CN1431299A - 一种人表皮细胞无血清培养基及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞培养基及其培养方法与应用，尤其是一种人表皮细胞无血清培养基及其应用。本无血清培养体基是采用以IMDM培养为基础，加入自行研制的无血清培养基血清替代物，包括过氧化氢酶、牛血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、胰岛素、氢化可的松等，再补充表皮细胞生长因子、牛垂体提取物、乙醇胺等组成人表皮细胞无血清培养基。本发明的无血清培养体系可用于传代和原代人表皮细胞体外无血清培养，本发明排除了血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高某些药物或因子对表皮细胞影响研究的准确度和精确性，并可用于在烧伤治疗学、整形美容学和皮肤学等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞培养基及其培养方法与应用，尤其是一种人表皮细胞无血清培养基及其应用。
背景技术
人表皮细胞体外扩增培养在烧伤治疗、皮肤病学和药理学研究中具有重要作用。传统的表皮细胞培养是在培养液中加入一定比例的血清，然而血清的成份十分复杂，不明因子繁多，且各批血清间所含的生长因子和激素的变化很大。因此，传统的有血清培养影响对表皮细胞生长调节机制的精确研究。80年代以来，国外学者致力于探索表皮细胞无血清培养的可能性并取得了一定程度的成功，但始终未达到有血清体外培养方法的生长速度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人表皮细胞无血清培养基及其应用，可减少有血清培养体系的不良干扰，且达到较快的生长速度。
本发明的技术方案为：
一种人表皮细胞无血清培养基，包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，还包括0.01-10微克/毫升的氢化可的松。
较优的技术方案有下列：
一种人表皮细胞无血清培养基，包括80-120毫克/毫升牛血清白蛋白，7-12微克/毫升人转铁蛋白，60-100微克/毫升胰岛素，150-250微克/毫升胆固醇，150-250微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.1-0.8微克/毫升的氢化可的松。
一种人表皮细胞无血清培养基，包括100毫克/毫升牛血清白蛋白，10微克/毫升人转铁蛋白，80微克/毫升胰岛素，200微克/毫升胆固醇，200微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.4-0.5微克/毫升的氢化可的松。该无血清培养基较适用于人表皮细胞生存培养。
一种人表皮细胞无血清培养基，牛血清白蛋白经去毒处理。
一种人表皮细胞无血清培养基，牛血清白蛋白经去毒处理的步骤：50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠5-10g混合搅拌均匀，置于4℃下2-4小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠5-10g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。
一种人表皮细胞无血清培养基，还加入5-15倍IMDM基础培养基，5-15微克/升表皮细胞生长因子，25-100毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺0.5-4×10-5mol/升。
一种人表皮细胞无血清培养基，还加入9-11倍IMDM基础培养基，9-10微克/升表皮细胞生长因子，40-70毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺1-2×10-5mol/升。表皮细胞生长因子，牛垂体提取物，乙醇胺对人表皮细胞生长有利，该无血清培养基较适用于人表皮细胞生长培养。
一种人表皮细胞无血清培养方法，其特征在于：按下列步骤进行：(1)取人皮肤，加胰蛋白酶处理，加入IMDM培养基配成单个细胞悬液；(2)无血清培养基配制：IMDM培养基加10％人表皮细胞无血清培养基；其中人表皮细胞无血清培养基包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，氢化可的松；(3)再补充表皮细胞生长因子，乙醇胺，牛垂体提取物，配制成人表皮细胞无血清培养基；(4)将分离的人表皮细胞用无血清培养基配制成浓度为0.5-4×10-6/毫升，接种于用经多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿中，置于细胞培养箱中培养，其中多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿方法：将0.1毫克/毫升多聚赖氨酸置于塑料培养板或培养皿，室湿静置30分钟，无菌超净台中吹干，用生理盐水洗一次；吸干生理盐水即可接种人表皮细胞。
人表皮细胞无血清培养基，应用于人表皮细胞生存生长培养。
我们一直从事表皮细胞体外培养研究，已建立了有血清体外培养表皮细胞的方法。
配制无血清培养基血清替代物。根据细胞培养所需营养成份的特点，寻找血清替代物的组成，并进行各种加入物质的浓度筛选，确定最佳的浓度和组成。其中，牛血清白蛋白在配制前需用树酯去毒素处理，效果更好。
配制人表皮细胞无血清培养基，根据表皮细胞生长所需特殊因子的需要，选用IMDM作为基础培养基，再补充表皮细胞生长因子，牛垂体提取物，乙醇胺，促进表皮细胞贴壁生长。并筛选各种补充因子的最佳浓度。
比较本研制的新型人表皮细胞培养基与有血清培养、国外已有的人表皮培养基MCDB153培养表皮细胞效果，以证明本发明新型培养基的优点和效果。
发明优点和效果
1、本发明研究配制的无血清培养体系应用于人表皮细胞体外培养，其效果与有血清比较无明显差别。在倒置显微镜下动态观察：无血清组与有血清组表皮细胞生长特点和生长速度相似。电镜观察：无血清条件下培养14天的表皮细胞其结构清晰，胞内见大量束状张力丝和张力原纤维。相邻的细胞间明显的桥粒结构相连，说明无血清条件下培养的表皮细胞能形成表皮片，同时提示我们研制的无血清培养体系可替代血清用于表皮细种体外培养。
2、本发明研制的无血清培养体系不仅适合于传代表皮细胞培养，而且适合于原代表皮细胞培养。在此之前，国内外一般采用的无血清培养是MCDB153，但该培养基仅适用于低密度接种传代的表皮细胞生长。所以，很多研究工作者只有将分离的原代表皮细胞先采用有血清培养，待细胞贴壁生长良好后才逐渐换成MCDB153培养。为寻求更近似于生理状态的培养条件，探索适合于原代表皮细胞生长的培养体系，我们以IMDM培养基为基础培养基，添加过氧化氢酶、牛血清白蛋白、人转铁蛋白、胰岛素、胆固醇、氢化可的松成为无血清限定培养基，再补充表皮细胞生长因子、牛垂体提取物、乙醇胺等组成无血清完全培养基。同时，考虑到无血清培养中缺少贴壁因子，我们采用多聚赖氨酸预先处理培养器皿。通过对各种补充因子及其浓度的反复筛选，成功地建立了适合于原代及传代表皮细胞培养的无血清培养体系。MCDB153购于美国Sigma公司；IMDM(Iscove’s Modufied Dulbeccos Medium)购于美国Gibco公司。
3、本发明配制的无血清体系的几个主要特色：
(1)在人表皮无血清培养体系中加入过氧化氢酶是我们独有的。我们的实验结果提示：随着加入的过氧化氢酶浓度增大，表皮细胞DNA合成增加，证明过氧化氢酶在无血清培养中对细胞生长的重要作用。其作用机理是：表皮细胞培养过程中可产生过氧化氢，而过氧化氢是细胞生长的主要毒性物质，它可使细胞膜上的饱和脂肪酸氧化、细胞蛋白质氧化和/或DNA损伤而引起细胞死亡。过氧化氢酶则可降解过氧化氢而使细胞免受该毒性物质的作用。
(2)本发明中采用的IMDM培养基是在DMEM培养基的基础上补充氨基酸、无机盐和维生素等11种成份组成，其中所含亚硒酸钠浓度高于MCDB153，已知亚硒酸钠是谷胱苷肽氧化酶的辅酶成份，较高浓度的硒有利于人表皮细胞生长。
(3)采用多聚赖氨酸为底物。由于无血清培养基中不含血清，缺少血清中一些有利于细胞贴壁的因子。因此，如何提高无血清条件表皮细胞贴壁、集落形成和融合片的速度，成为表皮细胞无血清培养中重要的一步。一些学者采用3T3细胞滋养层、胶原及纤维联接蛋白来促进表皮细胞贴壁和集落形成，均获一定效果。但3T3作为异种的具有间变性质的细胞，会产生和表达对人体不利的代谢产物和抗原，目前其应用尚存很大的争议。胶原使用前需氨薰和紫外线照射过夜，制作比较复杂。纤维联接蛋白如果残留在培养液中可明显抑制表皮细胞增殖。本实验采用多聚赖氨酸预先处理培养器皿，结果能明显提高表皮细胞的贴壁、集落形成和膜片形成速率，同时对培养的表皮细胞生长无不利影响。其作用机理可能是：①多聚赖氨酸带阳性电荷，吸附于器皿表面可改变普通器皿的阴性电荷，提高带阴性电荷细胞的贴附率。②多聚赖氨酸等贴壁因子可与表皮细胞表面受体发生相互作用，促进细胞贴壁生长。
(4)本无血清体系中其它几个主要补充因子的作用是：①牛血清白蛋白除可提供足够的脂肪酸以满足细胞生长的需要外，它还可结合某些金属离子(如Ca++等)，使其游离浓度降低，已知低钙环境对表皮细胞生长有利；②胆固醇有利于细胞增殖分化；③牛垂体提取物具有较强致有丝分裂作用；④乙醇对表皮细胞生长因子有协同作用，促进表皮细胞增殖，推迟终末分化。
我们已用研制的无血清培养体系来评价几种常用烧伤外用药对表皮细胞体外生长的影响，筛选抗菌效果好、而对表皮细胞生长无明显影响的抗菌药物。如我们通过体外无血清表皮细胞培养证实氟银溶液对表皮生长无明显影响。因而采用氟银溶液处理辐照猪皮，为“辐照氟银猪皮”的研制提供了药物配方依据。该“猪皮”已广泛应用于烧伤治疗并取得了良好效果。
建立了一种适合于原代和传代人表皮细胞培养的无血清培养体系，用于人表皮细胞无血清培养的血清代用品是我们综合国内外表皮细胞培养方法后自己研制的，其中主要创新点：①加入能降解表皮细胞培养过程中产生的过氧化氢(H2O2)的过氧化氢酶(catalase)；②采用含亚硒酸钠浓度较高的IMDM培养基；③用多聚赖氨酸预处理培养器皿；④与国外已有的MCDB153相比，我们研制的无血清培养体系用于人表皮细胞体外培养，细胞生长特点及速度与有血清培养相近，且同时适合于原代细胞培养。
本体系排除了血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高某些药物或因子对表皮细胞影响研究的准确度和精确性，这不仅为表皮细胞生长、增殖和分化调节与机制研究提供有力工具，而且为其在烧伤治疗学、整形美容学和皮肤学等领域广泛应用奠定基础。
具体实施方式
实施例1一种人表皮细胞无血清培养基，包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，还包括0.01-10微克/毫升的氢化可的松。
实施例2一种人表皮细胞无血清培养基，包括80-120毫克/毫升牛血清白蛋白，7-12微克/毫升人转铁蛋白，60-100微克/毫升胰岛素，150-250微克/毫升胆固醇，150-250微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.1-0.8微克/毫升的氢化可的松。
实施例3一种人表皮细胞无血清培养基，包括100毫克/毫升牛血清白蛋白，10微克/毫升人转铁蛋白，80微克/毫升胰岛素，200微克/毫升胆固醇，200微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.4-0.5微克/毫升的氢化可的松。该无血清培养基较适用于人表皮细胞生存培养。
实施例4一种人表皮细胞无血清培养基，牛血清白蛋白经去毒处理。
实施例5一种人表皮细胞无血清培养基，牛血清白蛋白经去毒处理的步骤：50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠5-10g混合搅拌均匀，置于4℃下2-4小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠5-10g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。树脂珠来源美国Sigma公司。
实施例6一种人表皮细胞无血清培养基，还加入5-15倍IMDM基础培养基，5-15微克/升表皮细胞生长因子，25-100毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺0.5-4×10-5mol/升。
实施例7一种人表皮细胞无血清培养基，还加入9-11倍IMDM基础培养基，9-10微克/升表皮细胞生长因子，40-70毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺1-2×10-5mol/升。表皮细胞生长因子，牛垂体提取物，乙醇胺对人表皮细胞生长有利，该无血清培养基较适用于人表皮细胞生长培养。
实施例8一种人表皮细胞无血清培养方法，其特征在于：按下列步骤进行：(1)取人皮肤，加胰蛋白酶处理，加入IMDM培养基配成单个细胞悬液；(2)无血清培养基配制：IMDM培养基加10％人表皮细胞无血清培养基；其中人表皮细胞无血清培养基包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，氢化可的松；(3)再补充表皮细胞生长因子，乙醇胺，牛垂体提取物，配制成人表皮细胞无血清培养基；(4)将分离的人表皮细胞用无血清培养基配制成浓度为0.5-4×10-6/毫升，接种于用经多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿中，置于细胞培养箱中培养，其中多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿方法：将0.1毫克/毫升多聚赖氨酸置于塑料培养板或培养皿，室湿静置30分钟，无菌超净台中吹干，用生理盐水洗一次；吸干生理盐水即可接种人表皮细胞。实施例9将上述人表皮细胞无血清培养基，应用于人表皮细胞生存生长培养。例如：(1).烧伤创面治疗所需表皮片培养(2).疤痕创面整形美容(3).皮肤病药物筛选(4).化妆品有效成份的筛选及对表皮细胞有无毒性作用为确定(5)确定和筛选某些细胞因子对表皮细胞生长的影响(6).其他皮肤生理和皮肤病理学研究。实施例10一组人表皮细胞无血清培养基：
一种人表皮细胞无血清培养基，包括80毫克/毫升牛血清白蛋白，7微克/毫升人转铁蛋白，60微克/毫升胰岛素，150微克/毫升胆固醇，150微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.01微克/毫升的氢化可的松；还加入5倍IMDM基础培养基，5微克/升表皮细胞生长因子，25毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺0.5×10-5mol/升。其中牛血清白蛋白经去毒处理的步骤：50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠5g混合搅拌均匀，置于4℃下2小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠5g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。
一种人表皮细胞无血清培养基，包括120毫克/毫升牛血清白蛋白，12微克/毫升人转铁蛋白，100微克/毫升胰岛素，250微克/毫升胆固醇，250微克/毫升过氧化氢酶，还包括10微克/毫升的氢化可的松；还加入15倍IMDM基础培养基，15微克/升表皮细胞生长因子，100毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺4×10-5mol/升。其中牛血清白蛋白经去毒处理的步骤：50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠5-10g混合搅拌均匀，置于4℃下2-4小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠10g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。
一种人表皮细胞无血清培养基，包括包括100毫克/毫升牛血清白蛋白，10微克/毫升人转铁蛋白，80微克/毫升胰岛素，200微克/毫升胆固醇，200微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.4微克/毫升的氢化可的松，还包括0.8微克/毫升的氢化可的松；还加入8倍IMDM基础培养基，8微克/升表皮细胞生长因子，70毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺3×10-5mol/升。其中牛血清白蛋白经去毒处理的步骤：50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠8g混合搅拌均匀，置于4℃下3小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠8g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。
一种人表皮细胞无血清培养基，包括90毫克/毫升牛血清白蛋白，9微克/毫升人转铁蛋白，70微克/毫升胰岛素，180微克/毫升胆固醇，200微克/毫升过氧化氢酶，还包括3微克/毫升的氢化可的松；还加入9倍IMDM基础培养基，9微克/升表皮细胞生长因子，40毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺1×10-5mol/升。其中牛血清白蛋白经去毒处理的步骤：50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠5-10g混合搅拌均匀，置于4℃下3小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠7g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。
一种人表皮细胞无血清培养基，包括100毫克/毫升牛血清白蛋白，7-12微克/毫升人转铁蛋白，75微克/毫升胰岛素，200微克/毫升胆固醇，175微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.03微克/毫升的氢化可的松；还加入10倍IMDM基础培养基，10微克/升表皮细胞生长因子，70毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺2×10-5mol/升。
实施例11.
1、取人皮肤，0.25％胰蛋白酶在4℃消化16-20小时，分离表皮，用吸管吹打后100目尼龙网过滤，加入IMDM培养基配成单个细胞悬液。
2.无血清培养基配制：IMDM培养基+10％无血清培养基血清替代物(经过正交试验筛选：其中含牛血清白蛋白15mg/ml(9-15mg/)、过氧化氢酶10ug/ml(5-15ug/ml)、胰岛素8ug/ml(5-10ug/ml)、人转铁蛋白5ug/ml(1-5uglml)、胆固醇20ug(15-25ug/ml)、氢化可的松0.5ug/ml(0.1-0.7ug/ml)。再补充表皮细胞生长因子10ng/ml、乙醇胺1×10-5mol/L、牛垂体提取物70ug/ml，配制成人表皮细胞无血清培养基。
此培养基中牛血清白蛋白15mg/ml、过氧化氢酶10ug/ml、人转铁蛋白5ug/ml三种浓度为我们实验筛选确定，不同于以往其他作者用于造血细胞培养用的无血清培养基，也证明表皮细胞生长有其特殊的条件。氢化可的松加入十分必要，无此成份细胞生长增殖明显下降。表皮细胞生长因子10ng/ml、乙醇胺1×10-5mol/L、牛垂体提取物70ug/ml也是用正交试验确定其浓度，并且需三种联用才得到最佳培养效果。
3.将分离的表皮细胞用无血清培养基配制成浓度为1×10-6/ml，接种于用经多聚赖氨酸(0.1mg/ml)预处理塑料培养板或培养皿中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每3-5天更换新鲜培养基一次。
多聚赖氨酸(0.1mg/ml)预处理塑料培养板或培养皿方法：将0.1mg/ml多聚赖氨酸置于塑料培养板或培养皿，室湿静置30分钟，无菌超净台中吹干，用生理盐水洗一次，吸干生理盐水即可接种人表皮细胞。多聚赖氨酸有助于细胞贴壁生长。实验结果资料
1.本研制无血清与有血清(10％胎牛血清)培养比较(3H-TdR掺入法，原代人表皮细胞培养5天时)
表1.无血清与有血清培养对表皮细胞DNA合成的影响
组别 例数 CMP值 P无血清组(本研究) 27 933.33±233.23有血清组 27 896.21±255.23 ＞0.05MCDB153 18 712.67±157.73 ＜0.05
注：为无血清组与其他培养条件比较的P值
2.原代人表皮细胞在不同无血清培养基中生长的情况(MTT法，)分组 培养5天(OD值) 培养7天(OD值)无血清组(本研究) 0.638±0.092 0.928±0.123MCDB153 0.513±0.088 0.740±0.098
此两个实验说明本研制无血清用于原代人表皮细胞培养的效果与有血清培养相似，但就于国外已有的MCDB153无血清培养基。其原因可能是Boyce和Ham等在研制MCDB153培养基过程中一直使用传代表皮细胞，传代细胞是经过原代有血清培养后的表皮细胞，这些细胞己在体外己培养一段时间，能较好适应培养环境，而原代细胞更保持在体内时的生理状态，对培养环境要求更高。国外学者Pittelkow等的实验也证明：在MCDB153培养基中培养的表皮细胞生长到一定密度即出现生长阻抑现象。
氢化可的松在本无血清培养基中对表皮细舵DNA合成的影响组别 例数 CPM值 P值不含氢化可的松组 12 601.25±145.590.1ug/ml氢化可的松 12 632.23±152.23 ＞0.050.3ug/ml氢化可的 12 676.08±143.17 ＞0.05松 12 940.33±165.95 ＜0.050.5ug/ml氢化可的 12 789.12±149.51 ＜0.05松0.7ug/ml氢化可的松
说明加入氢化可的松可促进细胞生长增殖，其中以0.5ug/ml氢化可的松时为最好
聚赖氨酸(0.1mg/ml)预处理塑料培养板或培养皿可促进表皮细胞贴壁、集落形成和融合成片分组 - + ++ +++ 合计有血清组 2 3 12 7 24无血清组 6 8 7 3 24无血清+多聚赖 0 3 11 10 24氨酸
注：1.各组细胞培养5天后，采用显微镜下微标尺测定，测定结果用4度表示：(-)示无集落或无细胞融合片形成，(+)示最大表皮集落或细胞融合片面积直径≤2mm。(++)示最大表皮集落或细胞融合片面积直径2～4mm，(+++)示最大表皮集落或细胞融合片面积直径≥4mm。
2.表中示加入多聚赖氨酸能促进表皮细胞贴壁、集落形成和融合成片MCDB153购于美国Sigma公司
IMDM(Iscove’s Modufied Dulbeccos Medium)购于美国Gibco公司
实施例12将人表皮细胞无血清培养基应用于
1.烧伤创面治疗所需表皮片培养
2.疤痕创面整形美容
3.皮肤病药物筛选
4.化妆品有效成份的筛选及对表皮细胞有无毒性作用为确定
5.确定和筛选某些细胞因子对表皮细胞生长的影响
6.其他皮肤生理和皮肤病理学研究。
Claims (9)
1、一种人表皮细胞无血清培养基，包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，其特征在于：还包括0.01-10微克/毫升的氢化可的松。
2、根据权利要求1所述的一种人表皮细胞无血清培养基，其特征在于：包括80-120毫克/毫升牛血清白蛋白，7-12微克/毫升人转铁蛋白，60-100微克/毫升胰岛素，150-250微克/毫升胆固醇，150-250微克/毫升过氧化氢酶，其特征在于：还包括0.1-0.8微克/毫升的氢化可的松。
3、根据权利要求1所述的一种人表皮细胞无血清培养基，其特征在于：包括100毫克/毫升牛血清白蛋白，10微克/毫升人转铁蛋白，80微克/毫升胰岛素，200微克/毫升胆固醇，200微克/毫升过氧化氢酶，其特征在于：还包括0.4-0.5微克/毫升的氢化可的松。
4、根据权利要求1所述的一种人表皮细胞无血清培养基，其特征在于：牛血清白蛋白经去毒处理。
5、根据权利要求4所述的一种人表皮细胞无血清培养基，其特征在于：牛血清白蛋白经去毒处理的步骤：50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠5-10g混合搅拌均匀，置于4℃下2-4小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠5-10g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。
6、根据权利要求1、2、3、4、5所述的任意一种人表皮细胞无血清培养基，其特征在于：还加入5-15倍IMDM基础培养基，5-15微克/升表皮细胞生长因子，25-100毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺0.5-4×10-5mol/升。
7、根据权利要求1、2、3、4、5所述的任意一种人表皮细胞无血清培养基，其特征在于：还加入9-11倍IMDM基础培养基，9-10微克/升表皮细胞生长因子，40-70毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺1-2×10-5mol/升。
8、一种人表皮细胞无血清培养方法，其特征在于：按下列步骤进行：(1)取人皮肤，加胰蛋白酶处理，加入IMDM培养基配成单个细胞悬液；(2)无血清培养基配制：IMDM培养基加10％人表皮细胞无血清培养基；其中人表皮细胞无血清培养基包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，氢化可的松；(3)再补充表皮细胞生长因子，乙醇胺，牛垂体提取物，配制成人表皮细胞无血清培养基；(4)将分离的人表皮细胞用无血清培养基配制成浓度为0.5-4×10-6/毫升，接种于用经多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿中，置于细胞培养箱中培养，其中多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿方法：将0.1毫克/毫升多聚赖氨酸置于塑料培养板或培养皿，室湿静置30分钟，无菌超净台中吹干，用生理盐水洗一次；吸干生理盐水即可接种人表皮细胞。
9、根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述的任意一种人表皮细胞无血清培养基，应用于人表皮细胞生存生长培养。
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