、十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ、蛋白Lon基因lon、GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶基因nudD，过表达了α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2和乳糖渗透酶基因lacY，且至少有一个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2上融合有SUMO标签，强化表达DNA结合转录激活蛋白基因rcsA，并表达了分别融合第一互作短肽的磷酸甘露糖变位酶基因manB和α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，以及融合第二互作短肽的无序蛋白FUSN或RGG；
所述第一互作短肽和第二互作短肽可特异性结合。
进一步地，在基因组上整合α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2、乳糖渗透酶基因lacY，采用质粒表达融合第一互作短肽的磷酸甘露糖变位酶基因manB和α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，以及融合第二互作短肽的无序蛋白FUSN或RGG。
进一步地，过表达α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2为，在基因组上整合至少四个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2。
进一步地，分别在运动蛋白基因motA位点、鞭毛驱动蛋白基因fliR位点以及三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因aptI位点替换入α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2，并在thrW位点整合含有SUMO标签的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2。
进一步地，过表达乳糖渗透酶基因lacY为，在基因组上整合至少一个拷贝的乳糖渗透酶基因lacY，和/或采用组成型强启动子替换乳糖渗透酶基因lacY的原启动子。
进一步地，强化表达DNA结合转录激活蛋白基因rcsA为，采用组成型强启动子替换DNA结合转录激活蛋白基因rcsA的原启动子。
进一步地，本发明中组成型强启动子包括但不限于Ptac启动子。
进一步地，第一互作短肽和第二互作短肽包括但不限于：短肽RIAD和短肽RIDD、短肽CC-Di-A和短肽CC-Di-B。
进一步地，当第一互作短肽为短肽RIAD时，第二互作短肽为短肽RIDD；当第一互作短肽为短肽RIDD时，第二互作短肽为短肽RIAD。
进一步地，当第一互作短肽为短肽CC-Di-A时，第二互作短肽为短肽CC-Di-B；当第一互作短肽为短肽CC-Di-B时，第二互作短肽为短肽CC-Di-A。
进一步地，α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2与SUMO标签通过柔性连接肽连接，序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步地，葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因ptsG的Gene ID:945651，β-半乳糖苷水解酶基因lacZ的Gene ID:945006，转录阻遏物基因lacI的GeneID:945007，6-磷酸果糖激酶1基因pfkA的Gene ID:948412，十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ的Gene ID:946583，蛋白Lon基因lon的Gene ID:945085，GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶基因nudD的GeneID:946559。
进一步地，α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，乳糖渗透酶基因lacY的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，DNA结合转录激活蛋白基因rcsA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步地，磷酸甘露糖变位酶基因manB的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manC的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
进一步地，无序蛋白FUSN的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，无序蛋白RGG的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
进一步地，短肽RIAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，短肽RIDD的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
进一步地，短肽CC-Di-A的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，短肽CC-Di-B的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
进一步地，以大肠杆菌K12 MG1655为宿主菌。
进一步地，上述重组大肠杆菌的构建方法包括以下步骤：
S1、构建包含运动蛋白基因motA位点的上下游同源臂、Ptac启动子和α1,3-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入带有pCas9质粒的大肠杆菌K12 MG1655感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655△motA::futM2；所述的pTarget质粒包含运动蛋白基因motA的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S2、构建包含鞭毛驱动蛋白基因fliR位点的上下游同源臂、Ptac启动子和α1，3-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655△motA::futM2△fliR::futM2；所述的pTarget质粒包含鞭毛驱动蛋白基因fliR的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S3、构建包含编码三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因aptI位点，Ptac启动子和α1,3-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2△fliR::futM2感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2；所述的pTarget质粒包含编码三磷酸腺苷合成酶辅助因子aptI基因的N20序列的sgRNA，所述的pTarget质粒用于表达Cas9蛋白；
S4、构建包含由葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因ptsG位点的上下游同源臂组成的敲除片，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2感受态中，构建重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2△ptsG；所述的pTarget质粒包含葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S5、构建包含由β-半乳糖苷水解酶基因lacZ和转录阻遏物基因lacI位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2△ptsG感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655△motA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI；所述的pTarget质粒包含β-半乳糖苷水解酶lacZ基因和转录阻遏物lacI基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S6、构建包含启动子Ptac以及乳糖渗透酶lacY基因上下游同源臂组成的整合片段，与包含pcrEG质粒共同转入到带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI感受态中，构建重组大肠杆菌K12 MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacY；所述的pcrEG质粒包含乳糖渗透酶lacY基因天然启动子N23序列的crRNA，所述的pCpf1质粒用于表达Cpf1蛋白；
S7、构建包含由十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacY感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJ；所述的pTarget质粒包含十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S8、构建包含6-磷酸果糖激酶1pfkA基因位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJ感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkA；所述的pTarget质粒包含6-磷酸果糖激酶1基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S9、构建包含GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶nudD基因位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJ△pfkA感受态中，构建重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2△ptsG△lacZ△lacI::Ptac-lacY△wcaJ△pfkA△nudD；所述的pTarget质粒包含GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S10、构建包含编码蛋白Lon的基因lon基因位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12
MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZ△lacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudD感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2ΔptsGΔlacZ△lacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlon；所述的pTarget质粒包含编码蛋白Lon基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S11、构建包含thrW位点上下游同源臂、启动子Ptac以及N端含有SUMO标签的α1，3-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlon感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZ△lacI::Ptac-lacY△wcaJ△pfkA△nudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2；所述的pTarget质粒包含thrW位点的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S12、构建包含flgG位点的上下游同源臂、Ptac启动子和乳糖渗透酶lacY基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔΔthrW::SUMO-futM2感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacY△wcaJ△pfkA△nudD△lon△thrW::SUMO-futM2△flgG::lacY；所述的pTarget质粒包含编码鞭毛基体杆蛋白flgG基因N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白；
S13、构建包含启动子Ptac以及编码DNA结合转录激活蛋白rcsA基因上下游同源臂组成的整合片段，与包含pcrEG质粒共同转入到带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY::Ptac-rcsA；所述的pcrEG质粒包含编码DNA结合转录激活蛋白rcsA基因的N23序列的crRNA，所述的pCpf1质粒用于表达Cpf1蛋白；
S14、构建包含互作短肽RIAD以及编码磷酸甘露糖变位酶manB基因上下游同源臂组成的整合片段，与包含pcrEG质粒共同转入到带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJ△pfkA△nudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2△flgG::lacY::Ptac-rcsA感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2△flgG::lacY::Ptac-rcsA::RIAD-manB；所述的pcrEG质粒包含编码DNA结合转录激活蛋白manB基因的N23序列的crRNA，所述的pCpf1质粒用于表达Cpf1蛋白；
S15、构建包含互作短肽RIAD以及编码α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶ma nC基因上下游同源臂组成的整合片段，与包含pcrEG质粒共同转入到带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2△ptsG△lacZ△lacI::Ptac-lacY△wcaJ△pfkA△nudDΔlon△flgG::lacY△thrW::SUMO-futM2::Ptac-rcsA::RIAD-manB感受态中，构建重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2△ptsGΔlacZ△lacI::Ptac-lacY△wcaJΔpfkA△nudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2△flgG::lacY::Ptac-rcsA::RIAD-manB::RIAD-manC；所述的pcrEG质粒包含编码DNA结合转录激活蛋白manC基因的N23序列的crRNA，所述的pCpf1质粒用于表达Cpf1蛋白；
S16、构建包含互作短肽RIDD以及编码无序蛋白RGG的表达质粒pAC YC-RIDD-RGG，将pACYC-RIDD-RGG质粒转入到重组大肠杆菌K12 MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△atpI::futM2△ptsGΔlacZ△lacI::Ptac-lacY△wcaJΔpfkA△nudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2△flgG::lacY::Ptac-rcsA::RIAD-manB::RIAD-manC感受态中，获得重组大肠杆菌E31；
S17、构建包含互作短肽RIDD以及编码无序蛋白FUSN的表达质粒pACYC-RIDD-FUSN，将pACYC-RIDD-FUSN质粒转入到重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkA△nudDΔlon△thrW::SUMO-futM2△flgG::lacY::Ptac-rcsA::RIAD-manB::RIAD-manC感受态中，获得重组大肠杆菌E32。
本发明的第二个目的是提供一种生产3-岩藻糖基乳糖的方法，采用上述重组大肠杆菌进行发酵生产。
进一步地，所述的方法包括如下步骤：
S1、将重组大肠杆菌菌落接种在种子培养基中培养10-12h，制备成种子液；
S2、将种子液接种至发酵培养基中，并添加葡萄糖30-40g/L、乳糖15-20g/L，于30～35℃、210～220r/min下发酵，分离发酵液得到3-岩藻糖基乳糖。
进一步地，所述的种子培养基包括胰蛋白胨9-12g/L、酵母粉4-7g/L，NaCl 9-12g/L。
进一步地，所述的发酵培养基包括胰蛋白胨12-15g/L、酵母粉22-30g/L、磷酸二氢钾2.2-2.5g/L、磷酸氢二钾11-13g/L。
本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在制备食品添加剂中的应用。
进一步地，所述食品包括但不限于婴幼儿食品(如配方奶粉)。
本发明的有益效果：
本发明通过在大肠杆菌K12 MG1655中的motA，fliR，aptI位点敲入了外源α1，3-岩藻糖基转移酶，敲除编码葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分ptsG基因，使得葡萄糖乳糖共利用；编辑乳糖操纵子，敲除编码β-半乳糖苷水解酶的基因lacZ以及编码转录阻遏物的基因lacI，使得乳糖进入胞内不被水解，用Ptac替换编码乳糖渗透酶lacY的天然启动子，且在编码鞭毛基体杆蛋白flgG位点增加一个拷贝的lacY，加速乳糖乳糖的吸收；敲除编码支路代谢流克拉酸合成的十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ，编码6-磷酸果糖激酶1pfkA基因以及编码GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶nudD基因，阻断支路代谢流，敲除基因lon，强化表达rcsA，增强前体GDP-L岩藻糖的积累；在外源α1,3-岩藻糖基转移酶其N端添加促溶标签SUMO，从而优化了外源α1，3-岩藻糖基转移酶的表达，并在thrW位点整合了含有SUMO标签的α1，3-岩藻糖激酶，并通过在途径酶manB，manC的N端添加互作短肽RIAD，再转入带有互作短肽RIDD无序蛋白FUSN或RGG表达质粒获得了可高效生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其胞外3-FL的积累量达到13g/L。
附图说明
图1是本发明3-岩藻糖基乳糖代谢合成通路示意图；
图2是本发明3-岩藻糖基乳糖的液质检测图；
图3是本发明E01～E03摇瓶发酵重组大肠杆菌合成3-岩藻糖基乳糖的结果图；
图4是本发明E04～E10摇瓶发酵重组大肠杆菌合成3-岩藻糖基乳糖的结果图；
图5是本发明E11～E13、E31～E32摇瓶发酵重组大肠杆菌合成3-岩藻糖基乳糖及培养基中剩余乳糖含量的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例涉及的检测方法：
为检测本发明所述的无质粒重组大肠杆菌合成的3-FL，实施例1中采用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)定性检测重组大肠杆菌发酵液中3-FL的合成，通过质谱扫描质荷比m/z为487的离子碎片来确定发酵液中3-FL的合成。
采用高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent Technologies 1260系列)定量检测重组大肠杆菌发酵液中3-FL的合成，通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)测定发酵液中3-FL和底物乳糖的浓度。HPLC检测器为示差检测器,色谱柱的检测温度设置为55℃,流动相为5mmol/L的稀H2SO4,流速为0.6mL/min。
本发明涉及的方案如下：
本发明提供一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，在大肠杆菌的鞭毛驱动蛋运动蛋白基因motA位点，鞭毛驱动蛋白基因fliR位点以及编码三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因aptI位点整合α1,3-岩藻糖基转移酶，并敲除编码葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分ptsG基因，编码β-半乳糖苷水解酶的基因lacZ以及编码转录阻遏物的基因lacI，并用Ptac替换编码乳糖渗透酶lacY的天然启动子，在编码鞭毛基体杆蛋白flgG位点增加一个拷贝的lacY；敲除编码支路代谢流克拉酸合成的十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ，编码6-磷酸果糖激酶1pfkA基因以及编码GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶nudD基因，阻断支路代谢流，敲除蛋白Lon的基因lon，强化表达rcsA；在外源α1,3-岩藻糖基转移酶其N端添加促溶标签SUMO，从而优化了外源α1，3-岩藻糖基转移酶的表达，在thrW位点整合了含有SUMO标签的α1，3-岩藻糖激酶，并通过在途径酶manB，manC的N端添加互作短肽RIAD，再转入带有互作短肽RIDD无序蛋白FUSN或RGG表达质粒获得了可高效生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其胞外3-FL的积累量最高达到13g/L。
实施例1：整合外源α1,3-岩藻糖基转移酶
(1)制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态
首先将pCas9质粒转化至大肠杆菌K12 MG1655中，涂布于50μg/mL的卡那霉素平板上，37℃培养过夜后挑取平板上的单菌落，接种于LB液体培养基，加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素抗生素，放在摇床上，37℃，220r/min培养12h；将培养的菌液按2％的接种量转接至含有25mL LB培养基的250mL摇瓶中，并添加终浓度为25mmol/L的阿拉伯糖诱导pCas9质粒表达重组酶；继续培养至OD600为0.7时，将菌液冰浴40min后，于5000r/min离心收集菌体细胞；用预冷的灭菌水洗涤细胞1次,倒掉上清液，用预冷的10％甘油悬浮菌体再洗涤细胞1次，再用500μL预冷的10％甘油悬浮菌体，50μL一管分装到EP管，制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态备用。
(2)制备用于基因敲入的整合片段
由苏州金唯智生物科技有限公司合成α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，利用融合PCR技术获得由运动蛋白基因motA位点，鞭毛驱动蛋白基因fliR位点，三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因aptI位点的上下游同源臂、Ptac启动子和α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2组成的整合片段MotA-Ptac-futM2，FliR-Ptac-futM2和AptI-Ptac-futM2(核苷酸序列如SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4所示)，然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计motA，fliR，aptI基因的N20序列，从而构建包含motA，fliR，aptI基因的sgRNA的pTarget-motA，pTarget-fliR，pTarget-aptI质粒。
(3)整合片段与pTarget质粒的共转化
将上述获得的整合片段MotA-Ptac-futM2与pTarget-motA，FliR-Ptac-futM2与pTarget-fliR，AptI-Ptac-futM2与pTarget-aptI质粒依次共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态中，加入1mL的LB培养基，在37℃、220r/min条件下培养2.5h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，37℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认外源α1,3-岩藻糖基转移酶基因成功整合至大肠杆菌基因组运动蛋白基因motA位点，鞭毛驱动蛋白基因fliR位点，三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因aptI位点，得到无质粒的重组大肠杆菌E01 MG1655ΔmotA::futM2，E02△motA::futM2ΔfliR::futM2，E03MG1655△motA::futM2△fliR::futM2△aptI::futM2。
实施例2
基因敲除葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因ptsG，半乳糖苷水解酶lacZ，抑制乳糖通透酶的转录阻遏物基因lacI，6-磷酸果糖激酶1pfkA,十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ，编码蛋白Lon的基因lon，GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶nudD；用Ptac替换编码乳糖渗透酶lacY(SEQ ID NO.7)的天然启动子，并整合至基因组：
制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655△motA::futM2△fliR::futM2ΔaptI::futM2的感受态。
利用融合PCR技术获得由pstG、lacZ、lacI、wcaJ、pfkA、nudD、lon位点上下游同源臂组成的敲除片段(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.9-SEQ IDNO.12所示)，与pTarget-pstG、pTarget-lacZ、pTarget-lacI、pTarget-wcaJ、pTarget-pfkA、pTarget-lon、pTarget-nudD质粒分别与各自片段共同转化到带有Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，加入1mL的LB培养基，在37℃、220r/min条件下培养2.5h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，37℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认这些基因成功敲除，得到无质粒的重组大肠杆菌E04 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsG，E05 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI，E06 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacY，E07 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJ，E08 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkA，E09K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudD，E10 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlon。
其中，得到重组大肠杆菌E05 K12 MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI后，构建包含启动子Ptac以及乳糖渗透酶lacY基因上下游同源臂组成的整合片段(SEQ ID NO.8)，与包含pcrEG质粒共同转入到带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12 MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI感受态中，构建重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacY。
实施例3:整合N端带有SUMO标签的外源α1,3-岩藻糖基转移酶制备带有pCas9质粒的大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlon的感受态。
利用融合PCR技术获得由thrW位点上下游同源臂、启动子Ptac以及N端含有SUMO标签的α1，3-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段ThrW-Ptac-SUMO-futM2(SUMO-futM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示),与pTarget-ThrW质粒共同转化到带有Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，加入1mL的LB培养基，在37℃、220r/min条件下培养2.5h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，37℃过夜培养.通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认外源α1,3-岩藻糖基转移酶基因成功整合至大肠杆菌基因组thrW位点，获得重组大肠杆菌E11 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2。
实施例4：通过增加乳糖渗透酶lacY的拷贝数增强乳糖的转运
制备带有pCas9质粒的大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2的感受态。
通过融合PCR技术获得由flgG位点的上下游同源臂、Ptac启动子和乳糖渗透酶lacY基因组成的整合片段FlgG-Ptac-LacY(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2感受态中，加入1mL的LB培养基，在37℃、220r/min条件下培养2.5h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，37℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认乳糖渗透酶基因成功整合至大肠杆菌基因组flgG位点，获得重组大肠杆菌E12 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY。
实施例5：通过强启动子替换天然启动子过表达编码途径酶正调控因子基因rcsA
制备带有pCpf1质粒的大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY的感受态。
通过融合PCR技术获得由启动子Ptac以及编码DNA结合转录激活蛋白rcsA基因上下游同源臂组成的整合片段(rcsA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)，将该整合片段与pcrEG载体连接，构建好的载体转入到带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY感受态中，加入1mL的LB培养基，在37℃、220r/min条件下培养1h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，37℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认Ptac启动子成功替换大肠杆菌基因组上rcsA基因的天然启动子，获得重组大肠杆菌E13 K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::
futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY::Ptac-rcsA。
实施例6：在编码磷酸甘露糖变位酶manB，α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶manC的N端分别添加互作短肽RIAD
制备带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY::Ptac-rcsA的化转感受态。
通过融合PCR技术获得由互作短肽RIAD(SEQ ID NO.19)以及编码磷酸甘露糖变位酶manB基因(SEQ ID NO.15)上下游同源臂组成的整合片段，和由互作短肽RIAD以及编码α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶manC基因(SEQ ID NO.16)上下游同源臂组成的整合片段，将该整合片段与pcrEG载体连接，构建好的载体转入到带有pCpf1质粒的重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY::Ptac-rcsA感受态中，加入1mL的LB培养基，在37℃、220r/min条件下培养1h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，37℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认互作短肽成功替换大肠杆菌基因组上manB和manC基因编码蛋白的N端，获得重组大肠杆菌E21K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY::Ptac-rcsA::RIAD-manB::RIAD-manC。
实施例7：构建带有互作短肽RIDD的无序蛋白FUSN或RGG表达质粒
通过扩增PACYC-Duet1的载体片段和带有RIDD(SEQ ID NO.20)的无序蛋白FUSN(SEQ ID NO.17)和RGG(SEQ ID NO.18)片段，并通过酶连构建，转入大肠杆菌DH5α后，使用试剂盒提取质粒并测序，测序成功后获得pACYC-RIDD-FUSN质粒和pACYC-RIDD-RGG质粒。
制备重组大肠杆菌K12MG1655ΔmotA::futM2ΔfliR::futM2ΔatpI::futM2ΔptsGΔlacZΔlacI::Ptac-lacYΔwcaJΔpfkAΔnudDΔlonΔthrW::SUMO-futM2ΔflgG::lacY::Ptac-rcsA::RIAD-manB::RIAD-manC的化转感受态。
将质粒pACYC-RIDD-FUSN和pACYC-RIDD-RGG分别转入到重组大肠杆菌感受态中，加入1mL的LB培养基，在37℃、220r/min条件下培养1h，涂布含有氯霉素(30μg/mL)的平板中，37℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，获得表达RIDD-FUSN和RIDD-RGG的重组大肠杆菌E31，E32。
实施例8:摇瓶发酵生产3-FL
将上述重组大肠杆菌E31，E32接种于含有氯霉素(30μg/mL)的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养10h。然后将种子液按5％的接种量按入到发酵培养基中，发酵培养基为TB培养基，其配方是：胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸二氢钾2.31g/L、磷酸氢二钾12.54g/L，并添加葡萄糖40g/L、乳糖20g/L，于30℃、220r/min，条件下摇瓶发酵至84h。
发酵结束时，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定菌体胞外的3-FL含量以及发酵液中乳糖的剩余量。首先将2mL发酵液在12200rpm下离心12min后，收集上清液，通过HPLC检测细胞外3-FL和乳糖的浓度。
3-FL产量和培养基中剩余乳糖含量的检测结果如图5所示，最终测定重组大肠杆菌E31，E32中3-FL的胞外3-FL的积累量分别为13g/L，11g/L。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (16)
1.一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包括以下改造：
敲除了葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因ptsG、β-半乳糖苷水解酶基因lacZ、转录阻遏物基因lacI、6-磷酸果糖激酶1基因pfkA、十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ、蛋白Lon基因lon、GDP-甘露糖甘露糖醇水解酶基因nudD，过表达了α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2和乳糖渗透酶基因lacY，且至少有一个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2上融合有SUMO标签，强化表达DNA结合转录激活蛋白基因rcsA，并表达了分别融合第一互作短肽的磷酸甘露糖变位酶基因manB和α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，以及融合第二互作短肽的无序蛋白FUSN或RGG；
所述第一互作短肽和第二互作短肽可特异性结合。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，过表达α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2为，在基因组上整合至少四个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，分别在运动蛋白基因motA位点、鞭毛驱动蛋白基因fliR位点以及三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因aptI位点替换入α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2，并在thrW位点整合含有SUMO标签的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，过表达乳糖渗透酶基因lacY为，在基因组上整合至少一个拷贝的乳糖渗透酶基因lacY，和/或采用组成型强启动子替换乳糖渗透酶基因lacY的原启动子。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，强化表达DNA结合转录激活蛋白基因rcsA为，采用组成型强启动子替换DNA结合转录激活蛋白基因rcsA的原启动子。
6.根据权利要求4或5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述组成型强启动子包括Ptac启动子。
7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，第一互作短肽和第二互作短肽的组合选自短肽RIAD和短肽RIDD、短肽CC-Di-A和短肽CC-Di-B中的任一种。
8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌，其特征在于，
当第一互作短肽为短肽RIAD时，第二互作短肽为短肽RIDD；当第一互作短肽为短肽RIDD时，第二互作短肽为短肽RIAD；
当第一互作短肽为短肽CC-Di-A时，第二互作短肽为短肽CC-Di-B；当第一互作短肽为短肽CC-Di-B时，第二互作短肽为短肽CC-Di-A。
9.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2与SUMO标签通过柔性连接肽连接。
10.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌K12MG1655为宿主菌。
11.一种生产3-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，采用权利要求1-10任一项所述重组大肠杆菌进行发酵生产。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，
S1、将重组大肠杆菌菌落接种在种子培养基中培养，制备成种子液；
S2、将种子液接种至发酵培养基中，并添加葡萄糖30-40g/L、乳糖15-20g/L，于30～35℃、210～220r/min下发酵，分离发酵液得到3-岩藻糖基乳糖。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括胰蛋白胨9-12g/L、酵母粉4-7g/L，NaCl 9-12g/L。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括胰蛋白胨12-15g/L、酵母粉22-30g/L、磷酸二氢钾2.2-2.5g/L、磷酸氢二钾11-13g/L。
15.权利要求1-10任一项所述的重组大肠杆菌在制备食品添加剂中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述食品包括婴幼儿食品。
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