CN107412227B - 一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用及抗真菌组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用及抗真菌组合物，属于医药技术领域。其中，所述的蒽醌类化合物为9,10‑二氧代‑N‑(5‑苯基噻唑‑2‑基)‑9,10‑二氢蒽‑2‑磺酰；体外细胞实验表明，该蒽醌类化合物对临床多种真菌株均表现良好的抗真菌作用，能明显降低抗真菌药物的用药剂量，并增强对耐药真菌的抑制作用，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。

Description

一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用及抗真菌组 合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用及抗真菌组合物。

背景技术

近年来，由于免疫抑制剂、广谱抗生素、肿瘤化疗药物和激素类药物在临床上的广泛应用、艾滋病和糖尿病的发病率不断上升，免疫功能低下者不断增多，深部真菌感染率大幅上升。深部真菌感染作为一种并发病，已成为上述免疫功能低下患者死亡的主要原因。目前可供临床选择的治疗深部真菌感染的药物较少，毒副作用(如两性霉素的肾毒性、唑类药物的肝毒性等)又大大限制了临床应用，再加上目前广泛应用抗真菌药物导致的日益严重的耐药现象使得深部真菌感染成为临床上的棘手难题。因此，亟需开发新型抗真菌药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，体外细胞实验表明，该蒽醌类化合物对临床多种真菌株均表现良好的抗真菌作用。

本发明的目的还在于提供一种抗真菌组合物，其能明显降低抗真菌药物的用药剂量，并增强对耐药真菌的抑制作用，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，所述蒽醌类化合物的结构如下：

优选地，所述抗真菌药物为抑制真菌增殖的药物。

优选地，所述真菌为白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌中的一种或多种。

优选地，所述抗真菌药物为杀灭真菌的药物。

优选地，所述真菌为白色念珠菌。

一种抗真菌组合物，包括唑类抗真菌药物和蒽醌类化合物；蒽醌类化合物的结构式如下：

优选地，所述唑类抗真菌药物为氟康唑。

优选地，按照重量计，唑类抗真菌药物与蒽醌类化合物的比例为1:(0.25～8)。

优选地，按照重量计，唑类抗真菌药物与蒽醌类化合物的比例为1:4。

优选地，所述蒽醌类化合物作为抗菌增效剂。

优选地，所述抗真菌组合物是用于抗耐药菌株的组合物，所述耐药菌株是指对氟康唑耐受的菌株。

优选地，所述抗真菌组合物是用于抗敏感菌株的组合物，所述敏感菌株是指对氟康唑敏感的菌株。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，其为9,10-二氧代-N-(5-苯基噻唑-2-基)-9,10-二氢蒽-2-磺酰胺开辟了新的用途，为真菌治疗提供了新的候选药物。

本发明提供的一种抗真菌组合物，其将9,10-二氧代-N-(5-苯基噻唑-2-基)-9,10-二氢蒽-2-磺酰胺与唑类抗真菌药物联合应用，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

通过前期细胞筛选实验，我们发现了一种蒽醌类化合物1(全称为9,10-二氧代-N-(5-苯基噻唑-2-基)-9,10-二氢蒽-2-磺酰胺)具有较好的体外抗真菌活性，且该化合物1与其他抗真菌药物合用时，具有协同抗真菌作用。现代药理研究显示，目前国内外未见该化合物1作为抗真菌药物及其增效剂治疗真菌病的报道。化合物1(9,10-二氧代-N-(5-苯基噻唑-2-基)-9,10-二氢蒽-2-磺酰胺)的结构如下：

实施例1.化合物1对不同临床真菌株的作用

材料和方法

1.试药：

化合物1：来自实验室内部化合物数据库。

氟康唑：Sigma公司，批号460M4707V。

二甲亚砜：上海世仪生物科技有限公司。

各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。

2.菌株：

临床株：1)白色念珠菌，2株；2)近平滑念珠菌，1株；3)光滑念珠菌，1株；4)新生隐球菌，1株，5)烟曲霉菌，1株，6)红色毛癣菌，1株，7)石膏样小孢子菌，1株。菌株均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于30℃培养2周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。将丝状菌接种至SDA斜面，37℃培养两周。按以上方法活化两次后备用。

3.培养液：

1)RPMI 1640液体培养液：

RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO₃ 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g(0.165mol/L)，加三蒸水900mL溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)：

蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

3)YEPD培养液：

酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

4.仪器设备：

Multiskan MK3型酶标检测仪(芬兰Labsystems产品)；

隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；

THZ－82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；

SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；

5.化合物1和氟康唑贮备液：

将化合物1和氟康唑用DMSO溶解，配成浓度6.4mg/mL，于-20℃保存备用。6.菌液制备：

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上分别挑取白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等各球状菌少量，分别接种至1mL YEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mLYEPD培养液中，用上述方法再次活化，培养16h，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液分别调整各菌液浓度至1×10³～5×10³CFU/mL。

将丝状菌接种至SDA斜面，37℃培养两周。按以上方法活化两次后，加适量RPMI1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至1×10³～5×10³个/ml，实验备用。

7.药敏板制备：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μL；2号孔加菌液198μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。在每排的2号孔加母液浓度为6.4mg/mL的化合物1或氟康唑2μL。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终化合物1药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL，氟康唑的药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

8.MIC₈₀值判定：

在30℃恒温箱中，念珠菌培养24h，新生隐球菌培养72h，其他丝状真菌在37℃恒温箱中培养一周，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC₈₀(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的MIC₈₀值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：如以氟康唑为例，MIC₈₀值高于最高浓度64μg/mL时，计为“>64μg/mL”；MIC₈₀值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/mL”。

上述实验均平行操作2到3次，当MIC₈₀值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC₈₀值；当MIC₈₀值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。实验结果展示在表1中，

表1化合物1对各种临床真菌的MIC₈₀值(μg/mL)

注：FLC表示氟康唑

由表1可见，化合物1对各种临床真菌株均具有较好的体外抗真菌作用。化合物1单用时对白色念珠菌的MIC₈₀值为8μg/mL，对近平滑念珠菌的MIC₈₀值为8μg/mL，对光滑念珠菌的MIC₈₀值为2μg/mL，对新生隐球菌的MIC₈₀值为0.25μg/mL，对烟曲霉菌的MIC₈₀值为64μg/mL，对红色毛癣菌的MIC₈₀值为1μg/mL，对石膏样小孢子菌的MIC₈₀值为0.25μg/mL。

9.白念珠菌存活实验：

挑取白色念珠菌克隆于1mL YEPD中，200rpm，30℃培养16h。PBS清洗三次。用新鲜培养基重悬，调整菌终浓度为1×10⁵CFU/mL，分别加入不同的药物，使氟康唑的终浓度为32μg/mL，或者化合物1的终浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL，空白组加同量的DMSO。30℃，200rpm培养，在不同时间点(0h，12h，24h，48h)取菌液，稀释，涂铺于SDA平板，30℃培养48h后，数菌克隆，计算菌数的log₁₀CFU/mL。实验结果展示在表2中：

表2化合物1对白色念珠菌的杀菌作用

由表2可见，化合物1不仅单用对各种真菌具有抑菌作用，而且对白色念珠菌体外还表现杀菌作用。白色念珠菌在培养48h后，菌数的log₁₀CFU/mL值由开始的5.13变为8.29，当白色念珠菌在氟康唑(32μg/mL)药物作用48h后，白色念珠菌的存活数log₁₀CFU/mL值由开始的5.13变为7.20，而8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的化合物1分别作用白色念珠菌48h后，白色念珠菌的存活数log₁₀CFU/mL值由开始的5.13分别降为3.34，2.30和0.00，显示了化合物1对白色念珠菌的杀菌作用。

实施例2.化合物1与氟康唑合用对不同临床真菌株的作用

实验方法：

1、药物，菌株，材料同实施例1；

2、实验步骤：

将临床耐药白念珠菌103及敏感白念珠菌Y0109，近平滑念珠菌，光滑念珠菌和新生隐球菌分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；2～11号孔为含有不同浓度药物组合的菌液，最终联合应用的化合物1药物浓度分别为16、8、4、2、1μg/mL，联合应用氟康唑的药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

MIC₈₀值判定同实施例1。实验结果展示在表3中。

表3化合物1与氟康唑联合对临床真菌的MIC₈₀值(μg/mL)

注：FLC表示氟康唑

由表3可见，化合物1不仅单用对各种真菌具有抑菌作用，而且与抗真菌药物氟康唑协同具有抗菌增效作用。氟康唑单用对其他酵母真菌的MIC₈₀值为0.25～>64μg/mL，化合物1MIC₈₀值为0.25～8μg/mL。两药合用后，氟康唑的MIC₈₀值对各菌株的MIC₈₀值下降到≤0.125～0.25μg/mL，化合物1下降至0.25～2μg/mL，显示了化合物1对氟康唑的增效作用。尤其对于临床耐药白念珠菌103，氟康唑对其的MIC₈₀超过64μg/mL，而当加入有化合物1时，氟康唑对其的MIC₈₀为0.25μg/mL；FICI仅为0.127，这表明，化合物1与氟康唑联合用药时产生了协同作用，并使得氟康唑对临床耐药的白念珠菌103重新恢复有效性。

上述实验结果表明该化合物1具有单用和联合抗真菌药物治疗真菌感染的作用，因此可用作抗真菌药物及其增效剂。

Claims (10)

1.一种蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述蒽醌类化合物的结构如下：

2.如权利要求1所述的蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物为抑制真菌增殖的药物。

3.如权利要求2所述的蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述抗真菌药物为杀灭真菌的药物。

5.如权利要求4所述的蒽醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌。

6.一种抗真菌组合物，其特征在于，包括唑类抗真菌药物和蒽醌类化合物；蒽醌类化合物的结构式如下：

7.如权利要求6所述的抗真菌组合物，其特征在于，所述唑类抗真菌药物为氟康唑。

8.如权利要求6所述的抗真菌组合物，其特征在于，按照重量计，唑类抗真菌药物与蒽醌类化合物的比例为1:(0.25～8)。

9.如权利要求8所述的抗真菌组合物，其特征在于，按照重量计，唑类抗真菌药物与蒽醌类化合物的比例为1:4。

10.如权利要求6所述的抗真菌组合物，其特征在于，所述蒽醌类化合物作为抗菌增效剂。