CN103083290B - 木霉酸在制备抗真菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了木霉酸在制备抗真菌药物中的应用。本发明发现木霉酸对致病真菌白色念珠菌或植物病原真菌胶孢炭疽菌都具有很强的抑制作用，表明木霉酸具有较好的抗真菌活性，具有良好的应用开发前景。因此，本发明为研究与开发新的抗真菌药物提供了候选药物，为开发利用植物内生真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及木霉酸（Trichodermic acid）在制备抗真菌药物和作为抗真菌药物活性成分的应用。
背景技术：
白色念珠菌(Candida albicans)是一种重要的条件致病性真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式（芽生菌丝相）侵入细胞引起疾病。近年来，由于广谱抗生素、免疫抑制剂、细胞毒药物的广泛应用，导管介入、器官移植、静脉营养等治疗手段的普及以及血液病、糖尿病、老年病、恶性肿瘤、艾滋病等临床严重疾病的发生率不断上升，使深部真菌感染日益增多。白色念珠菌是引起深部真菌感染的一种最常见条件致病菌。日益严重的耐药现象和有限的治疗药物使白色念珠菌感染成为临床上迫切需要解决的问题。
炭疽菌是世界性的植物病原真菌，对许多作物构成严重威胁，尤其在热带、亚热带地区，有多种炭疽菌可以引起作物炭疽病，其中胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是炭疽菌属内最大的一个种，其分布广泛，危害寄主种类繁多，是一类重要的植物病原真菌。目前植物真菌病害仍以有机合成的化学药剂防治为主，但大量化学农药的使用，不但对人类环境造成了严重危害，而且增加了病原真菌的抗药性。因此，生物防治逐渐成为病害防治研究中的主要领域，从微生物资源中寻找新的活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化合物保护作物已成为当前研究的重点。
植物内生真菌能产生结构丰富多样的次级代谢产物,这些代谢产物的结构有些与宿主的某些代谢产物相同或相似，具有潜在的药用价值，从中发现的新结构化合物已成为发现天然活性物质的重要资源。近年来在植物内生真菌中发现的活性产物的结构类型主要有萜类、生物碱类、醌类、黄酮类、异香豆素类、内酯类、木脂素类、酚类、多肽类、甾体化合物等,这些代谢产物的生物活性有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗疟、抗病毒、杀虫、酶抑制剂、调节植物生长等,在医药、农业和工业等各个领域都展现出良好的应用前景，而且植物内生真菌是一类可持续利用的资源，对自然资源破坏极少,能够解决自然资源不足的问题。
木霉酸为首次从白木香内生真菌螺旋木霉（Trichoderma spirale）A17中的发酵液活性组分中分离、纯化得到，其化学名为：(2E,4E)-5-((1S,2S,4aR,6R,7S,8S,8aS)-7-hydroxy-2,6,8-trimethyl-1,2,4a,5,6,7,8,8a-octahydronaphthalen-1-yl)-2-methylpenta-2,4-dienoic acid；结构式如（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
木霉酸的分离纯化和结构鉴定过程公开于文献“1株白木香内生真菌中抗肿瘤活性成分的分离纯化和结构鉴定”[李冬利等，微生物学杂志，2010，30（6）:1-5]，文中还报道了木霉酸对SF-268、MCF-7和NCI-H460三种肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制活性。木霉酸的结构与专利“Octahy dronaphtalene derivative and medicine”[Yamada N.2007,US20070142539A1]中的一个化合物的结构一致，专利发明人Yamada N发现该化合物及其生成的衍生物能够抑制ICAM-1的表达，其中有一个衍生物对炎症性疾病和类风湿性关节炎具有很好的治疗作用，并且对A549、PC-3、As-PC-1和HT1080等肿瘤细胞的增殖具有抑制活性，但到目前为止，国内外文献尚未有关于木霉酸抗真菌活性的报道。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供木霉酸在制备抗真菌药物中的应用。
本发明通过抗白色念珠菌（Candida albicans）活性测试发现，木霉酸在2.5μg/disk含量下，对白色念珠菌标准菌株B7（ATCC10231）或临床菌株BB2的抑菌圈直径分别为10.6、12.3mm，阳性对照药物制霉菌素对上述2株白色念珠菌的抑菌圈分别为13.2、15.8mm；选择100、90、80、70、60、50、40、30、20μg/mL9个作用浓度下测定木霉酸或制霉菌素对白色念珠菌的最低抑制浓度（MIC值），确定木霉酸对白色念珠菌标准菌株B7（ATCC10231）或临床菌株BB2的MIC值分别为60、50μg/mL；制霉菌素对上述2株白色念珠菌的MIC值分别为50、40μg/mL。通过抗胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)活性测试发现，木霉酸在5μg/disk含量下，对胶孢炭疽菌的抑菌直径为49.7mm；选择800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL7个作用浓度下测定木霉酸对胶孢炭疽菌的最低抑制浓度（MIC值），确定木霉酸对胶孢炭疽菌的MIC值为100μg/mL。实验结果表明：木霉酸具有显著的抗真菌活性，可用于抗真菌药物。因此，木霉酸能应用于制备抗真菌药物中。
所述的抗真菌药物优选为抗白色念珠菌或胶孢炭疽菌的药物。
本发明的第二个目的是提供一种抗真菌药物，其特征在于，包含有效量的木霉酸作为活性成分。
所述的抗真菌药物优选为抗白色念珠菌或胶孢炭疽菌的药物。
本发明发现木霉酸对致病真菌白色念珠菌或植物病原真菌胶孢炭疽菌都具有很强的抑制作用，表明木霉酸具有较好的抗真菌活性，具有良好的应用开发前景。因此，本发明为研究与开发新的抗真菌药物提供了候选药物，为开发利用植物内生真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
采用滤纸片法测定木霉酸对致病菌白色念珠菌的抗菌活性。
将化合物木霉酸用DMSO溶解，并稀释至500μg/mL。
将液体发酵获得的白色念珠菌（Candida albicans）标准菌株B7（ATCC10231）和临床菌株BB2菌液分别用生理盐水分别稀释至106CFU/mL的浓度，吸取浓度为106CFU/mL的菌液1mL放入平板中，倒入已冷却至合适温度的PDA培养基，混合均匀。用无菌镊子夹取厚度为1.5mm、直径为6mm的滤纸片置于含菌平板上，同时在滤纸片上分别滴加木霉酸5μL作为样品组，以DMSO代替木霉酸作为空白对照组，以浓度为200μg/mL的制霉菌素作阳性对照组，将平板置于26℃恒温箱培养36h，用十字测量法测量抑菌圈直径的大小，重复三次，计算抑菌圈直径的平均值。
实验结果如表1所示：
表1：木霉酸（Trichodermic acid）对白色念珠菌的抑制作用
注：样品组每片滤纸含木霉酸2.5μg，阳性对照组每片滤纸含制霉菌素1μg。
实施例2
采用滤纸片法测定木霉酸对白色念珠菌最低抑菌浓度。
用DMSO将木霉酸或制霉菌素分别稀释至100、90、80、70、60、50、40、30、20μg/mL。吸取浓度为106CFU/mL的白色念珠菌（标准菌株B7（ATCC10231）或临床菌株BB2）菌液1mL放入平板中，倒入已冷却至合适温度的PDA培养基，混合均匀。用无菌镊子夹取厚度为1.5mm、直径为6mm的滤纸片置于含菌平板上，同时在滤纸片上分别滴加上述浓度的木霉酸或制霉菌素5μL，置于26℃恒温箱培养36h，观察滤纸片周围的抑菌圈，以滤纸片周围有抑菌圈的滤纸片所含样品的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC值)。
实验结果如表2所示：
表2：木霉酸（Trichodermic acid）对白色念珠菌的最低抑制浓度(MIC值)
注：“+”表示有抑菌圈，“-”表示无抑菌圈
实施例3：
采用生长对峙法测定木霉酸对植物病原真菌胶孢炭疽菌的抑制作用。
用DMSO将木霉酸溶解并稀释至1000μg/mL。
在PDA培养基中央接入直径为4mm的胶孢炭疽菌的菌饼，然后在距离菌饼1.5mm处放置直径为6mm的滤纸片，在滤纸片上滴加5μL上述木霉酸稀释液，重复3次，26℃培养5d，以DMSO代替木霉酸作为空白对照,用十字测量法测量供试菌菌饼直径，计算抑菌直径。
抑菌直径（mm）=空白对照组菌饼生长直径-处理组菌饼生长直径
实验结果如表3：
表3：木霉酸（Trichodermic acid）对胶孢炭疽菌的抑制作用
注：每片滤纸含木霉酸5μg
实施例4
采用二倍稀释法测定木霉酸对胶孢炭疽菌的最低抑菌浓度（MIC值）。
用DMSO将木霉酸分别稀释至800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL。吸取孢子数为106个/mL的胶孢炭疽菌1mL放入平板中，倒入已冷却至合适温度的PDA培养基，混合均匀。用无菌镊子夹取厚度为1.5mm、直径为6mm的滤纸片置于含菌平板上，同时在滤纸片上分别滴加上述不同浓度的木霉酸（Trichodermic acid）5μL，置于26℃恒温箱培养72h，观察滤纸片周围的抑菌圈，以滤纸片周围有抑菌圈的滤纸片所含样品的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC值)。
实验结果如表4所示：
表4：木霉酸（Trichodermic acid）对胶孢炭疽菌的最低抑制浓度(MIC值)
注：“+”表示有抑菌圈，“-”表示无抑菌圈
综合所述，木霉酸对致病真菌白色念珠菌或植物病原真菌胶孢炭疽菌具有很强的抑制作用。因此，本发明的实现为研究与开发新的抗真菌药物提供了候选药物，为开发利用植物内生真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
Claims (2)
1.木霉酸作为唯一活性成份在制备抗真菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗真菌药物为抗白色念珠菌（Candidaalbicans）或胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的药物。
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