CN107261146B

CN107261146B - 一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物及其应用

Info

Publication number: CN107261146B
Application number: CN201710677893.7A
Authority: CN
Inventors: 罗劲; 陈一强; 孔晋亮
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: CN107261146A

Abstract

本发明公开一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物及其应用，属于微生物技术领域。所述的组合物为鱼腥草素钠和抗真菌药物，所述的抗真菌药物包括AMB、伏立康唑和伊曲康唑。所述药物组合连用时的鱼腥草素钠浓度为1/32×MIC~4×MIC，所述抗真菌药物浓度为1/32×MIC~4×MIC。本发明组合物联合产生的协同作用，既提高了药物对耐药烟曲霉菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌药物的使用剂量，进而降低毒副作用，是治疗抗真菌药物耐药烟曲霉感染的一种较为理想的药物组合物。

Description

一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物及其应用。

背景技术

随着人口老龄化进程加速，恶性肿瘤、艾滋病、器官移植等患者增加，介入诊疗技术广泛开展以及广谱抗生素、糖皮质激素大量使用，当前临床获得性深部真菌感染呈现快速发展的趋势，并已成为免疫低下患者主要死因之一。其中，烟曲霉感染率仅次于白色念珠菌，其所引起的侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis，IA）死亡率高达80%。全球微生物耐药监测结果显示，将近28.6%的烟曲霉对AMB（Amphotericin B，AMB）耐药，并已出现多重耐药菌株，耐药问题使临床IA的治疗面临严峻挑战。研究表明，三白草科中草药鱼腥草主要活性成分之一的鱼腥草素钠（化学结构：癸酰乙醛亚硫酸氢钠）具有较显著的抗真菌作用，且毒副作用少、来源广、价格低廉、不易诱导耐药，但其对AMB耐药烟曲霉是否同样具有抑制作用及与AMB联用的效果尚未见报道。本研究主要探讨鱼腥草素钠联合AMB对临床分离耐药烟曲霉的抗菌活性，旨在寻找能有效治疗耐药烟曲霉相关感染的新途径。

发明内容

本发明的目的是为了解决日益严峻的曲霉病，抑制烟曲霉引起的真菌感染，提供一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物及应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物，所述的组合物为鱼腥草素钠和抗真菌药物，所述鱼腥草素钠浓度为1/32×MIC~4×MIC，所述抗真菌药物浓度为1/32×MIC~4×MIC。

优选的，所述的抗真菌药物包括AMB、伏立康唑和伊曲康唑。

优选的，所述的组合物为鱼腥草素钠和AMB；所述鱼腥草素钠浓度为1/32×MIC~4×MIC，所述AMB的浓度为1/32×MIC~4×MIC。

优选的，所述的鱼腥草素钠需先预处理，将其溶解于100%无菌二甲基亚砜中，并经0.22μm滤膜滤过除菌后，储存于-80℃待用。

优选的，所述组合物预先制备成储存液，所述鱼腥草素钠配制成浓度为20-50mg/mL的储存液，AMB配制成浓度为3-7 mg/mL的储存液。

优选的，所述组合物使用时作用时间为24-48h，35℃恒温孵育。

优选的，所述鱼腥草素钠：抗真菌药物体积比为1：1。

优选的，所述的AMB为脱氧胆酸盐及其脂质体。

优选的，所述耐药曲霉菌为侵袭性耐药曲霉菌；所述侵袭性耐药曲霉菌为烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌和黑曲霉菌。

一种组合物在预防或杀灭烟曲霉的药物中的应用。

AMB及其脂质体曾作为传统治疗IA的首选药物，因在临床上被广泛、长期使用，使烟曲霉对AMB耐药现象日益严重，且该药大剂量应用会对机体产生明显的肾毒性。研究表明，抗真菌药物的联合应用在治疗由耐药菌株导致的难治性曲霉病时可表现为协同作用，因此可作为控制和减少耐药菌株产生的有效手段之一。寻找毒性较低的中药单体活性成分作为抗真菌药物的增效剂，增加菌体对药物的敏感性的同时，可减少大剂量用药给机体带来的毒副作用，亦为当今抗感染领域研究热点。

本研究结果显示，鱼腥草素钠与AMB联用的FICI值及相应等效曲线均体现协同作用，并使所有受试菌株AMB的MIC均降至≤1μg/mL的敏感范围，表明鱼腥草素钠在体外能增强AMB的抗烟曲霉活性，逆转耐药菌株的耐药性。两药MICG_联用较MICG_单用显著降低，且浓度-累积抑菌百分率曲线明显左移，证实同一药物在同一浓度下，联用比单用抑菌能力更强。利用联合用药产生的协同效应，既能提高药物抗菌效果，又能减少使用剂量，降低的毒副作用。因此，鱼腥草素钠与AMB联用是治疗AMB耐药烟曲霉感染一种较为理想的药物组合，本课题组后期拟通过进一步的动物体内试验深入挖掘其实用价值。

AMB的抗菌作用靶点主要是烟曲霉菌体细胞壁上的麦角固醇，而当烟曲霉麦角固醇合成基因发生突变，导致麦角固醇缺失或在细胞壁上的位置发生改变，可造成烟曲霉菌株对AMB耐药。鱼腥草素钠已被证实可抑制真菌细胞内毒力因子磷脂酶相关合成调控基因PLB1、PLB2和PLC1的转录水平，进而导致菌丝无法形成以及细胞膜的破裂。因此两药联用，可使药物作用靶点增加从而体现协同抗菌作用。此外，烟曲霉可在体外形成生物被膜结构，在胞外基质包被状态下，菌体的耐药性相对其浮游状态而言会明显升高，同时MDR4等外排泵基因的表达明显上调，可增强菌体对药物的外排作用。体外已研究表明，鱼腥草素钠可以抑制和破坏真菌生物被膜结构，使之变得疏松多孔，进而削除其屏障作用，可使抗菌药物易于渗入菌体内部并达到有效的蓄积量，增强杀菌作用。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

鱼腥草素钠具有单体成分具有毒副作用少，来源广，价格低廉，不易诱导耐药等优点，鱼腥草素钠在体外能增强抗真菌药物的抗烟曲霉活性，逆转耐药菌株的耐药性。两种药物的MICG_联用较MICG_单用显著降低，且联用的浓度-累积抑菌百分率曲线相对单用时明显左移，即同一药物在同一浓度下，联合应用比单用抑菌能力更强，仅需低于4~8倍MIC的两种药物联用即可达到与单药MIC相同的抑菌效果。可见由鱼腥草素钠与抗真菌药物联合产生的协同作用，既提高了药物对耐药菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌药物的毒副作用，是治疗抗真菌药物耐药烟曲霉感染的一种较为理想的药物组合物。

附图说明

图1是本发明实施例2鱼腥草素钠与AMB联用对7株烟曲霉的MIC等效曲线。

图2 是本发明实施例2鱼腥草素钠和AMB单用与联用的浓度-累积抑菌百分率曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1 耐药烟曲霉药物组合物试验

1.1 菌株来源实验菌株为2012年9月至2014年8月从本院临床送检标本中分离的7株烟曲霉（编号为AF5，AF14，AF15，AF17，AF18，AF26，AF32；其中痰标本5株，肺泡灌洗液1株，伤口分泌物1株），经乳酸酚棉兰染色形态学及48℃温度试验鉴定为经典烟曲霉，本院临床微生物检验中心进行药物敏感性试验后证实为AMB耐药菌株。质控菌株选用CLSI M38-A2指南指定的近平滑念珠菌ATCC22019。

1.2 主要试剂与仪器鱼腥草素钠（中国食品药品检定研究院，批号100247-199601）；AMB（Amresco公司，批号1397893）；RPMI-1640粉（Gibco公司）；3-（N-吗啉基）丙磺酸-4-吗啉丙磺酸（MOPS，Sigma公司）；马铃薯葡萄糖培养基（PDA，北京陆桥公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；96孔板（Corning公司）。

1.3 方法

1.3.1 孢子悬液的制备将7株AMB耐药烟曲霉复苏并转种于PDA斜面，37 ℃孵育3~4d，用含0.025% Tween20的PBS液冲洗斜面表面收集孢子，经MOPS缓冲后pH为7.0的RPMI-1640重悬孢子，血细胞计数板调节使悬液中孢子终浓度为2×10⁴CFU/mL。

1.3.2 配制药物鱼腥草素钠和AMB均用二甲基亚砜（DMSO）溶解，分别配制成浓度为25.6 mg/mL和3.2mg/mL的储存液，经0.22μm针头滤器滤过除菌后，储存于-80℃待用。

1.3.3 测定单药MIC 参照CLSI M38-A2指南的微量液基稀释法进行，鱼腥草素钠的工作浓度范围为2~256 μg/mL，AMB为0.03125~16 μg/mL。终点判读：与生长对照孔相比，肉眼观察到无真菌生长孔所对应的最低药物浓度为该药的MIC。计算MIC几何均数，以MICG_单用表示。

1.3.4 棋盘法联合药敏试验参照文献，将1/32×MIC~4×MIC的鱼腥草素钠和AMB两两组合加入96孔板，每孔50μL，再加入100μL制备好的孢子悬液，于35℃恒温孵育48h后判读结果，并计算MICG_联合，上述实验独立重复3次。

1.3.5 联合作用效果的评价以两药联用产生最佳抑菌效应时的MIC值作为各自的MIC_联合，计算分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）：FICI=甲药MIC_联合/甲药MIC_单用+乙药MIC_联合/乙药MIC_单用。FICI＞2.0表示有拮抗作用，1.0＜FICI≤2.0表示无关作用，0.5＜FICI≤1.0表示相加作用，FICI≤0.5表示协同作用，FICI越小，协同作用越强。将本法测得MIC结果绘制成等效线图，根据等效曲线的形状可以判断协同（凹形）、拮抗（凸形）、无关（直线）。分别统计两药单用和联用时各个浓度点的抑菌率，以浓度作为横坐标，以抑菌率作为纵坐标，绘制浓度-累积抑菌百分率曲线。

1.3.6 统计学分析用SPSS 16.0统计软件，通过Wilcoxon符号秩检验方法比较药物的MICG_单用与MICG_联合，以P＜0．05为差异有统计学意义。

实施例2 药物组合物试验结果

2.1 质控标准每次独立实验测得质控菌株ATCC 22019对AMB的MIC值为1μg/mL，在CLSI M38-A2指南规定的参考范围之内，且生长对照孔菌株生长良好，药敏试验结果可靠。

2.2 鱼腥草素钠与AMB单用及联用的MIC 按照CLSI推荐的ECVs标准判断受试烟曲霉对AMB的敏感性，以AMB的MIC≤1μg/mL为敏感，＞1μg/mL为耐药。两药单用及联用的MIC具体见表1。

表1 鱼腥草素钠与AMB单用或联用的MIC

注：^R表示菌株对AMB耐药

2.3 鱼腥草素钠与AMB联合作用评价鱼腥草素钠与AMB联用，对7株受试烟曲霉的FICI值为0.25～0.5，均体现协同作用，具体见表2。其相应等效曲线曲线均呈凹形，证实为协同作用，见图1。

表2 鱼腥草素钠与AMB联用效果的评价

菌株编号

FICI

评价

菌株编号

FICI

评价

AF5

0.375

协同

AF18

0.5

协同

AF14

0.3125

协同

AF26

0.25

协同

AF15

0.5

协同

AF32

0.375

协同

AF17

0.5

协同

2.4 两药单用与联用效果比较鱼腥草素钠与AMB联用后的MIC均较单用时下降4~16倍，尤其AMB对各菌株的MIC均由耐药水平降至敏感范围。AMB的MICG_联合＜MICG_单用（Z=-3.228，P＜0.05），鱼腥草素钠的MICG_联合＜MICG_单用（Z=-3.235，P＜0.05）。当鱼腥草素钠浓度为2μg/mL时，AMB浓度仅需≥ 1μg/mL，即可抑制全部7株烟曲霉生长。两药联用后相应浓度-累积抑菌百分率曲线均较单用时明显左移，见图2。

实施例3细胞毒性实验

取健康成人的肝素抗凝血1-3ml，用PH=7.0的PBS缓冲洗涤3次，并在温度20-25℃、转速2500rpm离心10min，去掉离心上清液后，加入PBS缓冲液，配成 10 % 的红细胞-PBS 悬液，再用PBS将该悬液按1：10 稀释，取500μL置于 EP 管中，加入500μL经PBS二倍连续稀释的鱼腥草素钠或阳性对照AMB。将EP管于37℃孵育1 h，温度20-25℃、转速2500rpm离心10min，取150μL上清转移至96 孔板中，用酶标仪在540nm波长处测吸光度A540。Triton X-100孔中以0.1% Triton X-100 处理后的红细胞作为100 % 完全溶血，阴性对照孔以含1%DMSO的红细胞-PBS 悬液作为0%溶血，具体见表3。溶血百分率（%）= (鱼腥草素钠或AMB孔A540－阴性对照孔A540)/(Triton X-100孔A540－阴性对照孔A540)×100%。

表3 不同浓度药物的溶血百分率(mean values%±SD，n= 3)

细胞毒性实验解释：以＜10%为未发生溶血，10%-25%为部分溶血，＞25%为发生明显溶血。实验结果表明，两种药物在上述各受试浓度下分别组合使用，均未观察到溶血效应。两种药物联用产生最佳协同抑菌效应时的最小药物浓度均不会造成溶血。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。

Claims

1.一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物的用途，其特征在于，所述的组合物为含鱼腥草素钠的液体和含抗真菌药物的液体，所述抗真菌药物为AMB，即两性霉素B，所述含鱼腥草素钠的液体中鱼腥草素钠浓度为1/32×MIC~4×MIC，所述含抗真菌药物的液体中抗真菌药物浓度为1/32×MIC~4×MIC，所述MIC为药物单用时的MIC。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的鱼腥草素钠需先预处理，将其溶解于100%无菌二甲基亚砜中，并经0.22μm滤膜滤过除菌后，储存于-80℃待用。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物预先制备成储存液，所述鱼腥草素钠配制成浓度为20-50mg/mL的储存液，AMB配制成浓度为3-7 mg/mL的储存液。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述含鱼腥草素钠液体：含抗真菌药物液体的体积比为1：1。