CN103690554B - 杀灭耐药烟曲霉的组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
一种杀灭耐药烟曲霉的组合物及方法，属于生物技术领域。一种杀灭耐药烟曲霉的方法，包括制备药物、收集菌株、制备孢子悬液、药物敏感试验和联合药敏试验，先通过本发明步骤获得两性霉素B和肉桂醛的最低抑菌浓度MIC，再利用两性霉素B和肉桂醛不同浓度的药物组合来达到杀灭耐药烟曲霉菌的作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及烟曲霉生物膜，具体涉及一种杀灭耐药烟曲霉的组合物以及杀灭耐药烟曲霉的方法。
背景技术
由烟曲霉导致的侵袭性肺曲霉病（invasivepulmonaryaspergillosis，IPA）是恶性血液病、器官移植、艾滋病等免疫受损患者常见且致命的机会感染性疾病，死亡率高达30-100%。耐药是导致治疗失败的一个重要原因，一项临床研究检测了1385个IPA患者的烟曲霉菌株，发现对唑类耐药的IPA患者死亡率达88%，而敏感菌株感染者死亡率为48%。近年来烟曲霉的耐药率在逐渐升高，1999年首次发现了唑类耐药的烟曲霉菌株，2004年伊曲康唑的耐药率就达到5%，且65%的这些菌株对VRC交叉耐药，而2007年一些国家的唑类多重耐药率已经升至17%。全球抗生素监测项目显示2006年28.6%的烟曲霉菌株对AMB耐药。如何控制耐药的烟曲霉菌引起的IPA已经成为了临床难题，而研发出新的有效的药物是解决这个难题的一条途径，然而研发出新的有效药物是个漫长过程不易应对目前耐药的严峻形势。如果某种药物能协同传统抗真菌药使后者发挥更强的抑制烟曲霉作用，那么对缓解耐药压力也将是很大的帮助，但目前还未见类似的报道。
发明内容
本发明提供的技术方案为：一种杀灭耐药烟曲霉的方法，包括制备药物、收集菌株、制备孢子悬液、药物敏感试验和联合药敏试验，具体检测步骤如下：
1）制备药物将4~5mg两性霉素B和300~500mg肉桂醛，分别用3~5ml100%的二甲亚砜溶解，并将溶液配成浓度为1280μg/ml和102400μg/ml，于-20~-25℃储存；
2）收集菌株收集烟曲霉菌株，质控菌株为ATCC22019近平滑念珠菌；
3）制备孢子悬液将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿上，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30mlMOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~3×106·孢子·ml-1，再用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；
4）药物敏感试验微量液基稀释法，将步骤1）制备的两性霉素B和肉桂醛分别置于无菌的2个96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓度，再将步骤3）制备的孢子悬液加入滴1至第10孔，每孔加入量为100μl，第11孔为步骤3）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为RPMI-1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，分别获得两性霉素B和肉桂醛的最低抑菌浓度MIC；最低抑菌浓度（MIC）的判定：肉眼观察判断终点：96培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC；
5）联合药物试验在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素B和肉桂醛，前8列加入两性霉素B和肉桂醛，加入两性霉素B的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，加入肉桂醛的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，第9列为步骤3）制备孢子悬液的生长对照孔，第10列为无菌对照孔，再将步骤3）制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列，每孔加入量为100μl，后静置于35~37℃培养48~50h，观察。
所述步骤5）含有两性霉素B和肉桂醛的96孔板预先制备好，保存在-20~-25℃下。
一种杀灭耐药烟曲霉的组合物，包括两性霉素B和肉桂醛，两性霉素B1/16-1/4MIC，肉桂醛1/32-1/4MIC。
本发明突出的实质性进步和显著的特点是：
AMB作为治疗侵袭性曲霉病的主要药物，一旦烟曲霉对其耐药，其治疗效果将明显受到影响。本发明证实AMB联合肉桂醛之后对烟曲霉菌展现出更明显的抗菌活性，即使是对耐AMB的烟曲霉菌也能在敏感范围的药物浓度下将其杀灭，为临床上应对耐AMB的烟曲霉引起的感染奠定研究基础。
附图说明
图1是本发明实施例2肉桂醛与AMB单用与联合应用对烟曲霉菌的浓度-累积抑菌百分率曲线（n=7）。
图2是本发明实施例2肉桂醛与AMB联合应用对7株AMB耐药烟曲霉菌株的FIC指数分布图。
具体实施方式
实施例1
一、材料
1.药物两性霉素B（Amresco，批号1397893），肉桂醛(Sigma，批号V900539)。分别用100%的二甲亚砜溶解，配成浓度为1280μg/ml、102400μg/ml的储存液，分装后于-20℃储存。
2.菌株取自2012年9月到2013年5月在广西医科大学第一附属医院收集到的7个烟曲霉菌株。质控菌株为ATCC22019近平滑念珠菌，获赠于广西医科大学第一附属医院检验科细菌室。
3.试剂和器材马铃薯葡萄糖培养基PDA（北京路桥）、MOPS（Sigma）、RPMI-1640粉（Gibco）、二甲亚砜（Sigma）、无菌96孔细胞培养板（美国Corning）、生化培养箱（常州市伟嘉仪器制造有限公司，型号：SPX-250）、生物安全柜（苏州净化设备有限公司，型号：BHC-1300ⅡA/B2）。
二、方法
1.孢子悬液的制备将储存的菌株接种到PDA培养皿，置于35℃生化培养箱进行复苏，再转种到另一个PDA培养皿并置于35℃生化培养箱活化3天之后用5ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，20mlMOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，血细胞计数板调整孢子浓度为1×106·ml-1，再用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液。
2.药物敏感试验微量液基稀释法：按照CLSI颁布的M38-A2的标准进行。把受试的药物倍比稀释到2倍终浓度，分别取100μl加入到无菌96孔细胞培养板的第1至第10孔，第11孔为不含药物的生长对照孔，第12孔为不含药物且不含孢子的无菌对照孔。第1至第11孔分别加入100μl制备好的2倍终浓度的孢子悬液，静置于35℃孵育48h。
3.棋盘法联合药敏试验每个药共8个浓度梯度，按二倍稀释法稀释，终浓度范围均为受试菌株的1/32×MIC至4×MIC。在无菌96孔细胞培养板上第1至8行的前8个孔分别加入肉桂醛50μl，其中第1行的浓度为4×1/32×MIC，第2行的浓度比第1行增加1倍，直至第8行的浓度是4×4×MIC；于96孔板上第1至8列的前8个孔分别加入AMB50μl，其中第1列的浓度为4×1/32×MIC，第2列的浓度比第1列增加1倍，直至第8列的浓度是4×4×MIC。第9列加入不含药物的培养基100μl作为生长对照，第10列作为空白对照。制备好的药敏板可置于-20℃冰箱内保存，临用前解冻。把制备好的2倍终浓度的孢子悬液加入到含药物的64个孔和第9列的生长对照孔中，每孔加100μl，然后静置于35℃孵育48h。
4.最低抑菌浓度（MIC）和分数抑菌浓度（FIC）的判定：肉眼观察判断终点：96培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC。CLSI未制定烟曲霉菌对两性霉素B的MIC折点判读浓度，因而参考文献[7]的折点：MIC≤1μg/ml为敏感，MIC＞1μg/ml为耐药。选择最佳组合效果时两药各自的MIC甲药联合及MIC乙药联合。FIC的计算公式：FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用。FIC≤0.5表示两药为协同作用，0.5＜FIC≤1.0表示两药为相加作用，1.0＜FIC≤2.0表示两药为无关作用，FIC＞2.0表示两药为拮抗作用。
5.质控按照CLSI的建议选用ATCC22019近平滑念珠菌作为质控菌株，其对AMB的MIC参考范围是0.5-4μg/ml，本试验中质控菌株的AMB的MIC为2μg/ml，同时实验过程中菌株生长状态良好，结果可靠。实验重复3次，结果均一致。
6.统计学处理采用SPSS16.0统计软件，用Wilcoxon符号秩检验统计方法进行统计学分析，比较单用和联合用药时两种药物MICG的差异，当P＜0.05时差异有统计学意义。
实施例2
本实施例是实施例1耐药烟曲霉活性检测结果。
1.药敏结果AMB对7株烟曲霉菌株的MIC均为2μg/ml。
2.MIC值肉桂醛与AMB单用与联用对7株烟曲霉的MIC50、MIC90及MICG（表1），经统计学分析，AMB的MICG单用和MICG联合相比较得出Z=-2.414，P＜0.05；肉桂醛的MICG单用和MICG联合相比较得出Z=-2.384，P＜0.05。
表1肉桂醛与AMB单用与联用，对烟曲霉的MIC（μg/ml）
（n=7）
3.累积抑菌百分率曲线肉桂醛与AMB单用与联合应用浓度-累积抑菌百分率曲线（图1）
4.肉桂醛与AMB联合应用的FIC分布肉桂醛与AMB联合应用作用于7个烟曲霉菌株，FIC的分布情况（图2）。
Claims (3)
1.一种杀灭耐药烟曲霉的方法，其特征在于，包括制备药物、收集菌株、制备孢子悬液、药物敏感试验和联合药敏试验，具体检测步骤如下：
1）制备药物将4~5mg两性霉素B和300~500mg肉桂醛，分别用3~5ml100%的二甲亚砜溶解，并将溶液配成浓度为1280μg/ml和102400μg/ml，于-20~-25℃储存；
2）收集菌株收集烟曲霉菌株，质控菌株为近平滑念珠菌；
3）制备孢子悬液将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿上，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30mlMOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~3×106·孢子·ml-1，再用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；
4）药物敏感试验微量液基稀释法，将步骤1）制备的两性霉素B和肉桂醛分别置于无菌的2个96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓度，再将步骤3）制备的孢子悬液加入滴1至第10孔，每孔加入量为1ml，第11孔为步骤3）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为RPMI-1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，分别获得两性霉素B和肉桂醛的最低抑菌浓度MIC；
5）联合药物试验在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素B和肉桂醛，前8列加入两性霉素B和肉桂醛，加入两性霉素B的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，加入肉桂醛的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，第9列为步骤3）制备孢子悬液的生长对照孔，第10列为无菌对照孔，再将步骤3）制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列，每孔加入量为100μl，后静置于35~37℃培养48~50h，观察。
2.根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的方法，其特征在于，所述步骤5）含有两性霉素B和肉桂醛的96孔板预先制备好，保存在-20~-25℃下。
3.一种杀灭耐药烟曲霉的组合物，其特征在于，包括两性霉素B和肉桂醛，两性霉素B1/16-1/4MIC，肉桂醛1/32-1/4MIC。
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Non-Patent Citations (3)
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| 3种抑菌剂对蛇足石杉内生真菌黑曲霉的抑制效果研究;李德新 等;《安徽农业科学》;20111231;第39卷(第20期);12106-12107 * |
| 两性霉素B与大蒜素单独及联合应用抗烟曲霉菌的研究;周秀芝 等;《时珍国医国药》;20121231;第23卷(第6期);1564-1566 * |
| 肉桂醛和柠檬醛对烟曲霉细胞膜中麦角甾醇生物合成的影响;谢小梅 等;《中草药》;20060430;第37卷(第4期);530-532 * |
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