CN114891748A - 一种甲状腺癌类器官的培养基及甲状腺癌类器官的培养方法 - Google Patents

一种甲状腺癌类器官的培养基及甲状腺癌类器官的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种甲状腺癌类器官的培养基及甲状腺癌类器官的培养方法。该甲状腺癌类器官的培养基包括Advanced DMEM/F12基础培养基、L‑谷氨酰胺、烟酰胺、A83‑01、N‑乙酰半胱氨酸、B27、Wnt 3A、R‑Spondin‑1重组蛋白、Noggin蛋白、成纤维细胞生长因子、促甲状腺素；还包括N‑阿魏酰章鱼胺、B‑细胞素和Cyclic Pifithrin‑α。该培养基中的N‑阿魏酰章鱼胺、B‑细胞素以及Cyclic Pifithrin‑α能够显著的提高细胞生长和增殖效率，有效提高细胞数和活率。另外，N‑阿魏酰章鱼胺与B‑细胞素具有显著的协同作用。该方法具有培养周期短、增殖速度快和细胞活率高的优点。

Description

一种甲状腺癌类器官的培养基及甲状腺癌类器官的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种甲状腺癌类器官的培养基及甲状腺癌类器官的培养方法。
背景技术
甲状腺癌是世界上最常见的内分泌恶性肿瘤之一。虽然大多数甲状腺癌患者预后良好，但仍有一部分患者死亡，特别是当疾病复发时。由于缺乏能够真实反映母体肿瘤生物学特性的体外模型，迫切需要临床相关的甲状腺癌临床前模型来进行个性化治疗。
为了了解甲状腺癌，尤其是肿瘤的异质性，并将这一知识转化为临床应用，迫切需要有代表性和稳健的临床前甲状腺癌模型。历史上，最普遍的临床前模型是小鼠模型和在二维培养中培养的患者来源的细胞系。然而，这两种模型存在许多缺陷，阻碍了其临床应用。癌症细胞系无法体现肿瘤的异质性,因此它们从根本上无法代表癌症的复杂性；而小鼠模型虽然可以保持遗传和原始肿瘤的组织学特点，但是小鼠模型成功率低，周期长；这使得在很大程度上几乎不可能对个性化治疗做出贡献。
类器官是细胞的三维组装体，包含一种以上的细胞类型，能够至少表现出细胞所述器官的生理特性。由于其保持了亲本肿瘤的关键特征，可以利用类器官进行药物筛选、预测患者放化疗反应等。
由于类器官是通过特定的培养基在体外培养而得到的，不同的癌细胞所需的培养基成分完全不同。现有技术中，针对甲状腺癌类器官的培养基较少，培养效果较差。例如申请号为CN202110951313的专利“一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方法”中使用的含有SB202190的培养基，培养周期较长、细胞数量少，样本活性偏差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种甲状腺癌类器官的培养基及甲状腺癌类器官的培养方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种甲状腺癌类器官的培养基，包括Advanced DMEM/F12基础培养基、L-谷氨酰胺、烟酰胺、A83-01、N-乙酰半胱氨酸、B27、Wnt 3A、R-Spondin-1重组蛋白、Noggin蛋白、成纤维细胞生长因子、促甲状腺素；还包括N-阿魏酰章鱼胺、B-细胞素和CyclicPifithrin-α。
进一步，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7和FGF-10。
进一步，所述L-谷氨酰胺的浓度为1×，所述烟酰胺的浓度为10mM，所述A83-01的浓度为0.5 μM，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM，所述B27的浓度为0.5×，所述Wnt 3A的浓度为100-300ng/mL，所述R-Spondin-1重组蛋白的浓度为250ng/mL，所述Noggin蛋白的浓度为100-200ng/mL、所述促甲状腺素的浓度为10m IU/mL、所述FGF-7的浓度为25-100ng/mL，所述FGF-10的浓度为10 -15ng/mL；
所述N-阿魏酰章鱼胺的浓度为3-10μM，所述B-细胞素的浓度为30-60ng/mL，所述Cyclic Pifithrin-α的浓度为2-6μM。
进一步，所述Wnt 3A的浓度为100ng/mL，所述Noggin蛋白的浓度为100ng/mL、所述FGF-7的浓度为50ng/mL，所述FGF-10的浓度为10ng/mL；
所述N-阿魏酰章鱼胺的浓度为10μM，所述B-细胞素的浓度为50ng/mL，所述CyclicPifithrin-α的浓度为4μM。
进一步，还包括pH缓冲液，所述pH缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
进一步，还包括抗菌成分，所述抗菌成分为青霉素或链霉素。
本发明还提供一种甲状腺癌类器官的培养方法，采用上述的培养基进行培养。
进一步，包括以下步骤：
S1、获取待培养的甲状腺组织样本；
S2、将所述甲状腺组织样本放置在容器中，并使用DPBS-PS对所述甲状腺组织样本反复清洗，直至清洗液澄清；
S3、除去所述容器中残留的DPBS-PS，对所述甲状腺组织样本进行消化、重悬，得到甲状腺细胞沉淀；
S4、将所述甲状腺癌类器官培养基与步骤S3得到的所述甲状腺细胞沉淀混合并得到细胞溶液，再将所述细胞溶液与基质胶以质量比为1:2的比例进行混合；混合后，进行滴胶接种，每个胶滴为50μL，并且每个胶滴中的细胞量大于或等于2万个；接种完成后，在37℃下静置直至胶滴全凝固；
S5、另取所述甲状腺癌类器官培养基并在37℃下预热，在每个所述胶滴上加入500μL预热后的所述甲状腺癌类器官培养基，并使用DPBS-PS进行封边处理；
S6、每2~4天在每个所述胶滴添加一次所述甲状腺癌类器官培养基，培养5天后得到所述甲状腺癌类器官。
进一步，所述步骤S3的具体步骤为：
S3-1、除去所述容器中残留的DPBS-PS后，向所述容器中加入少量第一消化液；
S3-2、将所述甲状腺组织样本剪切为大小均一的组织块；继续向所述容器中添加2-4mL的所述第一消化液1，并在5%的CO2、37℃的摇床中进行第一次消化；
所述第一次消化的时间为1h，之后，加入8 mL DPBS-PS终止消化，离心并弃上清液；
S3-3、向所述容器中添加2mL第二消化液，并在5%的CO2、37℃的摇床中进行第二次消化；
所述第二次消化的时间为20min，之后，加入4 mL DPBS-PS终止消化，再次离心并弃上清液，保留细胞沉淀；
S3-4、向所述容器中添加2 mL DPBS-PS对所述细胞沉淀进行重悬，依次过100μM的细胞筛网、离心、弃上清液，得到所述甲状腺细胞。
进一步，步骤S3中，当消化和重悬后得到的细胞沉淀呈红色，在进行步骤S4前，先向所述容器中加入1~2 mL红细胞裂解液；再使用移液枪上下吹打，并在冰上孵育10min；孵育结束后离心，弃上清液后得到的细胞沉淀为所述甲状腺细胞。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明的甲状腺癌类器官的培养基，其成分中含有N-阿魏酰章鱼胺，具有抗氧化作用和p38α信号抑制功能，能够提高长期培养活力；
（2）本发明的甲状腺癌类器官的培养基，其成分中含有B-细胞素，能够结合并激活表皮生长因子受体ErbB1和ErbB4同源二聚体，启动其下游信号通路，促进细胞增殖，生长，自组装；
（3）本发明的甲状腺癌类器官的培养基，其成分中含有N-阿魏酰章鱼胺和B-细胞素具有协同作用；
（4）本发明的甲状腺癌类器官的培养基，其成分中含有Cyclic Pifithrin-α，不但P53信号抑制作用可以被持续延长，而且能够维持TRIP13蛋白在甲状腺癌中表达，从而提高甲状腺癌类器官的增殖、侵袭迁移、以及抗凋亡能力；
（5）本发明的甲状腺癌类器官的培养基，N-阿魏酰章鱼胺与B-细胞素具有显著的协同作用；
（6）本发明的甲状腺癌类器官的培养方法，采用本发明的培养基进行培养，具有培养周期短、增殖快、细胞数和活率高的优点。
附图说明
图1为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，实施例1的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图2为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，实施例2的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图3为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，实施例3的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图4为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，实施例4的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图5为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，实施例5的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图6为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，对比例1的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图7为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，对比例2的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图8为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，对比例3的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍；
图9为本发明的甲状腺癌类器官的培养基，对比例4的甲状腺癌类器官培养五天的培养图；其中，a的放大倍数为4倍，b的放大倍数为10倍。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的甲状腺癌类器官的培养基，包括Advanced DMEM/F12基础培养基、L-谷氨酰胺（GlutaMax）、烟酰胺（Nicotinamide）、A83-01、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine）、B27、Wnt 3A、R-Spondin-1重组蛋白、Noggin蛋白；还包括N-阿魏酰章鱼胺（N-FERULOYLOCTOPAMINE）、B-细胞素（BETACELLULIN）和Cyclic Pifithrin-α。
本发明的甲状腺癌类器官的培养基，其中含有N-FERULOYLOCTOPAMINE、BETACELLULIN两种因子。通过实验验证，这两种因子对甲状腺癌类器官生长尤为重要,其中N-FERULOYLOCTOPAMINE具有抗氧化作用和p38α信号抑制功能，能够提高长期培养活力；BETACELLULIN能够结合并激活表皮生长因子受体ErbB1和ErbB4同源二聚体，启动其下游信号通路，促进细胞增殖，生长，自组装。这些功能对于甲状腺癌类器官的增殖和自组装非常关键。另外，通过实验验证，N-FERULOYLOCTOPAMINE和BETACELLULIN还具有协同作用，BETACELLULIN和同样为P38 MAPK通路抑制剂的SB 202190因子，共同作用时，效果不佳。
本发明的甲状腺癌类器官的培养基中还包括。由于Cyclic Pifithrin-α的化学结构是环化的Pifithrin-α，不但P53信号抑制作用可以被持续延长，而且能够维持TRIP13蛋白在甲状腺癌中表达，从而提高甲状腺癌类器官的增殖、侵袭迁移、以及抗凋亡能力。
在本发明的甲状腺癌类器官的培养基中，L-谷氨酰胺、Nicotinamide、A83-01、N-Acetylcysteine、B27为基础养分；其中，L-谷氨酰胺是细胞培养的通用添加剂，Nicotinamide可以提高提高细胞活力，N-Acetylcysteine为抗氧化剂，B27为血清替代物。
在本发明的甲状腺癌类器官的培养基中，Wnt 3A、R-Spondin-1、Noggin为信号通路因子；其中，Wnt 3A为Wnt信号通路因子，R-Spondin-1为调控wnt/β-catenin信号通路的因子，Noggin为抑制BMP信号通路的因子。
优选的，L-谷氨酰胺的浓度为1×，烟酰胺的浓度为10mM，A83-01的浓度为0.5 μM，N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM，B27的浓度为0.5×，Wnt 3A的浓度为100-300ng/mL，R-Spondin-1重组蛋白的浓度为250ng/mL，Noggin蛋白的浓度为100-200ng/mL；N-阿魏酰章鱼胺的浓度为3-10μM，B-细胞素的浓度为30-60ng/mL，Cyclic Pifithrin-α的浓度为2-6μM。
进一步优选的，Wnt 3A的浓度为100ng/mL，Noggin蛋白的浓度为100ng/mL；N-阿魏酰章鱼胺的浓度为10μM，B-细胞素的浓度为50ng/mL，Cyclic Pifithrin-α的浓度为4μM。
优选的，甲状腺癌类器官的培养基中还包括FGF-7、FGF-10因子和促甲状腺素；FGF-7的浓度为25-100 ng/mL，FGF-10的浓度为10 -15ng/mL，促甲状腺素的浓度为10m IU/mL。
FGF-7和FGF-10均属于FGF家族，上述三种成分均能够促进上皮细胞增殖。
优选的，甲状腺癌类器官的培养基中还包括pH缓冲液、抗菌成分，进一步确保该培养基能够有利于对甲状腺癌类器官进行培养。
进一步优选的，pH缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），其浓度为1×，一般是10mM。
进一步优选的，抗菌成分为青链霉素双抗溶液（Penicillin-Streptomycin）；青链霉素双抗溶液的浓度为100 IU/mL。
本发明的甲状腺癌类器官的培养方法，采用上述的培养基进行培养。包括以下步骤：
S1、获取待培养的甲状腺组织样本。
优选的，具体操作步骤为，将待培养的样本转移到一个3.5 cm或10 cm培养皿中，尽量清除脂肪组织和正常组织，仅保留病灶，该病灶即为甲状腺组织样本。
S2、将甲状腺组织样本放置在15mL离心管中，并使用DPBS-PS对甲状腺组织样本反复清洗，直至清洗液澄清；一般清洗5~10次。
S3、除去离心管中残留的DPBS-PS，对甲状腺组织样本进行消化、重悬，得到甲状腺细胞沉淀。
优选的，具体操作步骤为：
S3-1、除去离心管中残留的DPBS-PS后，向离心管中加入少量消化液I。先加入少量的消化液I的目的是对甲状腺组织样本进行浸润，便于剪切。
S3-2、将甲状腺组织样本剪切为1 mm3大小的均一组织块；继续向离心管中添加2-4mL的第一消化液，并在5%的CO2、37℃的摇床中进行第一次消化。
第一次消化的时间为1h，之后，加入8 mL DPBS-PS终止消化，1500 rpm离心5 min，并弃上清液。
S3-3、向离心管中添加2mL消化液II，并在5%的CO2、37℃的摇床中进行第二次消化。
第二次消化的时间为20min，之后，加入4 mL DPBS-PS终止消化，1500 rpm离心5min，并弃上清液，保留细胞沉淀。
S3-4、向离心管中添加2 mL DPBS-PS对细胞沉淀进行重悬，依次过100μM的细胞筛网、1500 rpm离心5 min、弃上清液，得到甲状腺细胞沉淀。
上述消化过程采用的消化液Ⅰ的主要成分是胶原酶，消化液Ⅱ主要是DNA酶、分散酶。
S4、将甲状腺癌类器官培养基与步骤S3得到的甲状腺细胞沉淀混合并得到细胞溶液，再将细胞溶液与基质胶以质量比为1:2的比例进行混合；混合后，在孔板上进行滴胶接种，每个胶滴为50μL，并且每个胶滴中的细胞量大于或等于2万个；接种完成后，在37℃下静置直至胶滴全凝固。其中，基质胶为MAtrigel胶。
S5、另取甲状腺癌类器官培养基并在37℃下预热，在孔板上的每个胶滴上加入500μL预热后的甲状腺癌类器官培养基，并使用DPBS-PS进行封边处理。
S6、每2~4天在每个胶滴添加一次甲状腺癌类器官培养基，每次的添加量为500μL。培养5天后得到甲状腺癌类器官。
得到的甲状腺癌类器官可在培养7-14天进行传代。
优选的，步骤S3中，当消化和重悬后得到的细胞沉淀呈红色，在进行步骤S4前，先向离心管中加入1~2 mL红细胞裂解液；再使用1mL的移液枪枪头上下吹打若干次，并在冰上孵育10min；孵育结束后，1500 rpm离心5 min，弃上清液后得到的细胞沉淀为所述甲状腺细胞。
进一步优选的，消化和重悬后得到的细胞沉淀体积小于100 μL时，使用1 mL红细胞裂解液，消化和重悬后得到的细胞沉淀大于100 μL，需使用2 mL红细胞裂解液。
以下通过具体的实施例和对比例对本发明的效果进行具体说明：
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例采用的甲状腺癌组织均来自志愿者自愿捐赠。
实施例1
本实施例采用的甲状腺癌类器官的培养基的具体成分如表1所示：
表1
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal medium
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE 4μM
N-Acetylcysteine 1.25mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 200ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 150 ng/mL
FGF-7 25ng/mL
FGF-10 10ng/mL
BETACELLULIN 30 ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10 IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 2μM
采用本发明的培养方法和上述培养基对甲状腺癌类器官的培养方法，对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。在7-14天传代后，观察培养情况，培养情况如图1所示。
实施例2
本实施例采用的甲状腺癌类器官的培养基的具体成分如表2所示：
表2
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE 5μM
N-Acetylcysteine 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 100ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 100ng/mL
FGF-7 50ng/mL
FGF-10 10ng/mL
BETACELLULIN 50 ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 4μM
采用本发明的培养方法和上述培养基对甲状腺癌类器官的培养方法，对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。在7-14天传代后，观察培养情况，培养情况如图2所示。
实施例3
本实施例采用的甲状腺癌类器官的培养基的具体成分如表3所示：
表3
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE 8μM
N-Acetylcysteine 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 150ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 180 ng/mL
FGF-7 80 ng/mL
FGF-10 12ng/mL
BETACELLULIN 40ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 5μM
采用本发明的培养方法和上述培养基对甲状腺癌类器官的培养方法，对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。在7-14天传代后，观察培养情况，培养情况如图3所示。
实施例4
本实施例采用的甲状腺癌类器官的培养基的具体成分如表4所示：
表4
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE 10μM
N-Acetylcysteine 1.25mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 100ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 100ng/mL
FGF-7 50ng/mL
FGF-10 10ng/mL
BETACELLULIN 50 ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 4μM
采用本发明的培养方法和上述培养基对甲状腺癌类器官的培养方法，对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。在7-14天传代后，观察培养情况，培养情况如图4所示。
实施例5
本实施例采用的甲状腺癌类器官的培养基的具体成分如表5所示：
表5
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE 10μM
N-Acetylcysteine 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 300ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 200 ng/mL
FGF-7 100 ng/mL
FGF-10 15ng/mL
BETACELLULIN 60ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 6μM
采用本发明的培养方法和上述培养基对甲状腺癌类器官的培养方法，对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。在7-14天传代后，观察培养情况，培养情况如图5所示。
对比例1
本对比例提供两种甲状腺癌类器官的培养基对比，一种为实施例4所用培养基，一种为减去N-FERULOYLOCTOPAMINE成分培养基，具体浓度及成分如表6所示：
表6
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE /
N-Acetylcysteine 1.25mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 100ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 100ng/mL
FGF-7 50ng/mL
FGF-10 10ng/mL
BETACELLULIN 50 ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 4μM
采用本发明的培养方法和上述两种培养基分别对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。7-14天进行传代，观察培养情况，培养情况如图6所示。
在培养第5天时，加入3mLTrypLE Express（Life Technologies，12605-010）消化酶，将两种培养基培养的甲状腺癌类器官进行消化5min,加入5mL DPBS（BiologicalIndustries，02-023-1ACS）终止消化，1200rbm,3min离心，用1mL类器官培养基重悬，细胞计数仪进行计数。计数结果如表11所示。
通过表11中的细胞数和活率可以看出，减N-FERULOYLOCTOPAMINE成分的培养基对甲状腺癌类器官增值以及活率影响很大。
对比例2
本对比例提供两种甲状腺癌类器官的培养基对比，一种为实施例4所用培养基，一种为减去BETACELLULIN成分培养基，具体浓度及成分见表7：
表7
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE 10μM
N-Acetylcysteine 1.25mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 100ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 100ng/mL
FGF-7 50ng/mL
FGF-10 10ng/mL
BETACELLULIN /
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 4μM
采用本发明的培养方法和上述两种培养基分别对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。7-14天进行传代，观察培养情况，培养情况如图7所示。
在培养第5天时，加入3mLTrypLE Express（Life Technologies，12605-010）消化酶，将两种培养基培养的甲状腺癌类器官进行消化5min,加入5mL DPBS（BiologicalIndustries，02-023-1ACS）终止消化，1200rbm,3min离心，用1mL类器官培养基重悬，细胞计数仪进行计数。计数结果如表11所示。
通过上表中的细胞数和活率可以看出，减 BETACELLULIN成分的培养基对甲状腺癌类器官增殖和自组装影响很大。
对比例3
本对比例提供两种甲状腺癌类器官的培养基对比，一种为实施例4所用培养基，一种为减去Cyclic Pifithrin-α成分培养基，具体浓度及成分见表8：
表8
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
N-FERULOYLOCtopAMINE 10μM
N-Acetylcysteine 1.25mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 100ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 100ng/mL
FGF-7 50ng/mL
FGF-10 10ng/mL
BETACELLULIN 50 ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α /
采用本发明的培养方法和上述两种培养基分别对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。7-14天进行传代，观察培养情况，培养情况如图8所示。
在培养第5天时，加入3mLTrypLE Express（Life Technologies，12605-010）消化酶，将两种培养基培养的甲状腺癌类器官进行消化5min,加入5mL DPBS（BiologicalIndustries，02-023-1ACS）终止消化，1200rbm,3min离心，用1mL类器官培养基重悬，细胞计数仪进行计数。计数结果如表11所示。
通过表11中的细胞数和活率可以看出，减Cyclic Pifithrin-α成分的培养基对甲状腺癌类器官增值以及活率影响很大。
对比例4
本对比例提供两种甲状腺癌类器官的培养基对比，一种为实施例4所用培养基，一种为将N-FERULOYLOCTOPAMINE因子替换为同为P38 MAPK通路抑制剂的SB 202190因子的培养基，具体浓度及成分见表9：
表9
组分名称 终浓度
Advanced DMEM/F12 Basal mediuM
L-谷氨酰胺 1×
HEPES 10 mM (1×)
Nicotinamide 10mM
A83-01 0.5 μM
SB 202190 10μM
N-Acetylcysteine 1.25mM
Penicillin/Streptomycin 100 IU/mL
Wnt 3A 100ng/mL
R-Spondin-1 250 ng/mL
Noggin 100ng/mL
FGF-7 50ng/mL
FGF-10 10ng/mL
BETACELLULIN 50 ng/mL
Thyroid Stimulating Hormone 10m IU/mL
B27 0.5×
Cyclic Pifithrin-α 0.4μM
采用本发明的培养方法和上述两种培养基分别对采集到的人的甲状腺癌组织进行处理和培养。7-14天进行传代，观察培养情况，培养情况如图9所示。
在培养第5天时，加入3mLTrypLE Express（Life Technologies，12605-010）消化酶，将两种培养基培养的甲状腺癌类器官进行消化5min,加入5mL DPBS（BiologicalIndustries，02-023-1ACS）终止消化，1200rbm,3min离心，用1mL类器官培养基重悬，细胞计数仪进行计数。计数结果如表10所示。
通过表10中的细胞数和活率可以看出，N-FERULOYLOCTOPAMINE和BETACELLULIN还具有协同作用，BETACELLULIN和同样为P38 MAPK通路抑制剂的SB 202190因子，共同作用时，效果不佳，不具备协同效应。
表10
培养基版本 细胞数(W) 活率（%）
实施例4培养基 132.00 89
对比例1培养基 27.80 63
对比例2培养基 31.60 64
对比例3培养基 44.80 69
对比例4培养基 47.00 55.00
通过上述实施例和对比例可以得到以下结论：
（1）实施例1~5采用了本发明的甲状腺癌类器官培养基进行培养，各实施例的具体成分有所区别。根据图1~9在相同的培养时间拍摄的细胞图片能够看出，采用实施例4的培养基培养的甲状腺癌类器官的细胞最多，而且平均直径最大。这说明实施例4的培养基组分和配比最适合对甲状腺癌类器官进行培养，使其增殖更快。
（2）对比例1对于培养基中是否添加N-FERULOYLOCTOPAMINE对细胞数和活率的影响进行了对比试验。根据实验可以看出，仅去掉N-FERULOYLOCTOPAMINE后，细胞存活数相比于实施例4的存活数62.40W，下降至27.80W，活率也从84%降至63%，说明细胞增殖速度大幅度降低，增殖效果差。因此，N-FERULOYLOCTOPAMINE在细胞增殖过程中具有重要的作用。
（3）对比例2对于培养基中是否添加BETACELLULIN对细胞数和活率的影响进行了对比试验。根据实验可以看出，仅去掉BETACELLULIN后，细胞存活数相比于实施例4的存活数108.00W下降至31.60W，活率也从90%降至64%，说明细胞增殖速度大幅度降低。因此，BETACELLULIN在细胞增殖过程中也具有重要的作用。
（4）对比例3对于培养基中是否添加Cyclic Pifithrin-α对细胞数和活率的影响进行了对比试验。根据实验可以看出，仅去掉Cyclic Pifithrin-α后，细胞存活数相比于实施例4的存活数132.00W下降至44.80W，活率也从89%下降至69%，说明细胞增殖速度大幅度降低。因此，Cyclic Pifithrin-α在细胞增殖过程中也具有重要的作用。
（5）对比例4将N-FERULOYLOCTOPAMINE替换为SB 202190因子。SB 202190因子与N-FERULOYLOCTOPAMINE同为P38 MAPK通路抑制剂。然而，通过实验结果可以看出，虽然两者的功能相同，但相比于实施例4的124.00W细胞数、88.00%的活率，对比例4的细胞数仅有47.00W，活率仅有55.00%。通过该结果可以看出，在本发明的甲状腺癌类器官培养基中，N-FERULOYLOCTOPAMINE和BETACELLULIN具有协同作用，两者并非是独立的促进细胞增殖。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甲状腺癌类器官的培养基，其特征在于，包括Advanced DMEM/F12基础培养基、L-谷氨酰胺、烟酰胺、A83-01、N-乙酰半胱氨酸、B27、Wnt 3A、R-Spondin-1重组蛋白、Noggin蛋白、成纤维细胞生长因子、促甲状腺素；
还包括N-阿魏酰章鱼胺、B-细胞素和Cyclic Pifithrin-α。
2.根据权利要求1所述一种甲状腺癌类器官的培养基，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7和FGF-10。
3.根据权利要求2所述一种甲状腺癌类器官的培养基，其特征在于，所述L-谷氨酰胺的浓度为1×，所述烟酰胺的浓度为10mM，所述A83-01的浓度为0.5 μM，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM，所述B27的浓度为0.5×，所述Wnt 3A的浓度为100-300ng/mL，所述R-Spondin-1重组蛋白的浓度为250ng/mL，所述Noggin蛋白的浓度为100-200ng/mL、所述促甲状腺素的浓度为10m IU/mL、所述FGF-7的浓度为25-100 ng/mL，所述FGF-10的浓度为10-15ng/mL；溶剂为Advanced DMEM/F12基础培养基；
所述N-阿魏酰章鱼胺的浓度为3-10μM，所述B-细胞素的浓度为30-60ng/mL，所述Cyclic Pifithrin-α的浓度为2-6μM。
4.根据权利要求3所述一种甲状腺癌类器官的培养基，其特征在于，所述Wnt 3A的浓度为100ng/mL，所述Noggin蛋白的浓度为100ng/mL、所述FGF-7的浓度为50ng/mL，所述FGF-10的浓度为10ng/mL；
所述N-阿魏酰章鱼胺的浓度为10μM，所述B-细胞素的浓度为50ng/mL，所述CyclicPifithrin-α的浓度为4μM。
5.根据权利要求1~4任意一项所述一种甲状腺癌类器官的培养基，其特征在于，还包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸，浓度为1×。
6.根据权利要求1~4任意一项所述一种甲状腺癌类器官的培养基，其特征在于，还包括青链霉素双抗溶液，所述青链霉素双抗溶液的浓度为100 IU/mL。
7.一种甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1~6任意一项所述的甲状腺癌类器官培养基进行培养。
8.根据权利要求7所述一种甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、获取待培养的甲状腺组织样本；
S2、将所述甲状腺组织样本放置在容器中，并使用DPBS-PS对所述甲状腺组织样本反复清洗，直至清洗液澄清；
S3、除去所述容器中残留的DPBS-PS，对所述甲状腺组织样本进行消化、重悬，得到甲状腺细胞沉淀；
S4、将所述甲状腺癌类器官培养基与步骤S3得到的所述甲状腺细胞沉淀混合并得到细胞溶液，再将所述细胞溶液与基质胶以质量比为1:2的比例进行混合；混合后，进行滴胶接种，每个胶滴为50μL，并且每个胶滴中的细胞量大于或等于2万个；接种完成后，在37℃下静置直至胶滴全凝固；
S5、另取所述甲状腺癌类器官培养基并在37℃下预热，在每个所述胶滴上加入500μL预热后的所述甲状腺癌类器官培养基，并使用DPBS-PS进行封边处理；
S6、每2~4天在每个所述胶滴上添加500μL在37℃下预热后的所述甲状腺癌类器官培养基，培养5天后得到所述甲状腺癌类器官。
9.根据权利要求8所述一种甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤为：
S3-1、除去所述容器中残留的DPBS-PS后，向所述容器中加入少量第消化液Ⅰ；
S3-2、将所述甲状腺组织样本剪切为大小均一的组织块；继续向所述容器中添加2-4mL的所述消化液Ⅰ，并在5%的CO2、37℃的摇床中进行第一次消化；
所述第一次消化的时间为1h，之后，加入8 mL DPBS-PS终止消化，离心并弃上清液；
S3-3、向所述容器中添加2mL消化液Ⅱ，并在5%的CO2、37℃的摇床中进行第二次消化；
所述第二次消化的时间为20min，之后，加入4 mL DPBS-PS终止消化，再次离心并弃上清液，保留细胞沉淀；
S3-4、向所述容器中添加2 mL DPBS-PS对所述细胞沉淀进行重悬，依次过100μM的细胞筛网、离心、弃上清液，得到所述甲状腺细胞沉淀。
10.根据权利要求8所述一种甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤S3中，当消化和重悬后得到的细胞沉淀呈红色时，在进行所述步骤S4前，先向所述容器中加入1~2mL红细胞裂解液；再使用移液枪上下吹打，并在冰上孵育10min；孵育结束后离心，弃上清液后得到的细胞沉淀为所述甲状腺细胞；
当消化和重悬后得到的细胞沉淀不呈红色时，直接进行所述步骤S4。
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