CN103776771B - 一种检测毛竹纳米微晶纤维素生物相容性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测毛竹纳米微晶纤维素生物相容性的方法。采用方法的要点是将毛竹纳米微晶纤维素配成一定浓度的溶液，分别加入荧光染色剂与细胞增殖与活性检测试剂（Cell Counting Kit,CCK-8），与细胞共同培养检测其生物相容性。该方法简易、快速、高效，特别适于检测毛竹纳米微晶纤维素的生物相容性。将毛竹纳米微晶纤维素与细胞共同培养，利用CCK-8试剂定量测定细胞在毛竹纳米微晶纤维素中的增殖情况，本发明提供的方法生成产物为水溶性的,不需要后续的溶解过程,可避免因溶解不完全而造成的实验误差，使检测结果更可靠、有效。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测微晶纤维素生物相容性的方法，特别涉及一种检测毛竹纳米微晶纤维素生物相容性的方法，属于生物质材料资源化利用技术领域。
背景技术
生物相容性是指材料置入生物体内与机体之间产生一系列生物、物理、化学等反应的概念。对生物相容性的检测主要基于生物安全性、生物功能性两大基本原则，即要求生物材料无毒性、无刺激性、无致癌性、无致敏性、无致畸性、无突变性、无排斥性以及能够刺激宿主产生满足特定功能的生物学响应。目前，检测材料生物相容性的方法主要为组织相容性和体外细胞生物学两类。组织相容性检测方法主要是用组织生物学方法观察材料置入生物体内后周围组织的反应情况，虽然更能真实地反应材料的生物学性能，但往往需要较长的实验观察周期、耗用成本较大且体内生物环境复杂、实验较难控制。因此常常通过体外细胞生物学方法对材料生物相容性进行检测。体外细胞生物学方法是将生物材料与活体细胞在体外共同培养以研究细胞在材料上的粘附、增殖、分化等生物学行为。
人骨肉瘤细胞（MG63）是一种具有成骨细胞表型特性的特殊肿瘤细胞群，主要是从成骨细胞或骨髓间充质干细胞分化而来，由于其表型稳定而广泛应用在生物材料对成骨细胞生物学特性影响的研究方面。小鼠成纤维细胞（L929）在体外替代实验研究中应用广泛，主要针对药物载体的生物相容性检测。
在纳米微晶纤维素的制备及性能检测领域，中国专利（ZL01107523.6）“一种具有纤维素Ⅱ晶型的纳米微晶纤维素及制法”以棉短绒为原料，采用DMSO与强碱同时溶胀，无机酸、有机酸或固态酸水解制备了纳米微晶纤维素，并描述了其形貌和晶型结构；中国专利（ZL200510100343.6）“用氯气氧化降解制备纳米微晶纤维素的方法”以剑麻纤维或木材纤维为原料，采用氯气氧化降解制备了色泽洁白的球状纳米微晶纤维素；中国专利（ZL00117261.1）“一种纳米微晶纤维素及制法”以棉短绒为原料，采用硫酸、盐酸、磷酸和硝酸中一种或几种的混合物，或者采用丙烯酸、苯甲酸、乙二酸中一种或几种的混合物，或者采用固体酸水解制备了纳米微晶纤维素，并对其形貌和晶型进行了表征；美国专利（US20100124651A1）“Methodofmanufacturingnano-crystallinecellulosefilm”采用木材纤维纳米微晶纤维素为原料，与有机和无机材料复合，制备了高强度纳米复合材料薄膜，大幅提高了原薄膜的物理性能。截至目前，还未见到以MG63和L929细胞为评价体系，检测毛竹纳米微晶纤维素生物相容性的的相关工艺技术出现。
纳米微晶纤维素作为一种新型可再生纳米材料正备受关注，其不但具有普通纤维素的基本结构和性能，还具备纳米颗粒的特性，如巨大的比表面积、较高的杨氏模量、超强的吸附能力和灵敏的反应活性，目前主要应用于材料增强、改善材料光学特性等方面。通过适宜的评价细胞，检测其生物相容性，可拓展纳米微晶纤维素在生物医药如骨组织修复、药物载体方面的应用范围。
发明内容
为了拓宽纳米微晶纤维素的应用领域和范围，高值化利用现有毛竹资源，为生物医药领域（骨组织修复、药物载体等方面）提供新型可再生纳米材料，评价其生物学特性，本发明的目的是提供一种检测毛竹纳米微晶纤维素生物相容性的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是采用以下步骤：
1）将毛竹纳米微晶纤维素配制成浓度0.04wt%溶液，进行高压灭菌处理，得到经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液；
2）在无菌环境下，将检测细胞在培养基中按传代培养方法消化成单细胞悬浊液，进行细胞计数，以5×103个/孔向96孔板中加入检测细胞，同时量取步骤1）中得到的经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液分别加入96孔板，保证每孔溶液总量200μL，获得毛竹纳米微晶纤维素-检测细胞混合培养液，放入细胞培养箱中进行培养；
3）分别在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹纳米微晶纤维素-检测细胞混合培养液，用PBS溶液清洗数次，加入CCK-8试剂和培养基在培养箱中培养2-6h，吸取100μL上清液加入96孔板中,在450nm波长采用酶标仪检测其OD值；
4）同时将步骤2）中得到的毛竹纳米微晶纤维素-检测细胞混合培养液与含有DiO染料的培养基在细胞培养箱中培养10~20min，吸出培养基并用PBS溶液清洗去除未结合染料，加入1mL胰酶，制成单细胞悬液，放入细胞培养箱中进行培养，分别在1、3、5、7天利用荧光显微镜观察细胞的增殖情况。
所述的毛竹纳米微晶纤维素，由硫酸水解或纤维素酶水解毛竹纤维制备。
所述的PBS溶液浓度为0.01~0.05mol/L；CCK-8试剂与培养基质量比为1:10~50；Dio染料与培养基质量比为1:100~300。
所述的检测细胞是L929细胞和MG63细胞中的一种，其中L929细胞采用MEM培养基进行培养，MG63细胞采用DMEM培养基进行培养。
与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：
本发明在表征纳米微晶纤维素性能领域引入对其进行生物学特性检测的方法，对于拓展其在生物医药领域，特别是骨组织修复、药物载体方面的实际应用提供了前提，对于拓宽和高值化利用纳米微晶纤维素具有重要意义。
附图说明
图1、2、3、4分别是实施例1中的毛竹纳米微晶纤维素与L929细胞共混培养1、3、5、7天的荧光显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1）将由纤维素酶水解制备的毛竹纳米微晶纤维素配制成浓度0.04wt%溶液，进行高压灭菌处理，得到经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液；
2）在无菌环境下，将L929细胞在MEM培养基中按传代培养方法消化成单细胞悬浊液，进行细胞计数，以5×103个/孔向96孔板中加入L929细胞，同时量取步骤1）中得到的经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液分别加入96孔板，保证每孔溶液总量200μL，获得毛竹纳米微晶纤维素-L929细胞混合培养液，放入细胞培养箱中进行培养；
3）分别在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹纳米微晶纤维素-L929细胞混合培养液，用0.01mol/LPBS溶液清洗数次，按照1:30质量比加入CCK-8试剂和MEM培养基在培养箱中培养4h，吸取100μL上清液加入96孔板中,在450nm波长采用酶标仪检测其OD值（a）；
4）同时将步骤2）中得到的毛竹纳米微晶纤维素-L929细胞混合培养液与含有DiO染料的MEM培养基在细胞培养箱中培养15min，Dio染料与MEM培养基质量比为1:100，吸出MEM培养基并用0.01mol/LPBS溶液清洗去除未结合染料，加入1mL胰酶，制成单细胞悬液，放入细胞培养箱中进行培养，分别在1、3、5、7天利用荧光显微镜观察细胞的增殖情况。
实施例2:
1）将由硫酸水解制备的毛竹纳米微晶纤维素配制成浓度0.04wt%溶液，进行高压灭菌处理，得到经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液；
2）在无菌环境下，将MG63细胞在DMEM培养基中按传代培养方法消化成单细胞悬浊液，进行细胞计数，以5×103个/孔向96孔板中加入MG63细胞，同时量取步骤1）中得到的经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液分别加入96孔板，保证每孔溶液总量200μL，获得毛竹纳米微晶纤维素-MG63细胞混合培养液，放入细胞培养箱中进行培养；
3）分别在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹纳米微晶纤维素-MG63细胞混合培养液，用0.03mol/LPBS溶液清洗数次，按照1:50质量比加入CCK-8试剂和DMEM培养基在培养箱中培养2h，吸取100μL上清液加入96孔板中,在450nm波长采用酶标仪检测其OD值（b）；
4）同时将步骤2）中得到的毛竹纳米微晶纤维素-MG63细胞混合培养液与含有DiO染料的DMEM培养基在细胞培养箱中培养20min，Dio染料与DMEM培养基质量比为1:300，吸出DMEM培养基并用0.03mol/LPBS溶液清洗去除未结合染料，加入1mL胰酶，制成单细胞悬液，放入细胞培养箱中进行培养，分别在1、3、5、7天利用荧光显微镜观察细胞的增殖情况。
实施例3:
1）将由纤维素酶水解制备的毛竹纳米微晶纤维素配制成浓度0.04wt%溶液，进行高压灭菌处理，得到经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液；
2）在无菌环境下，将MG63细胞在DMEM培养基中按传代培养方法消化成单细胞悬浊液，进行细胞计数，以5×103个/孔向96孔板中加入MG63细胞，同时量取步骤1）中得到的经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液分别加入96孔板，保证每孔溶液总量200μL，获得毛竹纳米微晶纤维素-MG63细胞混合培养液，放入细胞培养箱中进行培养；
3）分别在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹纳米微晶纤维素-MG63细胞混合培养液，用0.05mol/LPBS溶液清洗数次，按照1:10质量比加入CCK-8试剂和DMEM培养基在培养箱中培养2h，吸取100μL上清液加入96孔板中,在450nm波长采用酶标仪检测其OD值（c）；
4）同时将步骤2）中得到的毛竹纳米微晶纤维素-MG63细胞混合培养液与含有DiO染料的DMEM培养基在细胞培养箱中培养10min，Dio染料与DMEM培养基质量比为1:200，吸出DMEM培养基并用0.05mol/LPBS溶液清洗去除未结合染料，加入1mL胰酶，制成单细胞悬液，放入细胞培养箱中进行培养，分别在1、3、5、7天利用荧光显微镜观察细胞的增殖情况。
测定实施例1、2、3得到的毛竹纳米微晶纤维素OD值。表1为由实施例1、2、3检测的毛竹纳米微晶纤维素生物相容性表征结果。由表1中数据可知，采用本发明所述的检测方法获得的毛竹纳米微晶纤维素OD值（a）、（b）、（c）分布在0.42~0.80之间，说明不同水解工艺制备的毛竹纳米微晶纤维素对MG-63与L929细胞增殖均有促进作用，其中由纤维素酶水解制备的毛竹纳米微晶纤维素促进细胞增殖效果更为明显，具备更好的生物相容性。
如图1、2、3、4所示，从实施例1检测获得的毛竹纳米微晶纤维素荧光显微镜照片可看出，随着培养时间的延长（1~7天），与毛竹纳米微晶纤维素共同培养的L929细胞数量不断增加并最终保持稳定，说明由纤维素酶水解制备的毛竹纳米微晶纤维素对L929细胞的增殖具有明显的促进作用，因此具备良好的生物相容性。
表1
以上列举的仅是本发明的具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种检测毛竹纳米微晶纤维素生物相容性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将由硫酸水解或纤维素酶水解毛竹纤维制备得到的毛竹纳米微晶纤维素配制成浓度0.04wt%溶液，进行高压灭菌处理，得到经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液；
2）在无菌环境下，将采用MEM培养基培养的小鼠成纤维细胞（L929）按传代培养方法消化成单细胞悬浊液，进行细胞计数，以5×103个/孔向96孔板中加入L929细胞，同时量取步骤1）中得到的经预处理的毛竹纳米微晶纤维素溶液分别加入96孔板，保证每孔溶液总量200μL，获得毛竹纳米微晶纤维素-L929细胞混合培养液，放入细胞培养箱中进行培养；
3）分别在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹纳米微晶纤维素-L929细胞混合培养液，用0.01~0.05mol/L的磷酸缓冲溶液（Phosphatebuffersolution,PBS）清洗数次，加入细胞增殖与活性检测试剂（CellCountingKit,CCK-8）和培养基在培养箱中培养2-6h，CCK-8试剂与培养基质量比为1:10~50，吸取100μL上清液加入96孔板中,在450nm波长采用酶标仪检测其光密度值（Opticaldensity,OD）；
4）同时将步骤2）中得到的毛竹纳米微晶纤维素-L929细胞混合培养液与含有细胞膜绿色荧光探针染料（Dio）的培养基在细胞培养箱中培养10~20min，Dio染料与培养基质量比为1:100~300，吸出培养基并用0.01~0.05mol/L的PBS溶液清洗去除未结合染料，加入1mL胰酶，制成单细胞悬液，放入细胞培养箱中进行培养，分别在1、3、5、7天利用荧光显微镜观察细胞的增殖情况。
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