CN114317399A - 一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方法 - Google Patents
一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方法，甲状腺类器官培养基包括Advanced DMEM/F12培养基和如下组分：B‑27、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R‑spondin1重组蛋白、头蛋白、Wnt‑3a、表皮细胞生长因子、A83‑01、促甲状腺激素、氢化可的松、胰岛素、成纤维细胞生长因子‑10以及Y27632。本发明甲状腺类器官培养基创新地添加了促甲状腺激素、氢化可的松和胰岛素，通过添加促甲状腺激素能够显著促进甲状腺类器官形成，通过添加氢化可的松能够有效促进细胞增殖生长效应,能提高克隆形成率，通过添加胰岛素能够维持细胞干性，提高传代效率，本发明的甲状腺类器官培养基能够很好地进行甲状腺类器官培养。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种甲状腺类器官培养基、甲状 腺类器官培养及传代方法。
背景技术
甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官。位于哺乳动物类的 颈部甲状软骨下方，气管两旁。甲状腺癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤，约占全 身恶性肿瘤的1％，包括乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌四种病理类 型。以恶性度较低、预后较好的乳头状癌最常见，除髓样癌外，绝大部分甲状 腺癌起源于滤泡上皮细胞。甲状腺癌的治疗方法主要取决于患者的年龄、肿瘤 的病理类型、病变的程度以及全身状况等，以手术为首选，术后辅以内分泌治 疗，必要时选用放、化疗在内的综合治疗方法。
类器官和3D培养系统正在成为重要的药物筛选模型以研究个性化医疗 和理解人体器官的发展。类器官是由多能干细胞或器官祖细胞分化，并自组装 成有结构和功能的完整哺乳动物器官。形成各种类器官往往需要培养基、基质、 生长因子和小分子化合物等等组分。目前国内外关于甲状腺类器官的研究报道 很少，尚未有人成功提出在体外长期稳定培养甲状腺类器官的模型，已有的培 养基和方法亦不能很好地培养得到甲状腺类器官。如何找到一种能够有效地培 养得到甲状腺类器官的培养基、高效的甲状腺类器官的培养及传代方法是目前 亟待解决的技术问题。
发明内容
为此，本发明提供一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方 法，以解决现有技术无法有效培养得到甲状腺类器官的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明的第一方面，本发明提供一种甲状腺类器官培养基，包括 AdvancedDMEM/F12培养基和如下组分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、 R-spondin1重组蛋白、头蛋白、Wnt-3a、表皮细胞生长因子、A83-01、促甲状 腺激素、氢化可的松、胰岛素、成纤维细胞生长因子-10以及Y27632。
进一步地，所述甲状腺类器官培养基还包括FGF7和/或SB202190。
进一步地，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为 2-3mM，所述烟酰胺的浓度为8-12mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为 150-250ng/mL，所述头蛋白的浓度为80-120ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为 20-40ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为40-60ng/mL，所述A83-01的 浓度为0.5-1.5mM，所述促甲状腺激素的浓度为10-20mIU/mL，所述氢化可的 松的浓度为3-7μg/mL，所述胰岛素的浓度为7-8μg/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为50-150ng/mL，所述Y27632的浓度为5-15μM。
进一步地，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为 2.5mM，所述烟酰胺的浓度为10mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为 200ng/mL，所述头蛋白的浓度为100ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为30ng/mL， 所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL，所述A83-01的浓度为1mM，所 述促甲状腺激素的浓度为15mIU/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度 为100ng/mL，所述Y27632的浓度为10μM，所述氢化可的松的浓度为 5μg/mL，所述胰岛素的浓度为7.5μg/mL。
进一步地，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为 2-3mM，所述烟酰胺的浓度为8-12mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为 150-250ng/mL，所述头蛋白的浓度为80-120ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为 20-40ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为40-60ng/mL，所述A83-01的 浓度为0.5-1.5mM，所述促甲状腺激素的浓度为10-20mIU/mL，所述氢化可的 松的浓度为3-7μg/mL，所述胰岛素的浓度为7-8μg/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为50-150ng/mL，所述Y27632的浓度为5-15μM，所述 FGF7的浓度为45-55ng/mL，所述SB202190的浓度为2.5-3.5uM。
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根据本发明的第二方面，本发明提供一种甲状腺类器官的培养方法，包括 如下步骤：
S1.将甲状腺组织用预冷的DPBS溶液洗净后剪碎至2-3mm大小的组织 块；
S2.将步骤S1得到的所述组织块用含有I型胶原酶和Dispase的Advanced DMEM/F12溶液，依次在37℃下水浴振荡消化30min分钟、用移液枪吹打10-20 次和静置，待未消化的所述组织块自然沉降，收集上清液于15mL BD管；在 所述Advanced DMEM/F12溶液中，所述I型胶原酶的浓度为100KU/L，所述 Dispase的浓度为2KU/L；
S3.以350g离心力离心步骤S2得到所述上清液5min，弃上清后加入 10mL细胞消化液TrypLE，并在37℃消化15min，得到甲状腺细胞悬液；
S4.进行台盼蓝计数，将步骤S3得到的所述甲状腺细胞悬液以6000个细 胞/30ul基质胶(Matrigel)的密度接种于48孔板中，并放入培养箱30分钟， 待Matrigel凝固，加入权利要求1-6任意一项所述甲状腺类器官培养基后在 37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每2-3天更换新的所述甲状腺类器官培 养基，培养9-14天得到甲状腺类器官。
根据本发明的第三方面，本发明提供一种甲状腺类器官传代的方法，包括 如下步骤：
T1.收集经权利要求7所述甲状腺类器官的培养方法培养得到的所述甲状 腺类器官，使用细胞消化液TrypLE在37℃对所述甲状腺类器官进行消化 15-30min，得到甲状腺细胞悬液；
T2.进行台盼蓝计数，将步骤T1得到的所述甲状腺细胞悬液以6000个细 胞/30ul基质胶(Matrigel)的密度接种于48孔板中，放入培养箱30分钟，待 Matrigel凝固后，加入权利要求1-6任意一项所述甲状腺类器官培养基并在 37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每2-3天更换新的所述甲状腺类器官培 养基，培养9-14天得到新的甲状腺类器官。
进一步地，步骤T1中所述甲状腺类器官的大小为200-400um。
本发明具有如下优点：
本发明甲状腺类器官培养基创新地添加了促甲状腺激素、氢化可的松和胰 岛素，通过添加促甲状腺激素能够显著促进甲状腺类器官形成，通过添加氢化 可的松能够有效促进细胞增殖生长效应,能提高克隆形成率，通过添加胰岛素 能够维持细胞干性，提高传代效率，本发明的甲状腺类器官培养基能够很好地 进行甲状腺类器官培养。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下 面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创 造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内 容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条 件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调 整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明 所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1a和图1b为本发明实施例1培养得到的甲状腺类器官的电镜照片；
图2为本发明实施例1培养得到的甲状腺类器官的HE切片图；
图3为本发明对比例1中第一组-第五组(D1-D5)甲状腺类器官培养基 培养得到的甲状腺类器官数量图；
图4为本发明对比例2培养基(D6)与对比例1中第四组培养基(D 4) 培养得到的甲状腺类器官数量图；
图5为本发明实施例1培养基传代培养得到甲状腺类器官中PO、Tg、NIS、 TSHR以及mRNA表达量图；
图6为本发明实施例1培养基传代培养的甲状腺类器官上清液中T3和T4 的浓度图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由 本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的 实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种甲状腺类器官培养基，包括 AdvancedDMEM/F12培养基和如下组分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、 R-spondin1重组蛋白、头蛋白、Wnt-3a、表皮细胞生长因子、A83-01、促甲状 腺激素、氢化可的松、胰岛素、成纤维细胞生长因子-10以及Y27632。
本发明甲状腺类器官培养基创新地添加了促甲状腺激素、氢化可的松和胰 岛素，通过添加促甲状腺激素能够显著促进甲状腺类器官形成，通过添加氢化 可的松能够有效促进细胞增殖生长效应,能提高克隆形成率，通过添加胰岛素 能够维持细胞干性，提高传代效率，本发明的甲状腺类器官培养基能够很好地 进行甲状腺类器官培养。
如上所述的甲状腺类器官培养基，所述甲状腺类器官培养基还包括FGF7 和/或SB202190。FGF7和SB202190是作为本发明甲状腺类器官培养基的可 选因子。
作为第一种实施方式：
如上所述的甲状腺类器官培养基，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N- 乙酰半胱氨酸的浓度为2-3mM，所述烟酰胺的浓度为8-12mM，所述R- spondin1重组蛋白的浓度为150-250ng/mL，所述头蛋白的浓度为80-120 ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为20-40ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为 40-60ng/mL，所述A83-01的浓度为0.5-1.5mM，所述促甲状腺激素的浓度 为10-20mIU/mL，所述氢化可的松的浓度为3-7μg/mL，所述胰岛素的浓度为 7-8μg/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为50-150ng/mL，所述 Y27632的浓度为5-15μM。在本实施方式中，各种组分的浓度在上述数值范 围内，多种组分之间能够很好地复配以构成甲状腺类器官培养基，且该甲状腺 类器官培养基能够很好地对甲状腺组织进行培养得到甲状腺类器官。
在该种实施方式的甲状腺类器官培养基中，各种组分的浓度可以优选为如 下：所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为2.5mM， 所述烟酰胺的浓度为10mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为200ng/mL， 所述头蛋白的浓度为100ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为30ng/mL，所述表皮 细胞生长因子的浓度为50ng/mL，所述A83-01的浓度为1mM，所述促甲状 腺激素的浓度为15mIU/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为100 ng/mL，所述Y27632的浓度为10μM，所述氢化可的松的浓度为5μg/mL， 所述胰岛素的浓度为7.5μg/mL。在这种优选的浓度下，甲状腺类器官培养 基能够更好地对甲状腺组织进行培养得到甲状腺类器官。
作为第二种实施方式：
如上所述的甲状腺类器官培养基，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N- 乙酰半胱氨酸的浓度为2-3mM，所述烟酰胺的浓度为8-12mM，所述R- spondin1重组蛋白的浓度为150-250ng/mL，所述头蛋白的浓度为80-120 ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为20-40ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为 40-60ng/mL，所述A83-01的浓度为0.5-1.5mM，所述促甲状腺激素的浓度 为10-20mIU/mL，所述氢化可的松的浓度为3-7μg/mL，所述胰岛素的浓度为 7-8μg/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为50-150ng/mL，所述 Y27632的浓度为5-15μM，所述FGF7的浓度为45-55ng/mL，所述SB202190 的浓度为2.5-3.5uM。与上述实施方式的甲状腺类器官培养基所不同的是，本 实施方式的甲状腺类器官培养基中同时含有FGF7和SB202190，这样甲状腺 类器官培养基所含的组分更加完善，甲状腺类器官培养基能够更好地对甲状腺 组织进行培养得到甲状腺类器官。
在该种实施方式的甲状腺类器官培养基中，各种组分的浓度可以优选为如 下：所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为2.5mM， 所述烟酰胺的浓度为10mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为200ng/mL， 所述头蛋白的浓度为100ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为30ng/mL，所述表皮 细胞生长因子的浓度为50ng/mL，所述A83-01的浓度为1mM，所述促甲状 腺激素的浓度为15mIU/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为100 ng/mL，所述Y27632的浓度为10μM，所述氢化可的松的浓度为5μg/mL， 所述胰岛素的浓度为7.5μg/mL，所述FGF7的浓度为50ng/mL，所述 SB202190的浓度为3uM。在这种优选的浓度下，甲状腺类器官培养基能够更 好地对甲状腺组织进行培养得到甲状腺类器官。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种甲状腺类器官的培养方法，包括 如下步骤：
S1.将甲状腺组织用预冷的DPBS溶液洗净后剪碎至2-3mm大小的组织 块；
S2.将步骤S1得到的所述组织块用含有I型胶原酶和Dispase的Advanced DMEM/F12溶液，依次在37℃下水浴振荡消化30min分钟、用移液枪吹打10-20 次和静置，待未消化的所述组织块自然沉降，收集上清液于15mL BD管；在 所述Advanced DMEM/F12溶液中，所述I型胶原酶的浓度为100KU/L，所述 Dispase的浓度为2KU/L；
S3.以350g离心力离心步骤S2得到所述上清液5min，弃上清后加入 10mL细胞消化液TrypLE，并在37℃消化15min，得到甲状腺细胞悬液；
S4.进行台盼蓝计数，将步骤S3得到的所述甲状腺细胞悬液以6000个细 胞/30ul基质胶(Matrigel)的密度接种于48孔板中，并放入培养箱30分钟， 待Matrigel凝固，加入上述甲状腺类器官培养基后在37℃、5％CO2的细胞 培养箱中培养，每2-3天更换新的所述甲状腺类器官培养基，培养9-14天得 到甲状腺类器官。
通过上述实施方式中的甲状腺类器官培养基，并按照本发明上述的甲状腺 类器官的培养方法对甲状腺组织进行培养，能够成功且高效地培养得到甲状腺 类器官。
根据本发明的第三方面，本发明提供一种甲状腺类器官传代的方法，包括 如下步骤：
T1.收集经上述甲状腺类器官的培养方法培养得到的所述甲状腺类器官， 使用细胞消化液TrypLE在37℃对所述甲状腺类器官进行消化15-30min，得 到甲状腺细胞悬液；
T2.进行台盼蓝计数，将步骤T1得到的所述甲状腺细胞悬液以6000个细 胞/30ul基质胶(Matrigel)的密度接种于48孔板中，放入培养箱30分钟，待 Matrigel凝固后，加入上述甲状腺类器官培养基并在37℃、5％CO2的细胞 培养箱中培养，每2-3天更换新的所述甲状腺类器官培养基，培养9-14天得 到新的甲状腺类器官。
本发明的甲状腺类器官传代的方法是基于本发明上述的甲状腺类器官培 养基、以及甲状腺类器官培养方法的传代的方法，通过本发明的甲状腺类器官 培养基以及传代培养方法，甲状腺类器官可以传代多次，且即使是传代多次后 得到的甲状腺类器官培养基仍然能够很好地保留甲状腺的基本功能。
进一步地，步骤T1中所述甲状腺类器官的大小为200-400um。选择培养 后得到的200-400um的甲状腺类器官进行传代培养，能够有更好的传代培养 效果，获得更多的传代次数。
以下通过实施例对本发明进行说明。
实施例1
本实施例提供一种甲状腺类器官培养基，包括Advanced DMEM/F12培养 基和如下组分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin1重组蛋白、头 蛋白、Wnt-3a、表皮细胞生长因子、A83-01、促甲状腺激素、氢化可的松、胰 岛素、成纤维细胞生长因子-10、Y27632、FGF7以及SB202190。
在本实施例的甲状腺类器官培养基中，所述B-27的浓度为A(1x)，所述 N-乙酰半胱氨酸的浓度为2.5mM，所述烟酰胺的浓度为10mM，所述R- spondin1重组蛋白的浓度为200ng/mL，所述头蛋白的浓度为100ng/mL，所 述Wnt-3a的浓度为30ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL，所 述A83-01的浓度为1mM，所述促甲状腺激素的浓度为15mIU/mL，所述成 纤维细胞生长因子-10的浓度为100ng/mL，所述Y27632的浓度为10μM， 所述氢化可的松的浓度为5μg/mL，所述胰岛素的浓度为7.5μg/mL，所述 FGF7的浓度为50ng/mL，所述SB202190的浓度为3uM，余量为Advanced DMEM/F12培养基。
通过本实施例的甲状腺类器官培养基并按照如下方法进行甲状腺类器官 的培养：
将新鲜来源为手术切除标本或穿刺标本的甲状腺组织，用预冷的DPBS溶 液洗净，剪碎至2-3mm大小的组织块，用含有I型胶原酶(100KU/L)和Dispase (2KU/L)的AdvancedDMEM/F12溶液，37℃水浴振荡消化30min分钟后， 用移液枪吹打10-20次，静置，待未消化的组织块自然沉降，收集上清液于15mL BD管，350g离心力下离心5min，弃上清，加入10mL细胞消化液TrypLE， 37℃消化15min，得到甲状腺细胞悬液，进行台盼蓝计数，以6000个细胞/30ul 基质胶Matrigel的密度接种于48孔板中，放入培养箱30分钟，待Matrigel凝 固，加入本实施例上述的甲状腺类器官培养基在37℃、5％CO2的细胞培养箱 中培养，每2-3天更换新的本实施例上述的甲状腺类器官培养基，培养9-14 天得到甲状腺类器官。对本实施例培养得到的甲状腺类器官进行电镜分析，得 到的电镜照片见图1a和图1b，本实施例培养得到的甲状腺类器官的HE切片 图见图2。通过图1a、图1b和图2可以看出，通过本实施例的甲状腺类器官 培养基和方法能够很好地培养得到甲状腺类器官。
对比例1
本对比例提供以下五组(D1-D5)甲状腺类器官培养基，每组甲状腺类器 官培养基均包括如下组分：Advanced DMEM/F12培养基、B-27、N-乙酰半胱 氨酸、烟酰胺、R-spondin1重组蛋白、头蛋白、Wnt-3a、表皮细胞生长因子、 A83-01、促甲状腺激素(D1中浓度为0)、成纤维细胞生长因子-10、Y27632、 FGF7以及SB202190；所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸 的浓度为2.5mM，所述烟酰胺的浓度为10mM，所述R-spondin1重组蛋白 的浓度为200ng/mL，所述头蛋白的浓度为100ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为 30ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL，所述A83-01的浓度 为1mM，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为100ng/mL，所述Y27632的 浓度为10μM，所述FGF7的浓度为50ng/mL，所述SB202190的浓度为3 uM。第一组-第五组(D1-D5)甲状腺类器官培养基中促甲状腺激素的含量见 表1(余量为Advanced DMEM/F12培养基)：
表1：
分别采用本对比例中第一组-第五组(D1-D5)甲状腺类器官培养基并按 照实施例1的方法进行甲状腺类器官的培养，培养9-14天后统计甲状腺类器 官的数量，采用第一组-第五组(D1-D5)甲状腺类器官培养基进行培养得到的 甲状腺类器官的数量见图3。
通过对比例1的检测结果(图3)可以看出，促甲状腺激素对甲状腺类器 官的形成有明显的促进作用，甲状腺激素在浓度为15mIU/mL时可达到较好 的状态。
对比例2
本对比例培养基(D6)与对比例1中第四组培养基(D 4)所含有的其它 组分及浓度均相同，唯一不同之处在于本对比例培养基(D6)中添加了氢化 可的松，且所添加的氢化可的松的浓度为5μg/mL。
分别采用本对比例培养基(D6)与对比例1中第四组培养基(D 4)并按 照实施例1的方法进行甲状腺类器官的培养，培养9-14天后统计甲状腺类器 官的数量，见图4。
通过本对比例培养基(D6)与对比例1中第四组培养基(D 4)的培养结 果可以看出，氢化可的松有促细胞增殖生长的效应，能提高甲状腺类器官形成 率。
测试实施例1
进行甲状腺类器官传代培养：(实施例1培养基与对比例2培养基(D6) 仅有区别在于：实施例1培养基比对比例2培养基(D6)多添加有7.5μg/mL 浓度的胰岛素)
分别采用实施例1培养基与对比例2培养基(D6)并按照实施例1的方 法对9例(病例1-病例9)手术切除标本或穿刺标本的甲状腺组织进行甲状腺 类器官的培养，每个病例分别取两组手术切除标本或穿刺标本的甲状腺组织以 分别采用实施例1培养基与对比例2培养基(D6)进行培养，分别收集已经 培养9-14天，大小为200-400um甲状腺类器官，使用细胞消化液TrypLE进 行消化，37℃消化15-30min，得到甲状腺细胞悬液，进行台盼蓝计数，以6000 个细胞/30ul基质胶Matrigel的密度接种于48孔板中，放入培养箱30分钟， 待Matrigel凝固，加入甲状腺类器官培养基在37℃、5％CO2的细胞培养箱 中培养，每2-3天更换新的甲状腺类器官培养基，培养9-14天得到新的甲状 腺类器官。病例1-9中，每个病例分别采用实施例1培养基与对比例2培养基 (D6)培养的人源类器官的培养传代次数见表2。通过表2的结果可以看出， 通过在培养基中添加胰岛素能够显著提高传代次数。
表2
测试实施例2
以实施例1的甲状腺类器官培养基，并按照实施例1的方法进行甲状腺类器 官的培养，然后按照测试实施例1的方法进行甲状腺类器官传代培养，以肝脏 组织为对比，GAPDH为内参对照基因，利用RT-PCR法检测不同传代次数的甲 状腺类器官中甲状腺细胞特异性表达甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋 白(Tg)、钠碘同向转运体(NIS)、促甲状腺激素受体(TSHR)以及mRNA的 表达量，检测结果见图5。通过图5可以看出按照实施例1的方法进行甲状腺类 器官的培养后，第一代和第四代的甲状腺类器官中TPO、Tg、NIS、TSHR以及mRNA能够保持很好的表达量，说明培养得到甲状腺类器官保持很好的活 性。
测试实施例3
以实施例1的甲状腺类器官培养基，并按照实施例1的方法进行甲状腺类器 官的培养，然后按照测试实施例1的方法进行甲状腺类器官传代培养，采用 ECLIA方法检测在甲状腺类器官培养上清中检测T3和T4的分泌情况，检测结 果见图6。通过图6的检测结果可以看出，本测试实施例培养的甲状腺类器官保 留了甲状腺的基本功能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种甲状腺类器官培养基，其特征在于，包括Advanced DMEM/F12培养基和如下组分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin1重组蛋白、头蛋白、Wnt-3a、表皮细胞生长因子、A83-01、促甲状腺激素、氢化可的松、胰岛素、成纤维细胞生长因子-10以及Y27632。
2.根据权利要求1所述的甲状腺类器官培养基，其特征在于，所述甲状腺类器官培养基还包括FGF7和/或SB202190。
3.根据权利要求1所述的甲状腺类器官培养基，其特征在于，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为2-3mM，所述烟酰胺的浓度为8-12mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为150-250ng/mL，所述头蛋白的浓度为80-120ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为20-40ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为40-60ng/mL，所述A83-01的浓度为0.5-1.5mM，所述促甲状腺激素的浓度为10-20mIU/mL，所述氢化可的松的浓度为3-7μg/mL，所述胰岛素的浓度为7-8μg/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为50-150ng/mL，所述Y27632的浓度为5-15μM。
4.根据权利要求3所述的甲状腺类器官培养基，其特征在于，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为2.5mM，所述烟酰胺的浓度为10mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为200ng/mL，所述头蛋白的浓度为100ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为30ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL，所述A83-01的浓度为1mM，所述促甲状腺激素的浓度为15mIU/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为100ng/mL，所述Y27632的浓度为10μM，所述氢化可的松的浓度为5μg/mL，所述胰岛素的浓度为7.5μg/mL。
5.根据权利要求2所述的甲状腺类器官培养基，其特征在于，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为2-3mM，所述烟酰胺的浓度为8-12mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为150-250ng/mL，所述头蛋白的浓度为80-120ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为20-40ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为40-60ng/mL，所述A83-01的浓度为0.5-1.5mM，所述促甲状腺激素的浓度为10-20mIU/mL，所述氢化可的松的浓度为3-7μg/mL，所述胰岛素的浓度为7-8μg/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为50-150ng/mL，所述Y27632的浓度为5-15μM，所述FGF7的浓度为45-55ng/mL，所述SB202190的浓度为2.5-3.5uM。
6.根据权利要求5所述的甲状腺类器官培养基，其特征在于，所述B-27的浓度为A(1x)，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为2.5mM，所述烟酰胺的浓度为10mM，所述R-spondin1重组蛋白的浓度为200ng/mL，所述头蛋白的浓度为100ng/mL，所述Wnt-3a的浓度为30ng/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL，所述A83-01的浓度为1mM，所述促甲状腺激素的浓度为15mIU/mL，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为100ng/mL，所述Y27632的浓度为10μM，所述氢化可的松的浓度为5μg/mL，所述胰岛素的浓度为7.5μg/mL，所述FGF7的浓度为50ng/mL，所述SB202190的浓度为3uM。
7.一种甲状腺类器官的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将甲状腺组织用预冷的DPBS溶液洗净后剪碎至2-3mm大小的组织块；
S2.将步骤S1得到的所述组织块用含有I型胶原酶和Dispase的Advanced DMEM/F12溶液，依次在37℃下水浴振荡消化30min分钟、用移液枪吹打10-20次和静置，待未消化的所述组织块自然沉降，收集上清液于15mL BD管；在所述Advanced DMEM/F12溶液中，所述I型胶原酶的浓度为100KU/L，所述Dispase的浓度为2KU/L；
S3.以350g离心力离心步骤S2得到所述上清液5min，弃上清后加入10mL细胞消化液TrypLE，并在37℃消化15min，得到甲状腺细胞悬液；
S4.进行台盼蓝计数，将步骤S3得到的所述甲状腺细胞悬液以6000个细胞/30ul基质胶的密度接种于48孔板中，并放入培养箱30分钟，待基质胶凝固，加入权利要求1-6任意一项所述甲状腺类器官培养基后在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每2-3天更换新的所述甲状腺类器官培养基，培养9-14天得到甲状腺类器官。
8.一种甲状腺类器官传代的方法，其特征在于，包括如下步骤：
T1.收集经权利要求7所述甲状腺类器官的培养方法培养得到的所述甲状腺类器官，使用细胞消化液TrypLE在37℃对所述甲状腺类器官进行消化15-30min，得到甲状腺细胞悬液；
T2.进行台盼蓝计数，将步骤T1得到的所述甲状腺细胞悬液以6000个细胞/30ul基质胶的密度接种于48孔板中，放入培养箱30分钟，待基质胶凝固后，加入权利要求1-6任意一项所述甲状腺类器官培养基并在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每2-3天更换新的所述甲状腺类器官培养基，培养9-14天得到新的甲状腺类器官。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤T1中所述甲状腺类器官的大小为200-400um。
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