CN104474550A - 一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法，属于微生物技术领域。所述的药物组合物为柠檬醛和抗真菌药物，所述的抗真菌药物包括两性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑。一种杀灭耐药烟曲霉的方法，包括制备药物、制备孢子悬液、药物MIC测定和联合药敏试验。本发明药物组合物既提高了药物对耐药菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌药物的毒副作用，是治疗抗真菌药物耐药烟曲霉感染的一种较为理想的药物组合物。

Description

一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物以及杀灭耐药烟曲霉的方法。

背景技术

随着人口老龄化速度加快，恶性肿瘤、艾滋病、器官移植、糖尿病等患者急剧增加，导致了大量介入诊疗技术开展以及广谱抗生素与糖皮质激素的使用，当前临床获得性深部真菌感染呈现快速发展的趋势，并已成为免疫低下患者主要死因之一。由烟曲霉导致的侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）是恶性血液病、器官移植、艾滋病等免疫受损患者常见且致命的机会感染性疾病，病死率高达80%，耐药是导致治疗失败的一个重要原因。全球微生物耐药监测结果显示，将近28.6%的烟曲霉菌株对两性霉素B耐药，并且已经出现唑类耐药和多重耐药菌株，使临床IPA的治疗面临严峻挑战。如何控制耐药的烟曲霉菌引起的IPA已经成为了临床难题，研发出新的有效的药物是解决这个难题的一条途径，然而研发出新的有效药物是个过程及其漫长，难以应对目前耐药的严峻形势。如果某种药物能协同传统抗真菌药使后者发挥更强的抑制烟曲霉作用，那么对缓解耐药压力也将是很大的帮助，但目前还未见类似的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决日益严峻的曲霉病，抑制烟曲霉引起的真菌感染，提供一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物及其方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，所述的药物组合物为柠檬醛和抗真菌药物。

以上所述的柠檬醛为60-70%反式柠檬醛和30-40%顺式柠檬醛。

以上所述的抗真菌药物包括两性霉素B、伏立康唑、卡泊芬净和伊曲康唑。

以上所述的药物组合物的载体包括雾化吸入剂、注射剂、皮肤洗剂和体外消毒剂。 

以上所述的两性霉素B为脱氧胆酸盐及其脂质体。

两性霉素B、伏立康唑、卡泊芬净和伊曲康唑等抗真菌药物曾作为传统治疗IPA的首选药物，因在临床上被广泛、长期使用，使烟曲霉对抗真菌药物耐药现象日益严重，且抗真菌药大剂量应用会对机体产生明显的肾毒性。联合用药可作为控制和减少耐药菌株产生的有效手段之一，柠檬醛作为毒性较低的中药单体活性成分作为抗真菌药物的增效剂，能增加真菌对药物的敏感性，从而减少大剂量用药给机体带来的毒副作用。

如两性霉素B的抗菌作用靶点主要是烟曲霉菌体细胞壁上的麦角固醇，而当烟曲霉麦角固醇合成基因发生突变，导致麦角固醇缺失或在细胞壁上的位置发生改变，可造成烟曲霉菌株对AMB耐药。柠檬醛不仅可以破坏烟曲霉菌体细胞壁和细胞膜，阻碍分生孢子梗的形成，还能作用于细胞核等区域影响菌体DNA、RNA的合成，干扰正常的细胞周期，因此两药联用，可使药物作用靶点增加进而增强抗菌作用。由于两性霉素B为亲水性药物，较难透过菌体细胞膜的脂质双分子层，在作用靶位达到足够高的有效浓度。而柠檬醛为脂溶性药物，可自由通过细胞膜，一但两药联用，两性霉素B可借助柠檬醛对细胞壁和细胞膜的破坏作用，更容易渗透到菌体内部发挥氧化损伤作用，从而表现出协同抑菌作用。

烟曲霉可在体外形成生物被膜结构，在胞外基质包被状态下，菌体的耐药性相对其浮游状态而言会明显升高，同时MDR4等外排泵基因的表达明显上调，可增强菌体对药物的外排作用。柠檬醛不但可以抑制和破坏白色念珠菌生物被膜形成，减弱屏障作用，还具有药物外排泵抑制活性，可使抗菌药物易于渗入菌体内部并达到有效的蓄积量，增强其杀菌作用。

一种杀灭耐药烟曲霉的方法，使用以上所述的两性霉素B药物组合物，包括制备药物、制备孢子悬液、药物MIC测定和联合药敏试验，具体检测步骤如下：

1）制备药物 将两性霉素B和柠檬醛，分别二甲亚砜溶解，并将溶液配成浓度为3.2-6.4mg/L和700-819.2 mg/L，于-90~-70℃储存；

2）制备孢子悬液 收集烟曲霉菌株接种到PDA培养皿上，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用含0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗斜面表面收集孢子，用MOPS缓冲后pH为7.0的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，血细胞计数板调节使悬液中孢子终浓度为（1-10）×10⁴CFU/mL；

3）药物MIC测定 将步骤1）制备的两性霉素B和柠檬醛分别置于无菌的2个96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓度，再将步骤2）制备的孢子悬液加入滴1至第10孔，每孔加入量为1ml，第11孔为步骤2）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为RPMI-1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，分别获得两性霉素B和柠檬醛的最低抑菌浓度MIC；

4） 联合药物试验 在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素B和柠檬醛，前8列加入两性霉素B和柠檬醛，加入两性霉素B的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，加入柠檬醛的浓度为1/32~4MIC，添加的量各为50μl，第9列为100μl步骤2）制备孢子悬液的生长对照孔，第10列为无菌对照孔，再将步骤2）制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列，每孔加入量为100μl，后静置于35~37℃培养48~50h，观察。

根据以上任一项所述药物组合物在预防或杀灭烟曲霉的药物中的应用。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

柠檬醛具有单体成分具有毒副作用少，来源广，价格低廉，不易诱导耐药等优点，柠檬醛在体外能增强抗真菌药物的抗烟曲霉活性，逆转耐药菌株的耐药性。两种药物的MICG_联用较MICG_单用显著降低，且联用的浓度-累积抑菌百分率曲线相对单用时明显左移，即同一药物在同一浓度下，联合应用比单用抑菌能力更强，仅需低于4~8倍MIC的两种药物联用即可达到与单药MIC相同的抑菌效果。可见由柠檬醛与抗真菌药物联合产生的协同作用，既提高了药物对耐药菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌药物的毒副作用，是治疗抗真菌药物耐药烟曲霉感染的一种较为理想的药物组合物。

附图说明

图1是本发明实施例2柠檬醛与两性霉素B联合作用的MIC等效曲线。

图2 是本发明实施例2柠檬醛和两性霉素B单用与联用对7株两性霉素B耐药烟曲霉菌的浓度-累积抑菌百分率曲线。

具体实施方式

实施例1 耐药烟曲霉药物组合物试验

（1） 菌株来源  收集2013年9月至 2014年12月从广西医科大学第一附属医院临床送检标本中分离的7株烟曲霉（编号分别为AF5，AF14，AF15，AF17，AF18，AF26，AF32；其中痰标本5株，肺泡灌洗液1株，伤口分泌物1株），经乳酸酚棉兰染色形态学及48℃温度试验鉴定为经典烟曲霉，本院临床微生物检验中心进行药物敏感性试验证实均为两性霉素B（Amphotericin B，AMB）耐药菌株。质控菌株选用CLSI M38-A2指南指定的近平滑念珠菌ATCC22019。

（2） 活化菌株与制备孢子悬液  将7株AMB耐药烟曲霉临床株复苏并转种于PDA斜面，35-37 ℃孵育3-5d，用含0.025% 吐温20的PBS液冲洗斜面表面收集孢子，经MOPS缓冲后pH为7.0的RPMI-1640重悬孢子，血细胞计数板调节使悬液中孢子终浓度为2×10⁴CFU/mL。

（3）配制药物  柠檬醛和AMB均用二甲亚砜（DMSO）溶解，分别配制成浓度为819.2 mg/L和3.2mg/L的储存液，用0.22μm针头滤器滤过除菌后，分装并储存于-80℃待用。

（4）测定柠檬醛及AMB单用的MIC  参照CLSI M38-A2指南，将受试药物储存液用RPMI-1640液体培养基稀释为2倍工作浓度（其中柠檬醛的工作浓度范围为4~2048μg/mL，AMB为0.03125~16μg/mL），分别取100μL加入第1至第10列，第11列为不含药物的生长对照孔，第12列为不含药物且不含孢子的无菌对照孔。再往第1至第11列各孔加入100μL制备好的孢子悬液。将完成加样的96孔板静置于35℃恒温培养箱孵育48h后判读结果，并计算两种药物单用对7株受试烟曲霉的MIC几何均数（minimum inhibitory concentration geometric mean，MICG），以MICG_单用表示。实验独立重复3次。

（5）柠檬醛与AMB联合药敏试验  用RPMI-1640液体培养基将受试药物储存液稀释为4倍工作浓度，并根据测得两种药物单用的MIC值配制棋盘式微量液基稀释法药敏孔板，药物工作浓度范围为受试菌株的1/32×MIC~4×MIC。将不同浓度的柠檬醛和AMB两两组合加入96孔板，每种药物加入50μL，再将制备好的孢子悬液100μL加入各孔中，并按上述方法设置生长对照孔和无菌对照孔。将完成加样的96孔板置于35℃恒温培养箱孵育48h后判读结果，并计算两种药物联合应用对7株受试烟曲霉的MICG_联合，实验独立重复3次。

（6）MIC值的判定  将96孔板置于酶标仪，在405nm波长处测定各孔的光密度(optical density，OD)值。真菌生长百分率（％）=（各孔OD值－无菌对照孔OD值）/（生长对照孔OD值－无菌对照孔OD值）×100％，抑菌百分率=1－生长百分率。取抑菌百分率在90％以上的最低药物浓度为MIC值。

（7） 评价柠檬醛与AMB联合的作用效果  本实验采用FICI对棋盘式微量液基稀释法的测得的结果进行评价：选择两种药物联合产生最佳抑菌效应时各自的MIC值作为各自的MIC_联合，计算出部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI），FICI的计算公式：FICI=甲药MIC_联合/甲药MIC_单用+乙药MIC_联合/乙药MIC_单用。FICI＞2.0表示有拮抗作用，1.0＜FICI≤2.0表示为无关作用，0.5＜FICI≤1.0表示为相加作用，FICI≤0.5表示为协同作用，且FICI越小，其协同作用越强。将棋盘法测得两种药物对各个菌株的MIC结果绘制成等效线图，根据等效曲线的形状可以判断协同（凹形）、拮抗（凸形）、无关（直线）。

分别统计柠檬醛、AMB单用和联合应用时对所有受试AMB耐药烟曲霉各个浓度点的抑菌率，以浓度作为横坐标，以抑菌率作为纵坐标，绘制浓度-累积抑菌百分率曲线。

（8） 统计学分析 用SPSS 16.0统计软件，通过Wilcoxon符号秩检验方法比较药物的MICG_单用与MICG_联合，以P＜0．05为差异有统计学意义。

实施例2 药物组合物试验结果

（1）质控标准  每次独立实验所测得质控菌株ATCC 22019对AMB的MIC值为1μg/mL，在CLSI M38-A2指南规定的参考范围之内，且生长对照孔菌株生长良好，药敏试验结果可靠。

（2 ）柠檬醛与AMB单用及联用的MIC  按照CLSI推荐的ECVs标准判断受试烟曲霉对AMB的敏感性，以AMB的MIC≤1μg/mL为敏感，＞1μg/mL为耐药。AMB单用时对受试菌株MIC范围在2~4μg/mL，即本实验7株受试烟曲霉均对AMB耐药。柠檬醛单用的MIC值为256~512μg/mL。具体见表1。

表1 柠檬醛与AMB单用或联合作用于7株AMB耐药烟曲霉的MIC值

   注：^R表示耐药

（3）柠檬醛与AMB联合作用评价 柠檬醛与AMB联用时，对7株受试烟曲霉的FICI值为0.375～0.5，表明柠檬醛与AMB在体外联合应用均表现为协同作用，具体见表2。其相应的等效曲线如图1所示：曲线均呈凹形，证实柠檬醛与AMB具有协同作用。

表2 FICI法评价柠檬醛与AMB联用作用效果 

菌株编号

FICI

评价

菌株编号

FICI

评价

AF5

0.5

协同

AF18

0.375

协同

AF14

0.375

协同

AF26

0.375

协同

AF15

0.5

协同

AF32

0.5

协同

AF17

0.5

协同

（4） 柠檬醛及AMB单用与联用的作用效果比较  柠檬醛与AMB联用后，柠檬醛对受试菌株的MIC范围为64~128μg/mL，较单用时下降了4~8倍；AMB的MIC则由耐药水平降至敏感范围以下（0.25~1μg/mL），且终点清晰。AMB的MICG_联合＜MICG_单用（Z=-3.282，P＜0.05），柠檬醛的MICG_联合＜MICG_单用（Z=-3.343，P＜0.05）。柠檬醛联合AMB的MIC：当柠檬醛浓度为64μg/mL时，AMB浓度只要≥ 0.5μg/mL，即可抑制全部7株烟曲霉生长；当柠檬醛浓度为128μg/mL时，AMB浓度只要≥1μg/mL即可抑制全部7株烟曲霉生长。由图2可见，柠檬醛与两性霉素B联用后，相应浓度-累积抑菌百分率曲线均较单用时明显左移。

实施例3细胞毒性实验

取健康成人的肝素抗凝血1-3ml，用PH=7.0的PBS缓冲洗涤3次，并在温度20-25℃、转速2500rpm离心10min，去掉离心上清液后，加入PBS缓冲液，配成 10 % 的红细胞-PBS 悬液，再用PBS将该悬液按1：10 稀释， 取500μL置于 EP 管中， 加入500μL经PBS二倍连续稀释的柠檬醛或阳性对照两性霉素B。将EP管于37℃孵育1 h，温度20-25℃、转速2500rpm离心10min，取150μL上清转移至96 孔板中，用酶标仪在540nm波长处测吸光度A₅₄₀。Triton X-100孔中以0.1% Triton X-100 处理后的红细胞作为100 % 完全溶血，阴性对照孔以含1%DMSO的红细胞-PBS 悬液作为0%溶血。溶血百分率（%）= (柠檬醛或两性霉素B孔A₅₄₀－阴性对照孔A₅₄₀)/(Triton X-100孔A₅₄₀－阴性对照孔A₅₄₀)×100%。

表3 不同浓度药物的溶血百分率(mean values%±SD，n= 3)

细胞毒性实验解释：以＜10%为未发生溶血，10%-25%为部分溶血，＞25%为发生明显溶血。实验结果表明，仅柠檬醛浓度在2048μg/mL时，无论单用或联用发生部分溶血，而其他浓度两种药物联用均不会发生溶血，即两种药物联用产生最佳协同抑菌效应时的最小药物浓度均不会造成溶血。

Claims (7)

1.一种杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为柠檬醛和抗真菌药物。

2.根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的柠檬醛为60-70%反式柠檬醛和30-40%顺式柠檬醛。

3.根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的抗真菌药物包括两性霉素B、伏立康唑、卡泊芬净和伊曲康唑。

4.根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的载体包括雾化吸入剂、注射剂、皮肤洗剂和体外消毒剂。

5.根据权利要求3所述的杀灭耐药烟曲霉的药物组合物，其特征在于，所述的两性霉素B为脱氧胆酸盐及其脂质体。

6.一种杀灭耐药烟曲霉的方法，其特征在于，使用权利要求3所述的两性霉素B药物组合物，包括制备药物、制备孢子悬液、药物MIC测定和联合药敏试验，具体检测步骤如下：

1）制备药物 将两性霉素B和柠檬醛，分别二甲亚砜溶解，并将溶液配成浓度为3.2-6.4mg/L和700-819.2 mg/L，于-90~-70℃储存；

2）制备孢子悬液 收集烟曲霉菌株接种到PDA培养皿上，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用含0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗斜面表面收集孢子，用MOPS缓冲后pH为7.0的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，血细胞计数板调节使悬液中孢子终浓度为1-10×10⁴CFU/mL；

3）药物MIC测定 将步骤1）制备的两性霉素B和柠檬醛分别置于无菌的2个96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓度，再将步骤2）制备的孢子悬液加入滴1至第10孔，每孔加入量为1ml，第11孔为步骤2）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为RPMI-1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，分别获得两性霉素B和柠檬醛的最低抑菌浓度MIC；

4） 联合药物试验 在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素B和柠檬醛，前8列加入两性霉素B和柠檬醛，加入两性霉素B的浓度为1/32~4MIC，添加的量为50μl，加入柠檬醛的浓度为1/32~4MIC，添加的量各为50μl，第9列为100μl步骤2）制备孢子悬液的生长对照孔，第10列为无菌对照孔，再将步骤2）制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列，每孔加入量为100μl，后静置于35~37℃培养48~50h，观察。

7.根据权利要求1-5任一项所述药物组合物在预防或杀灭烟曲霉的药物中的应用。