CN105154472B - 哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了哺乳动物细胞高效电转染缓冲液，该缓冲液是对Cytomix缓冲液的进一步改良。该缓冲液中加入的无血清Opti‑MEM培养基、RPMI‑1640培养基及PBS缓冲液能对细胞起营养保护作用，能增加细胞存活率，同时加入的ATP和谷氨酰胺可阻止细胞质成分渗漏，加强细胞膜抗氧化作用，有利于电穿孔的重新闭合。本发明公开的电转染缓冲液，能够明显提高外源基因在目标细胞的电转染效率（高达64.82%），并能提高细胞存活率（高达62.33%）。本发明还提供了该电转染缓冲液的制备方法，该方法操作简单，可操作性强。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种基因输送技术领域的转染介质及其制备方法，具体涉及一种哺乳动物细胞高效电转缓冲液及其制备方法。
背景技术
电穿孔是一种采用机械方法将极性分子通过细胞膜引入宿主细胞的方法，其原理是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子（如DNA等）导入细胞并最终进入胞核的技术。其过程简述如下：在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。瞬时电压使质粒脱离复合物并扩散至胞质内，同时小部分质粒进入核内与染色体整合，细胞膜上的小孔自动重新闭合。
这种方法不仅能够将DNA 、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，转染率高，价格便宜，适用谱广等。尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞，亦能获得较高的转染率。该技术已经成为相当有效的非病毒基因转移技术，并在生物学研究和医疗领域广泛使用。
这种基于电脉冲的高效DNA导入可能与电脉冲导致的细胞膜通透性提高和DNA电泳效果有关，因此转染相关的参数如电脉冲强度和持续时间、电极类型和插入方式、DNA 的浓度、转染缓冲液的成分及浓度等都会影响基因电转染的效果，对这些参数的优化有助于提高基因电转染的效果，减小毒副作用，提高其在基础研究和临床应用中的可行性。
细胞受电击后产生孔洞使细胞质与电转缓冲液直接接触，因此细胞对渗透压和缓冲液离子组成十分敏感。从渗透压来说，低渗缓冲液比等渗或高渗缓冲液更利于获得较高转染率。对于不同的细胞系也可将等渗和低渗的缓冲液按不同的比例混合使用，最佳的混合物是使细胞在达到最大程度肿胀(达到最大细胞直径) 的同时，细胞裂解死亡率又小于10 %。从组成来说，常用的电转缓冲液分3类：第1类为细胞培养液，如RPMI 1640、DMEM、DMEM/ F12、Opti-MEM等；第2类为磷酸缓冲液，如K-PBS，HBS，HeBs，PBS等；第3类为Cytomix缓冲液，Cytomix 配方如下：120 mmol/L KCl，0.15mmol/L CaCl2，10 mmol/L K2 HPO4 (p H= 7.6) ，25 mmol/L HEPES (pH = 7.6)，2 mmol/L EGTA(pH = 7.6)，5 mmol/L MgCl2，2mmol/L ATP，5mmol/L谷胱苷肽。相比之下，Cytomix 的转染率最高，特别是对难以转染的半贴壁细胞和悬浮细胞，而且死亡率较低。Cytomix 缓冲液组成与细胞内离子成份非常相似，有助于细胞保持其通透性，与常用的电转缓冲液PBS和完全培养液相比，Cytomix 缓冲液中Ca2 +、Mg2 +、Na+浓度低，用EGTA代替EDTA，pH值、K+浓度高，该缓冲液最大程度上模拟了真核细胞内离子环境。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种哺乳动物细胞高效电转染缓冲液，该缓冲液是对Cytomix 缓冲液的进一步改良，具有转染率高、细胞存活率高的优点。
本发明的另一目的在于提供上述电转染缓冲液的制备方法。
为了达到本发明的目的，本发明人在已公开的提高转染率方法的基础上，深入研究了电穿孔转染的条件，为寻求既有高DNA摄入量又有高存活率的电转染缓冲液作了大量的探索，发现在Cytomix缓冲液中加入无血清Opti-MEM培养基、RPMI- 1640培养基及PBS缓冲液能对细胞起营养保护作用，能增加细胞存活率。同时加入的ATP和谷氨酰胺可阻止细胞质成分渗漏，加强细胞膜抗氧化作用，有利于电穿孔的重新闭合。本发明公开的电转染缓冲液，能够明显提高外源基因在目标细胞的基因电转染效果并能提高细胞存活率，通过这种作用一方面可以直接提高基因的电转染输送效果，另一方面可以减少外源基因的使用量或使用相对较低的电压达到同样的基因输送效果。
本发明公开的哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于该方法的工艺步骤如下：
（1）称取8.94g KCl、0.01665g CaCl2、1.74 g K2HPO4、0.475g MgCl2，加入无菌水定容至1升，混合得到Cytosalts溶液；
（2）取50-100份步骤（1）得到的Cytosalts溶液，加入10-25份Opti-MEM培养基，得到混合体系A；
（3）取1-5份RPMI-1640培养基加入到步骤（2）得到的混合体系A中，得到混合体系B；
（4）取1-5份PBS缓冲液加入到步骤（3）得到的混合体系B中，得到混合体系C；
（5）取1-10份浓度为25 mmol/ L、pH值为7.6 的HEPES加入到步骤（4）得到的混合体系C中，得到混合体系D；
（6）取1-10份浓度为2 mmol/ L ATP加入到步骤（5）得到的混合体系D中，得到混合体系E；
（7）取1-10份浓度为5 mmol/ L谷胱苷肽加入到步骤（6）得到的混合体系E中，混合均匀，过滤除菌，得到电转染缓冲液。
以上所加物料的份数均为体积份。
上述的哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞是体外培养的哺乳动物细胞。
上述的哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞是体外培养的3T3-L1细胞、CHO细胞、HEK293细胞和A549细胞中的任意一种。
上述的哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于所述的电转染的基因物质为DNA片段。
本发明的有益效果在于：本发明公开哺乳动物细胞高效电转染缓冲液转染率高（能达到64.82%），细胞存活率高（能达到62.33%）；同时，本发明还公开了该电转染缓冲液的制备方法，该方法操作简单，可操作性强。
附图说明
图1 为不同缓冲液阳性标记率（%）的比较；
图2 不同缓冲液细胞存活率（%）的比较。
实施例1 小鼠胚胎成纤维3T3-L1细胞转染质粒
配制电转染缓冲液：称取8.94g KCl、0.01665g CaCl2、1.74 g K2HPO4、0.475gMgCl2，加入无菌水定容至1升，混合得到Cytosalts溶液；取50份Cytosalts溶液，加入15份Opti-MEM培养基，得到混合体系A；取1份RPMI-1640培养基加入到混合体系A中，得到混合体系B；取1份PBS缓冲液加入到混合体系B中，得到混合体系C；取1份浓度为25 mmol/L的HEPES(pH=7.6)加入到混合体系C中，得到混合体系D；取1份浓度为2 mmol/L ATP加入到混合体系D中，得到混合体系E；取1份浓度为5mmol/L谷胱苷肽加入到混合体系E中，混合均匀，用0.2μm针头过滤器过滤除菌（购自美国颇尔PALL），得到哺乳动物细胞电转染缓冲液。
电转染：转染前3天，复苏小鼠胚胎成纤维3T3-L1细胞(中科院上海细胞库)，将细胞放入培养瓶中加10%的FBS+DMEM于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，转染前一天，传代培养复苏成纤维细胞。吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入DMEM培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1000 rpm，5 min)后去上清液，用DMEM培养液制成细胞悬液，按5×104个/ml的密度传代培养。利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，小心悬浮、计数，细胞数为7×105个/ml；去除PBS，利用本发明公开的电转染缓冲液进行悬浮，加入已去内毒素大提质粒pDsRed2-N1（购自Clontech，操作方法参见QIAGEN 12163质粒大提试剂盒）10ug至体积为100ul的细胞悬液中，再将混合液放入到0.2cm的电击杯中，选择衰减波条件下，设置电容500 uF、电压160V，1次脉冲参数进行电击（设置参数参照Bio-Rad电转染仪说明书）。将电击后的细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，加入5ml DMEM（含10%FBS）继续培养。在相同条件下，利用PBS缓冲液和Cytomix缓冲液将pDsRed2-N1质粒DNA转染至3T3-L1细胞中。
转染24小时后，收集悬浮细胞，然后利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，然后采用流式细胞仪分选瞬时转染RFP阳性标记细胞（结果见图1）；用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞存活率（具体步骤参见碧云天细胞凋亡检测试剂盒说明书，结果见图2）。
实施例2 中国仓鼠卵巢CHO细胞转染质粒
配制电转染缓冲液：称取8.94g KCl、0.01665g CaCl2、1.74 g K2HPO4 、0.475gMgCl2，加入无菌水定容至1升，混合得到Cytosalts溶液；取100份Cytosalts溶液，加入10份Opti-MEM培养基，得到混合体系A；取3份RPMI-1640培养基加入到混合体系A中，得到混合体系B；取5份PBS缓冲液加入到混合体系B中，得到混合体系C；取1份浓度为25 mmol/L的HEPES(pH=7.6)加入到混合体系C中，得到混合体系D；取1份浓度为2 mmol/L ATP加入到混合体系D中，得到混合体系E；取1份浓度为5mmol/L谷胱苷肽加入到混合体系E中，混合均匀，用0.2μm针头过滤器过滤除菌，得到哺乳动物细胞电转染缓冲液。
电转染：转染前3天，复苏中国仓鼠卵巢CHO细胞(中科院上海细胞库)，将细胞放入培养瓶中加10%的FBS+ RPMI-1640于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，转染前一天，传代培养复苏成纤维细胞。吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入RPMI 1640培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1000 rpm，5 min)后去上清液，用RPMI 1640培养液制成细胞悬液，按5×104个/ml的密度传代培养。利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，小心悬浮、计数，细胞数为7×105个/ml；去除PBS，利用本发明公开的电转染缓冲液进行悬浮，加入已去内毒素大提质粒pDsRed2-N1（购自Clontech，操作方法参见QIAGEN 12163质粒大提试剂盒）10ug至体积为100ul的细胞悬液中，再将混合液放入到0.2cm的电击杯中，选择方波条件下，设置电压160V，15ms，1次脉冲参数进行电击（设置参数参照Bio-Rad电转染仪说明书）。将电击后的细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，加入5ml RPMI 1640（含10%FBS）继续培养。在相同条件下，利用PBS缓冲液和Cytomix缓冲液将pDsRed2-N1质粒DNA转染至CHO细胞中。
转染24小时后，收集悬浮细胞，然后利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍。取一半细胞，采用流式细胞仪分选瞬时转染RFP阳性标记细胞（结果见图1）；用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞存活率（结果见图2）。
实施例3 HEK293细胞转染质粒
配制电转染缓冲液：称取8.94g KCl、0.01665g CaCl2、1.74 g K2HPO4 、0.475gMgCl2，加入无菌水定容至1升，混合得到Cytosalts溶液；取75份Cytosalts溶液，加入25份Opti-MEM培养基，得到混合体系A；取5份RPMI-1640培养基加入到混合体系A中，得到混合体系B；取1份PBS缓冲液加入到混合体系B中，得到混合体系C；取1份浓度为25 mmol/L的HEPES(pH=7.6)加入到混合体系C中，得到混合体系D；取10份浓度为2 mmol/L ATP加入到混合体系D中，得到混合体系E；取5份浓度为5mmol/L谷胱苷肽加入到混合体系E中，混合均匀，用0.2μm针头过滤器过滤除菌，得到哺乳动物细胞电转染缓冲液。
电转染：转染前3天，复苏HEK293细胞(中科院上海细胞库)，将细胞放入培养瓶中加10%的FBS+DMEM于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，转染前一天，传代培养复苏成纤维细胞。吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入DMEM培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1000 rpm，5 min)后去上清液，用DMEM培养液制成细胞悬液，按5×104个/ml的密度传代培养。利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，小心悬浮、计数，细胞数为7×105个/ml；去除PBS，利用本发明公开的电转染缓冲液进行悬浮，加入已去内毒素大提质粒pEGFP-N1（购自Clontech，操作方法参见QIAGEN12163质粒大提试剂盒）10ug至体积为100ul的细胞悬液中，再将混合液放入到0.2cm的电击杯中，选择方波条件下，电压110V，25ms，1次脉冲参数进行电击（设置参数参照Bio-Rad电转染仪说明书）。将电击后的细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，加入5ml DMEM（含10%FBS）继续培养。在相同条件下，利用PBS缓冲液和Cytomix缓冲液将pEGFP-N1质粒DNA转染至CHO细胞中。
转染24小时后，收集悬浮细胞，然后利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，然后，采用流式细胞仪分选瞬时转染GFP阳性标记细胞（结果见图1）；用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞存活率（结果见图2）。
实施例4人肺腺癌细胞A549细胞转染质粒
配制电转染缓冲液：称取8.94g KCl、0.01665g CaCl2、1.74 g K2HPO4 、0.475gMgCl2，加入无菌水定容至1升，混合得到Cytosalts溶液；取50份Cytosalts溶液，加入10份Opti-MEM培养基，得到混合体系A；取1份RPMI-1640培养基加入到混合体系A中，得到混合体系B；取3份PBS缓冲液加入到混合体系B中，得到混合体系C；取10份浓度为25 mmol/L的HEPES (pH=7.6)加入到混合体系C中，得到混合体系D；取10份浓度为2 mmol/L ATP加入到混合体系D中，得到混合体系E；取10份浓度为5mmol/ L谷胱苷肽加入到混合体系E中，混合均匀，用0.2μm针头过滤器过滤除菌，得到哺乳动物细胞电转染缓冲液。
电转染：转染前3天，复苏A549细胞(中科院上海细胞库)，将细胞放入培养瓶中加10%的FBS+ RPMI-1640于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，转染前一天，传代培养复苏成纤维细胞。吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入RPMI1640培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1000 rpm，5 min)后去上清液，用RPMI1640培养液制成细胞悬液，按5×104个/ml的密度传代培养。利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，小心悬浮、计数，细胞数为7×105个/ml；去除PBS，利用本发明公开的电转染缓冲液进行悬浮，加入已去内毒素大提质粒pEGFP-N1（购自Clontech，操作方法参见QIAGEN 12163质粒大提试剂盒）110ug至体积为100ul的细胞悬液中，再将混合液放入到0.2cm的电击杯中，选择方波条件下，电压150V，10ms，1次脉冲参数进行电击（设置参数参照Bio-Rad电转染仪说明书）。将电击后的细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，加入5ml RPMI1640（含10%FBS）继续培养。在相同条件下，利用PBS缓冲液和Cytomix缓冲液将pEGFP-N1质粒DNA转染至A549细胞中。
转染24小时后，收集悬浮细胞，然后利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，然后，采用流式细胞仪分选瞬时转染GFP阳性标记细胞（结果见图1）；用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞存活率（结果见图2）。
Claims (3)
1.一种哺乳动物细胞电转染缓冲液的制备方法，其特征在于，该方法的工艺步骤如下：
（1）称取8.94g KCl、0.01665g CaCl2、1.74 g K2HPO4、0.475g MgCl2，加入无菌水定容至1升，混合得到Cytosalts溶液；
（2）取50-100份步骤（1）得到的Cytosalts溶液，加入10-25份Opti-MEM培养基，得到混合体系A；
（3）取1-5份RPMI-1640培养基加入到步骤（2）得到的混合体系A中，得到混合体系B；
（4）取1-5份PBS缓冲液加入到步骤（3）得到的混合体系B中，得到混合体系C；
（5）取1-10份浓度为25 mmol/ L、pH值为7.6 的HEPES加入到步骤（4）得到的混合体系C中，得到混合体系D；
（6）取1-10份浓度为2 mmol/ L ATP加入到步骤（5）得到的混合体系D中，得到混合体系E；
（7）取1-10份浓度为5 mmol/ L谷胱苷肽加入到步骤（6）得到的混合体系E中，混合均匀，过滤除菌，得到电转染缓冲液；
以上所加物料的份数均为体积份。
2.根据权利要求1所述的一种哺乳动物细胞电转染缓冲液的制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞是体外培养的哺乳动物细胞。
3.根据权利要求1或2所述的一种哺乳动物细胞电转染缓冲液的制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞是体外培养的3T3-L1细胞、CHO细胞、HEK293细胞和A549细胞中的任意一种。
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