CN102218052B - 山奈酚作为抗真菌药物增效剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，是山奈酚作为抗真菌药物增效剂的新用途。所说的抗真菌药物为唑类或多烯类抗真菌药物，山奈酚在抗真菌药物有效浓度中加入量为0.5-16μg/ml。实验表明，山奈酚与氟康唑、酮康唑、咪康唑或两性霉素B等抗真菌药物合用时，不仅能在减少用药量的情况下确保其对真菌的抗菌效果，并能使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，因此可用作抗真菌药物的增效剂。山奈酚作为抗真菌药物的增效剂，可降低唑类或多烯类等抗真菌药物的用药剂量，从而减轻了药物的毒副作用，尤其是使抗真菌药物恢复对耐药真菌的抗菌作用，有效治疗真菌感染特别是耐药性真菌感染，具有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是山奈酚作为抗真菌药物增效剂的新用途。
背景技术
唑类(包括咪唑类、三唑类)及多烯类等抗真菌药物是临床上常用的能有效治疗深部及浅表部真菌感染的抗真菌药，如咪唑类中的酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑等；三唑类中的氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等；多烯类中的两性霉素B等。但由于众所周知的原因，临床上的耐药菌株越来越普遍，致使不得不加大用药剂量，某些抗真菌药物甚至加大用药量也无效。加大用药剂量必然会增加毒副作用，尤其如酮康唑等对肝脏或心脏有毒副作用的药物，从而限制了这些药物在临床上的应用。
山奈酚(Kaempferol)，又名3，4’，5，7-四羟基黄酮，主要来源于姜科植物山奈或小檗科植物窝儿七的根茎，属于黄酮醇类，存在于多种植物中，其结构如式(I)所示。
药理实验表明，山奈酚具有多种生物学活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等。但至今未见山奈酚可作为唑类或多烯类等抗真菌药物增效剂的报道。
发明内容
本发明的目的是对山奈酚提供一种作为抗真菌药物增效剂的新用途。所说的抗真菌药物是唑类或多烯类等抗真菌药物，山奈酚的用量为在抗真菌药物有效浓度中加入0.5～16μg/ml或0.5～16μg/mg，优选用量为2μg/ml～8μg/ml或2μg/ml～8μg/mg。例如，在每毫升含氟康唑、酮康唑、咪康唑或两性霉素B 0.031～1微克的液体制剂中，加入山奈酚0.5～16微克；或者在每毫克含氟康唑、酮康唑、咪康唑或两性霉素B 0.031～1微克的固体制剂中加入山奈酚0.5～16微克。
经实验表明，当抗真菌药物与山奈酚合用时，山奈酚能降低抗真菌药物的用药剂量，不仅能在减少抗真菌药物用药量的情况下确保其对真菌的抗菌效果，而且对于临床分离的耐药性菌株或实验室诱导的耐药性菌株均具有明显的增效作用，还能使已被认为治疗无效的抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此山奈酚可用作抗真菌药物的增效剂，用于不同深部或浅表真菌感染的治疗。
本发明为山奈酚开辟了一种新用途，作为抗真菌药物的增效剂，可降低唑类或多烯类等抗真菌药物的用药剂量，从而减轻了药物的毒副作用，特别是氟康唑、酮康唑、咪康唑及两性霉素B等。尤其是山奈酚作为抗真菌药物的增效剂，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，有效治疗真菌感染特别是耐药性真菌感染，具有重要的临床应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于实施例。
实施例1：山奈酚和氟康唑合用对不同临床真菌株的作用。
材料和方法
1.试药：
山奈酚：中国药品生物制品检定所(下同)。
氟康唑：辉瑞制药有限公司(下同)。
二甲亚砜：中国医药(集团)上海化学试剂公司。
山奈酚的浓度为8mg/ml，氟康唑的浓度为2mg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
2.菌株：
白念珠菌、克柔氏念珠菌和羊毛状小孢子菌临床株，由上海长海医院真菌室提供，均经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，于35℃培养1周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
3.培养液：
RPMI 1640培养液：RPMI 1640(Gibco BRL公司)10.0g，NaHCO32.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH调pH至7.0，定容至1000ml，滤过消毒，4℃保存。
沙堡葡萄糖琼脂(SDA)培养基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
YEPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
4.仪器：
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)；
5.菌液制备：
(1)念珠菌菌液
从4℃保存的SDA培养基上挑取念珠菌少量，接种至1mlYEPD培养液，于30℃以200rpm振荡培养活化，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化16小时后，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至3×103～5×103个/ml。
(2)羊毛状小孢子菌菌液
从4℃保存的SDA培养基上挑取丝状菌少量接种至SDA斜面，于35℃培养一周后，再次挑取少量接种至SDA斜面，于35℃培养一周。实验前加适量RPMI 1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于RPMI 1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI 1640培养液调整孢子浓度至3×103～5×103个/ml的浓度。
6.药敏板制备：
取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640培养液100μl作空白对照；3～11号孔加入新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加入菌液196μl和氟康唑溶液2μl。在2号孔加入相应浓度的山奈酚2μl，3～11号孔加入山奈酚1μl。
对2～11号孔进行倍比稀释，使2～11号孔的最终氟康唑浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml；1号孔为不含药物的RPMI 1640培养液，作为阴性对照，12号孔为不含药物的菌液100μl，作为阳性对照。各药敏板于30℃培养。
7.MIC80值判定：
含菌96孔板分别于30℃培养24小时或一周后，按常规用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。
当药物的MIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“＞64μg/ml”。上述实验均平行操作2到3次，当MIC80值能准确重复时才被接受；当MIC80值相差一个浓度以上时，则需要重新实验，直到符合要求为止。
实验结果见表1，表2。
表1山奈酚与氟康唑单用和合用时，5株临床白念珠菌的MIC80值
注：Flu表示氟康唑(下同)。
表2山奈酚与氟康唑单用和合用时，3株临床克柔氏念珠菌和羊毛状小孢子菌的MIC80值
由表1和表2可见，合用时，0.5～4μg/ml的山奈酚可使白念珠菌对氟康唑的MIC80值下降16～64倍，4～8μg/ml的山奈酚可使临床克柔氏念珠菌和羊毛状小孢子菌对氟康唑的MIC80值从≥32降为≤0.25，说明山奈酚能明显增强氟康唑的抗真菌作用。
实施例2：山奈酚与氟康唑合用对不同临床和实验室诱导耐药株的作用
材料和方法
1.试药：
山奈酚和氟康唑来源同上。
二甲亚砜：中国医药(集团)上海化学试剂公司。
山奈酚的浓度为8mg/ml，氟康唑的浓度为2mg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
2.菌株：
临床耐药株：白念珠菌，由上海长海医院真菌室提供，经形态学和生化学鉴定确认。
实验室诱导耐药株：白念珠菌(SC5314-R、Y01-R)为白念珠菌标准株SC5314、ATCC76625经氟康唑诱导形成的耐药株，经形态学和生化学鉴定确认。
其它实验步骤与方法同实施例1。
实验结果见表3，表4。
表3山奈酚与氟康唑单用和合用时，2株实验室诱导白念珠菌耐药株的MIC80值
表4山奈酚与氟康唑单用和合用时，5株临床白念珠菌耐药株的MIC80值
由表3、表4可以看出，原先对氟康唑耐药的临床白念珠菌MIC80值≥64，合用时，2～16μg/ml的山奈酚即可使氟康唑的MIC80值下降为0.062～0.25μg/ml，对实验室诱导的白念珠菌，合用时，1～2μg/ml的山奈酚即可使氟康唑的MIC80值下降为0.125μg/ml，表明山奈酚能使菌株恢复对药物的敏感性，大大增强氟康唑的抗菌效力。
实施例3：山奈酚与咪康唑、酮康唑的联合用药
材料和方法
1.试药：
山奈酚：中国药品生物制品检定所。
氟康唑：辉瑞制药有限公司。
酮康唑：中国药品生物制品检定所。
咪康唑：中国药品生物制品检定所。
二甲亚砜：中国医药(集团)上海化学试剂公司。
山奈酚的浓度为8mg/ml，咪康唑和酮康唑的浓度为6.4mg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
其它实验步骤与方法同实施例1。
实验结果见表5，表6。
表5山奈酚与咪康唑单用和合用时，3株临床白念珠菌耐药株的MIC80值
注：Micon表示咪康唑。
表6山奈酚与酮康唑单用和合用时，3株临床白念珠菌耐药株的MIC80值
注：Ketocon表示酮康唑。
由表5、6可见，山奈酚不但可对氟康唑合用产生增效作用，而且对咪康唑、酮康唑等抗真菌药同样具有抗菌增效作用。合用时，1～8μg/ml的山奈酚即可使咪康唑、酮康唑对耐药白念珠菌的MIC80值从32～64μg/ml下降为0.125～0.5μg/ml。
实施例4：山奈酚与两性霉素B的联合用药
材料和方法
1.试药：
山奈酚：中国药品生物制品检定所。
氟康唑：辉瑞制药有限公司。
两性霉素B：中国药品生物制品检定所。
二甲亚砜：中国医药(集团)上海化学试剂公司。
山奈酚的浓度为8mg/ml，两性霉素B的浓度为6.4mg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
其它实验步骤与方法同实施例1。
实验结果见表7。
表7山奈酚与两性霉素B单用和合用时，5株临床白念珠菌的MIC80值
注：AmB表示两性霉素B。
由表7可见，山奈酚不但可与唑类抗真菌药物合用产生增效作用，而且对多烯类抗真菌药物两性霉素B同样具有抗菌增效作用。合用时，2～8μg/ml的山奈酚即可使两性霉素B对白念珠菌的MIC80值从1～2μg/ml下降为0.062～0.031μg/ml。
综上所述，山奈酚与唑类或多烯类抗真菌药物合用能产生增效作用，因此可用作唑类或多烯类抗真菌药物的增效剂。
Claims (3)
1.山萘酚在制备唑类或多烯类抗真菌药物增效剂中的应用，所说的唑类或多烯类抗真菌药物为氟康唑、酮康唑、咪康唑或两性霉素B。
2.根据权利要求1所述的山萘酚在制备唑类或多烯类抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于山萘酚在抗真菌药物有效浓度中的加入量为0.5～16μg/ml或0.5～16μg/mg。
3.根据权利要求2所述的山萘酚在制备唑类或多烯类抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于山萘酚在抗真菌药物有效浓度中的加入量为2μg/ml～8μg/ml或2μg/ml～8μg/mg 。
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