CN105463026B - 一种配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够与高密度矩阵针电极配合使用的电转染缓冲液，该缓冲液的主要成分浓度为氯化钾10‑20mMol/l、葡萄糖10‑20mMol/L、三磷酸腺苷5‑6mMol/l、蔗糖350‑450mMol/l。实验表明，使用本发明的缓冲液对细胞K562、HL60、BHK21进行电穿孔试验，配合高密度矩阵针电极使用比Bio‑Rad电转杯具有更好的细胞存活率和电转染效率，具有预料不到的技术效果。

Description

一种配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液及其制备 方法

技术领域

本发明涉及一种电转染缓冲液及其制备方法，特别是涉及一种配合高密度矩阵针电极电转染的缓冲液及其制备方法。

背景技术

电转染是一种采用机械方法将极性分子通过细胞膜引入宿主细胞的方法，其原理是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子(如DNA等)导入细胞并最终进入胞核的技术。

电转染的过程简述如下：在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。瞬时电压使质粒脱离复合物并扩散至胞质内，同时小部分质粒进入核内与染色体整合，细胞膜上的小孔自动重新闭合。

这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，转染率高，价格便宜，适用谱广等。尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞，亦能获得较高的转染率。该技术已经成为相当有效的非病毒基因转移技术，并在生物学研究和医疗领域广泛使用。

这种基于电脉冲的高效DNA导入可能与电脉冲导致的细胞膜通透性提高和DNA电泳效果有关，因此转染相关的参数如电脉冲强度和持续时间、电极类型和插入方式、DNA的浓度、转染缓冲液的成分及浓度等都会影响基因电转染的效果，对这些参数的优化有助于提高基因电转染的效果，减小毒副作用，提高其在基础研究和临床应用中的可行性。

产生电场可以采用两个平行板电极，分别固定在容器内的两个壁上。将准备进行电转染的细胞悬液与希望导入到细胞内的分子混合，加入到电转染容器内，将其置于两个电极之间。改装后的平行板电极形成了流式电转染电极，采用同轴处理腔的模式，腔体中心为阳极，墙壁为阴极，但是同轴电极处理腔内场强分布不均匀，不同部位场强相差明显。也有采用立体式电极，但是难以使用到体外的细胞电转染。经过对立体式电极的改造，形成了矩阵式电极，不仅能够提供稳定的电场强度，还可以有效的控制电脉冲强度和持续时间。

细胞受电击后产生孔洞使细胞质与电转缓冲液直接接触，因此细胞对渗透压和缓冲液离子组成十分敏感。从渗透压来说，低渗缓冲液比等渗或高渗缓冲液更利于获得较高转染率。对于不同的细胞系也可将等渗和低渗的缓冲液按不同的比例混合使用，最佳的混合物是使细胞在达到最大程度肿胀(达到最大细胞直径)的同时，细胞裂解死亡率又小于10％。

从电转缓冲液组成来说，常用的可以分成以下3类：第1类为细胞培养液，如RPMI1640、DMEM、DMEM/F12、Opti-MEM等；第2类为磷酸缓冲液，如K-PBS，HBS，HeBs，PBS等；第3类为Cytomix缓冲液，Cytomix配方如下：120mmol/L KCl，0.15mmol/L CaCl₂，10mmol/L K₂HPO₄(p H＝7.6)，25mmol/L HEPES(pH＝7.6)，2mmol/L EGTA(pH＝7.6)，5mmol/L MgCl₂，2mmol/L ATP，5mmol/L谷胱苷肽。相比之下，Cytomix的转染率最高，特别是对难以转染的半贴壁细胞和悬浮细胞，而且死亡率较低。Cytomix缓冲液组成与细胞内离子成份非常相似，有助于细胞保持其通透性，与常用的电转缓冲液PBS和完全培养液相比，Cytomix缓冲液中Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺浓度低，用EGTA代替EDTA，pH值、K⁺浓度高，该缓冲液最大程度上模拟了真核细胞内离子环境。

CN2015106385182对Cytomix缓冲液进行了改良，在Cytomix缓冲液中加入无血清Opti-MEM培养基、RPMI-1640培养基及PBS缓冲液能对细胞起营养保护作用，能增加细胞存活率。同时加入的ATP和谷氨酰胺可阻止细胞质成分渗漏，加强细胞膜抗氧化作用，有利于电转染的重新闭合。能够明显提高外源基因在目标细胞的基因电转染效果并能提高细胞存活率，通过这种作用一方面可以直接提高基因的电转染输送效果，另一方面可以减少外源基因的使用量或使用相对较低的电压达到同样的基因输送效果。

CN2014101667597公开了一种优化的电转染技术转染悬浮细胞的方法，以预热的含10％血清的RPMI-1640细胞培养基为电转染缓冲液，以合适的浓度混合细胞与外源DNA，不需要其他的转染试剂，特别适用于CEMx174细胞系。

CN201510280081X公开了一种小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3电转染的方法，采用等渗透压的缓冲液，缓冲液的组成为KCl 25mM、KH₂PO₄0.3mM、K₂HPO₄0.85mM、肌醇280mOsmol/kg，PH7.1-7.3，电导率，25度3.2-3.8mS/cm；应用该缓冲液将质粒pmaxGFP(绿色荧光蛋白)转染到小鼠成纤维细胞NIH/3T3，转染效率最高可以达到55％左右。

CN201310086625X公开了一种采用正向高压脉冲和负向高压脉冲交替使用的方法进行电转染，缓冲液的组分为：PBS缓冲液，浓度30-200mM；Tris-HCl，浓度30-150mM；硝酸钙，浓度为0.2-1mM；氯化钾，浓度2-8mM；氯化镁，浓度10-20mM；氯化钠浓度50-150；葡萄糖，浓度5-30mM；pH6.5-7.2。在外周血单核细胞转染绿色荧光蛋白细胞转染效率达到了50％左右。

也有人提出电转染缓冲液的配方为200mM/L葡萄糖、5mM硫酸镁、2mM/L疏基乙醇、20mM/LTris-HCI，pH值7.3，但是电转染时细胞容易成团、死亡率高，转染效率较低。

虽然已有各种电转染缓冲液，但是由于这些缓冲液也存在各种缺陷，例如组分复杂，对电压脉冲要求高，电转染率不高等。而且目前市场上现有的电转染缓冲液均由各电转染仪厂商提供，其组成及物理化学性能未知。并且这些缓冲液均只能与同一厂商的一个或几个型号的电转染仪配合使用。例如Bio-Rad的电转仪做细胞转染，必须使用Bio-Rad公司的Gene Pulser Electroporation Buffer(货号：165-2677)缓冲液。

在尝试使用已有的缓冲液与我们自行研发的高密度矩阵针电极进行电转染时，也会出现细胞死亡率高，或很低的细胞转染效率，或者两种情况同时出现的现象。究其原因主要是因为高密度矩阵针电极对缓冲液的pH值、渗透压和电导率的要求比较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种电转缓冲液，使该缓冲液能够与高密度矩阵针电极配合使用，为高密度矩阵针电极电转染仪提供一种能够同时实现高细胞存活率和高转染率的缓冲液，同时适合绝大多数真核细胞及部分原核细胞。

电转染缓冲液的主要组分的浓度分别设置为：氯化钾10-20mMol/l、葡萄糖10-20mMol/L、三磷酸腺苷5-6mMol/l、蔗糖350-450mMol/l、优选的氯化钾15mMol/L、葡萄糖15mMol/L、三磷酸腺苷5.2mMol/L、蔗糖390mMol/L；缓冲液的pH值控制在7.0-7.7之间，将其电导率控制在3.5-4ms/cm，渗透压在200-450mOsm/Kg。

缓冲液可用作荧光染料的稀释液以及流式分析用细胞的重悬、洗涤以及储存，应用类型包括流式、直接免疫荧光染色、间接免疫荧光染色、细胞内染色、免疫细胞化学等。

缓冲液的配制方法：

用电子天平秤取相应量的化学纯固体试剂；

加980ml去离子的双蒸水溶解；

使用pH仪测定溶液酸碱度，保证其在有效区间；如果不在有效区间内，用强酸(如盐酸)或强碱(如氢氧化钠)进行调节；调节好pH值后，加水定容到1L；

分装到125ml的试剂瓶进行121℃，20min灭菌；

冷却后无菌包装室温保存；

本发明的有益效果是：

通过调节缓冲液pH值至中性来减小对细胞的损伤，显著提高细胞存活率

通过调节缓冲液的浓度来调节其渗透压，以提高细胞膜的通透性；

通过调节缓冲液的导电性来调节目标转染物(质粒，DNA，RNA)电场的作用下在缓冲液中的运动性，从而提高转染效率。

适用于难转染细胞等几乎所有细胞类型，高通用性。

适用于所有细胞的单一的转染缓冲液，被转染小分子直接溶解在转染缓冲液中，无须其他任何转染试剂。

与高密度矩阵针电极电转染仪具有非常高的相容性。

具体实施方式

实施例一

实验仪器，苏州壹达细胞电转染仪型号EBXP-H1，Nunc 24孔板；

K562，人慢性髓原白血病细胞，RPMI 1640培养基培养(含10％Gibco FBS)；HL60，人急髓白血病细胞，RPMI 1640培养基培养(含10％Gibco FBS)，；BHK21，乳仓鼠肾细胞，DMEM高糖培养基培养(含10％Gibco FBS)；

紫外消毒超净台30min，同时将1×PBS、DMEM高糖培养基、0.25％Trypsin-EDTA 37℃水浴30min；

弃去培养基，加入适量的1×PBS清洗细胞，弃去后加入适量的0.25％Trypsin-EDTA消化细胞，除去0.25％Trypsin-EDTA，37℃培养箱中消化2min；消化完全后，取适量完全培养基中止消化，并吹打至单个细胞，通过血球计数板进行计数；

用2ml的EP管取培养瓶中细胞，吹打后通过血球计数板进行计数；取所需细胞悬液，1000rpm离心5min；

用移液枪弃去培养基，加入1ml缓冲液重悬细胞，1000rpm，离心5min；

用移液枪弃去缓冲液，加入所需的缓冲液和质粒，轻轻吹打混匀；

将混有质粒的细胞悬液按照60μl/孔，加入到96孔板相应的孔内，静置5min后，将针电极插入孔内，选择正确的电转条件电转；电转条件为：放电电压为80-180V，持续时间为100us。

电击过程中，用手扶住针电极的外侧，保证针电极与孔垂直，手不可接触到针尖；

电转之后，静置5min，将细胞转移到装有完全培养基的24孔板中。

24h后观察细胞荧光表达并拍照(4×，10×)；

取细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清后加入500μl含有PI的PBS染液于4℃避光10min，流式细胞仪定量分析其转染效率和细胞存活率。

实施例二

实验仪器，Bio-Rad电转杯，Nunc 24孔板，实验细胞与实施例一相同。

消化：取细胞培养皿吸去培养基，用PBS清洗2遍(每次3ml)，加入1ml的胰蛋白酶，消化；消化中止：消化结束后加入3ml的培养基中止消化，并吹打多次，尽可能使貼壁细胞变成悬浮状态；

离心：将步骤2中样品全部移入离心管中，1000rpm，5min，计数；

重悬：将步骤3中的样品移去原来的培养基，换上Opti-MEM培养基，稀释重悬；

电转：取60μl稀释后的细胞培养液于Bio-Rad电极杯，按照说明书装入电转机中，按说明书操作步骤操作；电转条件为：放电电压为140-155V，电极间距0.2cm。

电转之后，静置5min，将细胞转移到装有完全培养基的24孔板中。

24h后观察细胞荧光表达并拍照(4×，10×)；

取细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清后加入500μl含有PI的PBS染液于4℃避光10min，流式细胞仪定量分析其转染效率和细胞存活率。

实验结果

由实验结果可见，使用本发明的缓冲液与高密度矩阵针电极配合使用的细胞存活率和转染效率以及综合效率都要优于本发明的缓冲液与Bio-Rad电极配合使用后的效果。

Claims (7)

1.一种配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液，其特征在于，包括氯化钾10-20mMol/l、葡萄糖10-20mMol/L、三磷酸腺苷5-6mMol/l、蔗糖350-450mMol/l；所述缓冲液的pH值在7.0-7.7之间，电导率在3.5-4ms/cm，渗透压在200-450mOsm/Kg。

2.如权利要求1所述的配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液，其特征在于，氯化钾15mMol/l、葡萄糖15mMol/l、三磷酸腺苷5.2mMol/l、蔗糖390mMol/l。

3.如权利要求1所述的配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液，其特征在于，缓冲液的pH值为7.0，电导率在3.9ms/cm。

4.一种如权利要求1所述的配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，用电子天平秤取相应量的化学纯固体试剂；加980ml去离子的双蒸水溶解；使用pH仪测定溶液酸碱度，调节好pH值后，加水定容到1L。

5.一种细胞电转染的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液的步骤。

6.权利要求1所述的配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液用于荧光染料的稀释液以及流式分析用细胞的重悬、洗涤以及储存的用途。

7.权利要求1所述的配合高密度矩阵针电极使用的电转染缓冲液配合高密度矩阵针电极用于细胞电转染的用途。