CN107312745B - 一种无血清的上皮细胞培养液 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供一种无血清的上皮细胞培养液，涉及生物医学领域，包括基础培养液、必需添加因子、生长因子、贴壁因子、激素、细胞增殖分化的调节因子以及细胞凋亡抑制剂。通过添加P53抑制剂、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）协同抑制细胞凋亡的作用，达到抑制细胞培养过程中出现的细胞凋亡，同时添加细胞增殖分化的调节因子，从而避免细胞过早衰老，适用于大规模的细胞扩增培养。

Description

一种无血清的上皮细胞培养液
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种无血清的上皮细胞培养液。
背景技术
化学物直接接触或者暴露于眼部，会引发刺激性以及局部毒性。因此，眼表刺激性风险评估是危害评价以及风险规避程序中非常需要的一项。传统方法中对新型化合物的眼刺激潜在风险的评估主要依赖于体外的兔子实验，这种方法耗时耗力、且成本较高。因此，寻找快速、经济的化合物筛选方法成为该领域的一项迫切需求，并激发了大量的关于眼表刺激性风险评估的体外替代方法的建立，例如牛角膜不透明度及渗透性检测，鸡胚尿囊膜实验等，上述技术通过一定程度的组合可以实现体外眼刺激性评价，但却都无法完全实现兔眼刺激实验的体外替代；另外，这些体外替代方法适用范围有限，只能评价化妆品原料，不能评价化妆品成品。近年来，随着体外器官培养技术的发展，基于体外细胞培养构建的3D重组角膜上皮模型，在眼刺激风险评价领域表现出特有的优势，类似于人体角膜上皮的细胞三维结构，不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，对于化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，不仅适用于化妆品原料的危害评价，还可以用于不同剂型的化妆品成品的危害评估。
目前，角膜上皮细胞是构建体外三维角膜上皮组织模型最理想的种子细胞，构建的三维角膜模型的生物学特性更能反映真实的角膜组织。然而由于分化后的角膜上皮细胞体外生长的生命周期很短，只能传2～3代，获得的细胞数量少，花费较高，限制了角膜组织的研究和组织工程化角膜的构建。如何改进体外培养技术，培养出分裂增殖能力强、能不断分裂生长的角膜上皮细胞，以补充细胞的不断更新，成为获得角膜上皮种子细胞的首要任务。另外，研究发现口腔黏膜上皮细胞与角膜上皮细胞特征相似，亦可以用于构建角膜样模型。
现如今，无论是角膜上皮细胞还是口腔黏膜上皮细胞的培养大多是参照皮肤KC的培养技术，早期多采用有血清培养基和组织块法，血清成份占10-20%。Souhtgaet等综合分析了培养基中的各种成份对原代口腔上皮细胞生长分化的影响，研究发现含血清10%的培养基成纤维细胞生长明显，对正常的口腔上皮细胞造成严重的污染，影响口腔黏膜上皮细胞在医学领域的应用。随后许多上皮细胞的培养采用酶解培养法，即用胰酶和 DispaseⅡ酶酶解的方法分离上皮细胞，然后以3T3作为滋养层的技术来进行的，但由于滋养细胞的存在影响试验结果的分析。而且，许多研究者相信3T3细胞和人细胞共同培养有可能引起突变或异种蛋白对人KC的转染，强调在选择性手术中尽量不用滋养层培养上皮细胞。为了避免使用滋养层，人们发展了多种方法：如培养皿表面涂细胞基质成份；不同浓度的钙和各种生物提取物、促分裂物和微量元素的添加。Arehnolti Bdnslev应用含10%血清的无滋养层培养方法，上皮细胞可传代两次，细胞形成复层，培养基中的血清除了诱导细胞过度分化导致上皮复层化外，血清中不明蛋白的存在，对细胞的信号转导和细胞表面标志形成干扰，另外，培养基中牛血清可能含外源性污染物和其它慢病毒，对人有潜在的危险。
针对上述问题，许多学者正寻求和使用无血清培养基，目前已有商品化的无血清培养基如K-SFM和MCDB153。MCDB153是经过多次改善得到的一款角质细胞无血清培养基，但在细胞培养过程中表现出局限性，繁殖和扩增细胞的能力有限，研究发现如果角质细胞在MCDB153中生长至完全汇合，则快速地丧失其传代能力。另外无血清培养基缺乏通用性，一种无血清培养基只能做到为一种或少数几种细胞株设计或优化出高密度生长或高水平目的产物表达的培养基，而其他细胞在这样的培养基体系中并不能较好的增殖生长。
对于上皮细胞的无血清培养基，许多学者在基础无血清培养液如K-SFM和MCDB153的基础上，通过添加相关营养成份如EGF、胰岛素、牛垂体提取液、氢化泼尼松、转铁蛋白和霍乱毒素等以及对其添加量进行改进，从而使其更适合于口腔黏膜上皮细胞或角膜上皮细胞的培养，但是最多能够传至7-9代，细胞凋亡现象比较明显。主要原因是为了代替血清成份，在无血清培养基中添加多种动物提取物，导致出现某一种营养成份过多而其他的另一种营养成份缺乏的不均衡现象，一方面对细胞产生慢性毒性损伤，另一方面细胞在快速增殖过程中产生自由基，进而对细胞产生氧化应激损伤，导致细胞发生凋亡。
综上，目前无血清培养过程存在的缺点有：（1）无血清培养基缺乏通用性，一种无血清培养基只能做到为一种或少数几种细胞株设计或优化出高密度生长或高水平目的产物表达的培养基，而其他细胞在这样的培养基体系中并不能较好的增殖生长，目前市场的无血清培养液都是用于培养表皮细胞，没有特有的培养口腔黏膜上皮细胞或角膜上皮细胞的无血清培养液；（2）无血清培养体系下培养的细胞生长缓慢，原有的干细胞特性下降，容易出现老化现象，很难大量扩增，从而给大规模的组织工程构建带来困难；（3）无血清培养基为了代替血清中的营养成份，会添加多种来自动物的提取物，导致营养成份不均衡，一些成份含量过多，使得细胞在培养过程中产生毒性物质，从而损伤细胞，诱导细胞凋亡。
现有研究发现，黄素腺嘌呤二核苷酸或其盐能够显著地抑制通过紫外线照射或干燥诱导的角膜上皮细胞的死亡。黄素腺嘌呤二核苷酸是体内核黄素的活性型，作为某些氧化还原酶的辅基，参与体内多种氧化脱氢反应，但还没有报道此化合物应用于上皮细胞培养的无血清培养基。
发明内容
本发明实施例提供了一种无血清的上皮细胞培养液，针对目前无血清培养体系下，上皮细胞生长缓慢、原有的干细胞特性下降、细胞容易发生凋亡、出现老化现象、很难大量扩增等一系列问题，本发明在基础培养基的基础上，提供一种可使上皮细胞高密度增殖的无血清培养基体系，降低或者抑制在细胞培养过程中产生的细胞毒性损伤，抑制细胞凋亡，延缓细胞衰老，使之在体外扩增更多的倍数。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种无血清上皮细胞培养液，包括基础培养液、必需补充因子、生长因子、贴壁因子、激素、细胞增殖分化调节因子以及细胞凋亡抑制剂。
本发明提供一种无血清上皮细胞培养液，基础培养液是无血清培养基是K-SFM或MCDB153或体积比为1∶3的F12和DMEM混合培养液。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液中，必需补充因子为浓度为5-20μg/ml的胰岛素和转铁蛋白。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液中，细胞生长因子包括表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ和BPE，其中，表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ和BPE的浓度均为5-50ng/ml。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液中，贴壁因子为浓度为5-50ng/ml的纤连蛋白。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液中，激素为浓度为1-10μM的氢化可的松。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液中，细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸和CaCl2，其中，维甲酸、甘醇酸和CaCl2的浓度均为1-5μM。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液中，细胞凋亡抑制剂为P53抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD中任意一种或者多种的组合，其中，P53抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的浓度均为1-10μM。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液中，无血清的上皮细胞培养基用于培养角膜上皮细胞或口腔粘膜上皮细胞。
本发明还提供一种无血清上皮细胞培养液的配制方法，具体步骤为：
在基础培养液K-SFM或MCDB153或体积比为1∶3的F12和DMEM混合培养液中任选一种，依次添加浓度为5-20μg/ml的胰岛素和转铁蛋白，浓度为5-50ng/ml的表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、BPE和纤连蛋白，浓度为1-10μM的氢化可的松，浓度为1-5μM的维甲酸和甘醇酸等细胞增殖分化调节因子，浓度为1-10μM的P53抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），最后添加CaCl2，其浓度为1-10μM。搅拌待所有成份溶解，密封好后放置于4℃冰箱中备用。
本发明提供的一种无血清上皮细胞培养液的有益效果在于：
（1）按照不同类别上皮细胞生长的微环境，通过添加适量多类型的营养因子，从而避免培养基营养的不均衡出现上皮细胞由于缺乏某一种成份而发生生长抑制现象。例如，角膜周围具有发达的神经系统，在机体内，神经系统分泌多种的因子会滋养上皮细胞的增殖，所以在上皮培养液中添加神经生长因子以利于体外角膜上皮细胞的增殖。
（2）针对常规无血清培养过程中，细胞凋亡现象的发生，本发明的培养基中通过添加P53抑制剂、抗氧化剂和氧化代谢过程的相关酶来达到协同抑制细胞凋亡的作用，从而能够抑制或者清除在细胞培养过程中产生的有害代谢产物，延缓细胞的衰老，使之在体外扩增更多的倍数；另外还添加了维甲酸/甘醇酸和CaCl2等细胞增殖分化的调节因子，从而调节细胞增殖分化，避免细胞的过渡分化而导致的增殖抑制现象。
附图说明
图1为本发明实施例提供的P53抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）协同抑制口腔黏膜上皮细胞凋亡的研究结果；
图2为本发明实施例提供的口腔黏膜上皮细胞在本发明实施例提供的培养液和无血清培养基MCDB153培养下，细胞凋亡率的比较；
图3为本发明实施例提供的口腔黏膜上皮细胞在本发明实施例提供的培养液和无血清培养基MCDB153培养下，细胞表面干细胞标记物的mRNA水平的表达情况比较；
图4为本发明实施例提供的角膜上皮细胞在本发明实施例提供的培养液和无血清培养基MCDB153培养下，培养不同时间，角膜上皮细胞增殖蛋白mRNA含量的比较；
图5为本发明实施例提供的角膜上皮细胞在本发明实施例提供的培养液和无血清培养基MCDB153培养下，不同代次角膜上皮细胞活力的比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
需要说明的是，本发明实施例中使用的K-SFM培养液、MCDB153培养液、F12/DMEM培养液均购自Gibco公司，表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、纤连蛋白、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、CaCl2、维甲酸以及P53抑制剂Pifithrin-α、白藜芦醇、黄素腺嘌呤二核苷酸或其钠盐均购自Sigma公司，牛垂体提取物（BPE）为本公司自行提取的。
实施例1
本发明实施例提供一种无血清的上皮细胞培养液，无血清的上皮细胞培养液具体包括基础培养液、必需补充因子、细胞生长因子、贴壁因子、激素、细胞增殖分化调节因子以及细胞凋亡抑制剂。
其中，必需补充因子为浓度为5-20μg/ml的胰岛素和转铁蛋白；细胞生长因子为浓度均为5-50ng/ml的表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ和牛垂体提取物（BPE）；贴壁因子为浓度为5-50ng/ml的纤连蛋白；激素为浓度为1-10μM的氢化可的松；细胞增殖分化调节因子为浓度均为1-5μM的维甲酸、甘醇酸和CaCl2；细胞凋亡抑制剂为浓度均为1-10μM的P53抑制剂Pifithrin-α、抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD组合抑制剂。
需要说明的是，基础培养液为K-SFM培养液或者MCDB153培养液或者F12/DMEM培养液，其中，所述F12/DMEM培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的。
示例性的，在第一种可能的实现方式中，本发明实施例提供的无血清的上皮细胞培养液可以包括：以体积比为1∶3的F12和DMEM混合培养液作为基础培养基配制1L无血清上皮细胞培养液，具体配制过程如下：
（1）先在超净台中用无菌去离子水配制细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的母液，其中必需补充因子胰岛素和转铁蛋白的母浓度均为10mg/ml，细胞生长因子表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、牛垂体提取物（BPE）、贴壁因子纤连蛋白的母液浓度均为10mg/ml；氢化可的松母液浓度为10mM；细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸和CaCl2母液浓度均为10mM；细胞凋亡抑制剂P53抑制剂Pifithrin-α、抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）母液浓度均为10mM。
（2）将购自Gibco的F12/DMEM（1:3）粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2L烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；
（3）在超净工作台中向上述步骤2的基础培养液中添加步骤1所述各种因子母液，使得胰岛素和转铁蛋白浓度均为12.5μg/ml，细胞生长因子表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、牛垂体提取物（BPE）、贴壁因子纤连蛋白浓度均为25ng/ml；氢化可的松浓度为5μM；细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸，其浓度均为4μM；细胞凋亡抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其浓度均为10μM。搅拌混匀；
（4）最后，在超净工作台中添加浓度为5μM的CaCl2，搅拌均匀；
（5）储存处理：密封好后放置于4℃冰箱中备用。
示例性的，在第二种可能的实现方式中，本发明实施例提供的无血清的上皮细胞培养液可以包括：
以K-SFM作为基础培养基配制1L无血清上皮细胞培养液，具体配制过程如下：
（1）先在超净台中用无菌去离子水配制细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的母液，其中必需补充因子胰岛素和转铁蛋白的母浓度均为10mg/ml，细胞生长因子表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、牛垂体提取物（BPE）、贴壁因子纤连蛋白的母液浓度均为10mg/ml；氢化可的松母液浓度为10mM；细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸和CaCl2母液浓度均为10mM；细胞凋亡抑制剂P53抑制剂Pifithrin-α、抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）母液浓度均为10mM；
（2）将购自Gibco的K-SFM粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2L烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；
（3）在超净工作台中向上述步骤2的基础培养液中添加步骤1所述各种因子母液，使得胰岛素和转铁蛋白浓度均为5μg/ml，细胞生长因子表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、牛垂体提取物（BPE）、贴壁因子纤连蛋白浓度均为50ng/ml；氢化可的松浓度为1μM；细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸，其浓度均为5μM；细胞凋亡抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其浓度均为5μM。搅拌混匀；
（4）最后，在超净工作台中添加浓度为2.5μM的CaCl2，搅拌均匀后，密封放置于4℃冰箱中备用。
示例性的，在第三种可能的实现方式中，本发明实施例提供的无血清的上皮细胞培养液可以包括：
以MCDB153作为基础培养基配制1L无血清上皮细胞培养液，具体配制过程如下：
（1）先在超净台中用无菌去离子水配制细胞营养因子和细胞增殖分化调节因子的母液，其中必需补充因子胰岛素和转铁蛋白的母浓度均为10mg/ml，细胞生长因子表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、牛垂体提取物（BPE）、贴壁因子纤连蛋白的母液浓度均为10mg/ml；氢化可的松母液浓度为10mM；细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸和CaCl2母液浓度均为10mM；细胞凋亡抑制剂P53抑制剂Pifithrin-α、抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）母液浓度均为10mM；
（2）将购自Gibco的K-SFM粉末培养基倒入装有800ml去离子水的2L烧杯中，然后将烧杯置于搅拌机上，搅拌2h待溶解后，用0.22μm的过滤器过滤除菌，得基础培养液；
（3）在超净工作台中向上述步骤2的基础培养液中添加步骤1所述各种因子母液，使得胰岛素和转铁蛋白浓度均为20μg/ml，细胞生长因子表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ、牛垂体提取物（BPE）、贴壁因子纤连蛋白浓度均为5ng/ml；氢化可的松浓度为10μM；细胞增殖分化调节因子维甲酸、甘醇酸，其浓度均为1μM；细胞凋亡抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其浓度均为1μM，搅拌混匀；
（4）最后，在超净工作台中添加浓度为1μM的CaCl2，搅拌均匀后，密封放置于4℃冰箱中备用。
实施例2
P53抑制剂Pifithrin-α、抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）协同抑制细胞凋亡的研究。
实验操作方法：
首先，基于基础培养基MCDB153和必需补充因子、细胞生长因子、贴壁因子、激素、细胞增殖分化调节因子以及细胞凋亡抑制剂的基础上，配制三类培养基：（1）只添加天然提取的抗氧化剂白藜芦醇；（2）只添加黄素腺嘌呤二核苷酸FAD（3）只添加P53抑制剂Pifithrin-α，（4）同时添加P53抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。
复苏P1代的口腔黏膜上皮细胞，分别接种于含有这四种培养基的25ml的培养瓶中，然后置于37℃，5% CO2培养箱培养，每 2 d 更换1次培养液。待口腔粘膜上皮细胞80%～90%融合时，消化传代再培养，培养至第12代，培养过程中运用MTT细胞活力检测技术隔代进行细胞活力的检测。
结果显示，从P10代开始，单独添加几种细胞凋亡抑制剂的细胞出现了不同程度的凋亡，而三种凋亡抑制剂都添加的一组中细胞的活力基本没有下降，与其他三组相比具有显著性，由此可见，三者协同使用可以实现抑制细胞凋亡的作用（附图1）。
实施例3
采用无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的无血清培养液培养口腔黏膜上皮细胞，传代培养过程中细胞凋亡率的比较研究：
实验操作方法：
在无菌条件下，复苏冻存的P2代口腔黏膜上皮细胞，然后分别接种于无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的的培养液的25ml 培养瓶中，然后置于37℃，5% CO2培养箱培养，每 2 d 更换1次培养液。待口腔黏膜上皮细胞为80%～90%融合时，消化形成细胞悬液，然后按照6E4个/孔的细胞密度接种于6孔板中，置于37℃，5% CO2培养箱培养，每2天更换1次培养液。培养至第6天时运用流式细胞仪分析细胞的凋亡率。
结果显示，无血清培养基MCDB153培养的口腔粘膜上皮细胞的凋亡率明显高于本发明的培养基培养的口腔黏膜上皮细胞（附图2）。
实施例4
采用无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的无血清培养液培养口腔黏膜上皮细胞，其表面标记物表达情况的比较研究：
实验操作方法：
无菌条件下切取出生后 1 d 的昆明小鼠口腔黏膜，修剪去除粘膜下组织并剪成约1 mm × 1mm 大小的组织块，用含双抗的PBS冲洗3～4 次。将标本放入 4 mg /mlDispaseⅡ中，37℃消化约15min，然后分离上皮层。PBS 轻轻冲洗上皮层后，置于0.25% 胰蛋白酶中，37 ℃消化约10min，终止消化，吹打成单细胞悬液，离心弃掉上清后，分别接种于无血清培养基MCDB153和本发明的培养基体系的25ml 培养瓶中，然后置于37℃，5% CO2培养箱培养，每 2 d 更换1次培养液。待口腔黏膜上皮细胞为80%～90%融合时，消化传代再培养，直到培养至第9代时，收集不同体系的细胞，裂解细胞，提取RNA，运通RT-PCR法进行口腔黏膜细胞表面的标记物CK14，SOX2和LGR5的比较分析。
结果显示，与原代细胞相比，本发明实施例提供的培养液培养的P9代细胞中细胞表面标记物的表达有下降，但没有显著性；而用无血清培养基MCDB153培养的P9代细胞的表面标记物极显著性地下降，含量异常低（附图3）。
实施例5
采用无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的无血清培养液培养角膜上皮细胞，细胞增殖情况的比较研究：
实验操作方法：
在无菌条件下，复苏冻存的P2代角膜上皮细胞，然后分别接种于无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的的培养液的25ml 培养瓶中，然后置于37℃，5% CO2培养箱培养，每 2 d 更换1次培养液。待角膜上皮细胞为80%～90%融合时，消化形成细胞悬液，然后按照3E4个/孔的细胞密度接种于6孔板中，置于37℃，5% CO2培养箱培养，每2天更换1次培养液。培养至第6天时运用RT-PCR法分析细胞增殖标志物Ki67蛋白的mRNA含量。
实验结果显示，从第2天开始，与无血清培养基MCDB153相比，本发明实施例提供的的培养液下细胞增殖标志物Ki67的mRNA水平显著性升高，培养到第6天时，本发明的培养体系下细胞增殖标志物Ki67的mRNA水平极显著性升高（附图4）。
实施例6
采用无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的无血清培养液培养角膜上皮细胞，传代培养过程中细胞凋亡率的比较研究：
实验操作方法：
在无菌条件下，复苏冻存的P2代角膜上皮细胞，然后分别接种于无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的培养液的25ml 培养瓶中，然后置于37℃，5% CO2培养箱培养，每 2 d 更换1次培养液。待角膜上皮细胞为80%～90%融合时，消化传代再培养，培养至第12代，其中培养过程中运用MTT细胞活力检测技术隔代进行细胞活力的检测。
结果显示，与原代细胞相比，无血清培养基MCDB153和本发明实施例提供的培养液培养的角膜上皮细胞的细胞活力都有所降低，但是无血清培养基MCDB153培养的角膜上皮细胞的细胞活力下降程度显著性低于本发明的培养基培养的角膜上皮细胞的细胞活力（附图5）。
本发明实施例提供一种无血清的上皮细胞培养液，包括基础培养液，必需添加因子、生长因子、贴壁因子、激素、细胞增殖分化的调节因子以及细胞凋亡抑制剂。针对目前无血清培养体系下，上皮细胞生长缓慢、原有的干细胞特性下降、细胞容易发生凋亡、出现老化现象、很难大量扩增等一系列问题，本发明在基础培养基的基础上，提供一种可使上皮细胞高密度增殖的无血清培养基体系，降低或者抑制在细胞培养过程中产生的细胞毒性损伤，抑制细胞凋亡，延缓细胞衰老，使之在体外扩增更多的倍数。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种无血清的上皮细胞培养液，其特征在于，所述无血清的上皮细胞培养液包括基础培养液、必需补充因子、细胞生长因子、贴壁因子、激素、细胞增殖分化调节因子以及细胞凋亡抑制剂；
所述基础培养液为K-SFM培养液或者MCDB153培养液或者F12/DMEM培养液，所述F12/DMEM培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的；
所述必需补充因子为浓度为5-20μg/ml的胰岛素和转铁蛋白；
所述细胞生长因子包括表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、胰岛素生长因子IGF-I、转化生长因子TGFβ和牛垂体提取物(BPE)，其中，所述表皮生长因子EGF、所述神经生长因子NGF、所述胰岛素生长因子IGF-I、所述转化生长因子TGFβ和所述BPE的浓度均为5-50ng/ml；
所述贴壁因子为浓度为5-50ng/ml的纤连蛋白；
所述激素为浓度为1-10μM的氢化可的松；
所述细胞增殖分化的调节因子为维甲酸、甘醇酸和CaCl2，其中，所述维甲酸、所述甘醇酸和所述CaCl2的浓度均为1-5μM；
所述细胞凋亡抑制剂为P53抑制剂Pifithrin-α、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的组合抑制剂，其中，所述P53抑制剂Pifithrin-α、所述天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和所述黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的浓度均为1-10μM。
2.根据权利要求1所述的一种无血清的上皮细胞培养基，其特征在于，所述无血清的上皮细胞培养基用于培养角膜上皮细胞或口腔粘膜上皮细胞。
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