CN103372039B - 蛇床子香豆素用于制备抗真菌药物增效剂产品的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是蛇床子香豆素用于制备抗真菌药物增效剂产品的用途。经体外和体内实验，蛇床子香豆素与氟康唑合用，能显著提高对深部真菌感染的治疗效果，并能使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此可用作抗真菌药物的增效剂。

Description

蛇床子香豆素用于制备抗真菌药物增效剂产品的用途

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，是蛇床子香豆素用于制备抗真菌药物增效剂产品的用途。

背景技术

中药蛇床子为伞形科一年生草本植物蛇床Cnidium monnieric(L.)Cuss的果实，现代化学研究表明主要成分为香豆素类化合物和萜类化合物。目前对蛇床子中有效成分的药理作用和应用研究主要集中在香豆素类，称之为蛇床子总香豆素(TCCM)，由TCCM已分离得到的单体有6种，包括甲氧基欧芹酚、佛手柑内酯、异虎耳草素、花椒毒酚、花椒毒素、欧芹属素乙。具有广谱抗菌作用，对须发、脚趾、肛周癣菌有较强的抑制作用，对阴道滴虫有抑制作用。但与其他药物合用，协同抗真菌作用未见公开报道。

其中，甲氧基欧芹酚，英文名(Osthol，Ost)，是从伞形科蛇床子属植物蛇床的果实中提取的一种香豆素类化合物。化学名称：7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素(7-甲氧基-8-(3’-甲基-2’-丁烯基)-1-二氢苯并吡喃酮一2。分子式：C₁₅H₁₆O₃，分子量：244.29。纯品为无色柱状结晶；熔点83℃～84℃；沸点145～150℃；不溶于水和冷石油醚，易溶于丙酮、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯，可溶于沸的石油醚。在通常贮存条件下稳定，在pH5-9溶液中无开环分解现象。

发明内容

本发明为蛇床子香豆素开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物的增效剂，不仅能提高药物的抗真菌作用，而且在临床治病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋严重的情况，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，因此蛇床子香豆素可用于制备抗真菌药物增效剂产品，用于不同深部和浅部真菌感染的治疗。具有广泛的良好应用前景。

附图说明：

图1是：甲氧基欧芹酚与氟康唑联合用药的琼脂平皿扩散实验结果

图A和C是不含药物的普通培养基，图B是含有64μg/ml氟康唑的培养基，图C是图A和B的说明，图E是图C的说明。

图2是：甲氧基欧芹酚与氟康唑合用对小鼠系统性真菌感染模型的生存曲线

图中：1为模型组、2为氟康唑0.5mg/ml组、3为氟康唑0.5mg/ml+甲氧基欧芹酚75mg/ml组、4为氟康唑0.5mg/ml+甲氧基欧芹酚150mg/ml组、5为氟康唑0.5mg/ml+甲氧基欧芹酚300mg/ml组

实施方式：

以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：甲氧基欧芹酚和氟康唑联用对不同临床真菌株的作用

材料和方法

1.试药：

甲氧基欧芹酚：西安绿泉生物技术有限公司提供，以DMSO配制。

氟康唑注射液：辉瑞制药有限公司，批号9149102。

各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。

2.菌株：

临床株：耐药白念珠菌(100、J35、32、557、842、901、103、J28、J5、904、953)，均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3.培养液：

RPMI 1640液体培养液：

RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO₃2.0g，吗啡啉丙磺酸(MOPS)(Sigma)34.5g(0.165M)，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)：

蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

YEPD培养液：

酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

4.仪器设备：

Multiskan MK3型酶标检测仪(芬兰Labsystems产品)

隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)

THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)

SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)

5.菌液制备：

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取白念珠菌少量，接种至1ml YEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×10³～5×10³CFU/ml。

6.药敏板制备：

取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液99μl；2号孔分别加菌液196μl和6.4mg/ml氟康唑2μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。调配不同浓度的甲氧基欧芹酚。在2号孔加相应浓度的甲氧基欧芹酚2μl，3～11号孔各加1μl。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终氟康唑浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，而甲氧基欧芹酚的浓度保持恒定，各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

7.MIC₈₀值判定：

在30℃恒温箱中，念珠菌培养48h后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC₈₀(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的MIC₈₀值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC₈₀值高于最高浓度64μg/ml时，计为“＞64μg/ml”；MIC₈₀值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。

上述实验均平行操作2到3次，当MIC₈₀值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC₈₀值；当MIC₈₀值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果见表1

表1甲氧基欧芹酚与氟康唑合用对不同临床菌株的MIC₈₀值(μg/ml)

由表1可见，单用氟康唑耐药的菌株，合用甲氧基欧芹酚后，菌株对氟康唑的敏感性增强，由耐药(MIC₈₀≥64μg/ml)变得敏感，降低了8-64倍，合用后氟康唑的平均MIC₈₀从＞64μg/ml下降到2.82μg/ml，对11株菌二者均表现为协同作用，平均协同指数为0.135，说明甲氧基欧芹酚能明显增强氟康唑的抗真菌作用。

实施例2：甲氧基欧芹酚与氟康唑联合用药的琼脂平皿扩散实验

材料和方法

菌株：临床耐药白念珠菌编号0304103，由长海医院真菌室提供，并经形态学和生化学鉴定。

药物：氟康唑注射液(大扶康，Diflucan)由美国辉瑞生物制药有限公司生产。甲氧基欧芹酚(osthol)由西安绿泉生物技术有限公司提供，以DMSO配制。

试剂：YEPD培养液、YEPD固体培养基、DMSO、0.9％生理盐水、无菌白纸片(直径6mm)。

YEPD固体培养基：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，加三蒸水900ml溶解，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后，趁热将液体铺于无菌的平皿(直径90mm)中，于4℃保存备用。

实验设计：

将临床耐药白念珠菌0304103以1∶100接种至1ml YEPD培养液，于30℃，200rpm 振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以0.9％生理盐水稀释调整菌液浓度至1×10⁶～5×10⁶CFU/ml。取100μl此浓度菌液，加5ml 0.9％生理盐水，铺于常规YEPD固体培养基和含有氟康唑64μg/ml的YEPD固体培养基上。于30℃培养箱中孵育30分钟后，轻轻倾倒掉上层液体，再放入30℃培养箱，待琼脂表面液体挥干后取出，在其上面放上含有不同剂量的药物的无菌纸片(直径6mm)，纸片中含DMSO的量均不超过5μl。含药纸片分别含有：甲氧基欧芹酚64μg、32μg、16μg、8μg，氟康唑10μg，两药合用纸片为氟康唑10μg分别合用甲氧基欧芹酚64μg、32μg、16μg、8μg。将琼脂培养平皿倒置于30℃培养箱中孵育，48小时后观察抑菌圈内外菌落状态，并测量其抑菌圈直径。

实验结果：

在含64μg/ml氟康唑的琼脂培养基上仍然长满了菌落，但甲氧基欧芹酚药片在此培养基上却能产生大面积的抑菌圈都仅呈现出微弱的抑菌作用；而在不含药的琼脂培养基上，两种药物单用时，抑菌圈很小且不明显。两种药物合用，纸片周围出现了明显的抑菌圈且呈现出明显的浓度依赖性。见附图1

实施例3：甲氧基欧芹酚与氟康唑合用对小鼠系统性真菌感染的保护作用

试验设计：

50只ICR小鼠尾静脉注射5×10⁶CFU/ml对数生长期白假丝酵母菌菌悬液0.2ml，复制系统性小鼠深部真菌感染模型，并随机分为以下5组：模型组、氟康唑0.5mg/ml组、氟康唑0.5mg/ml+甲氧基欧芹酚75mg/ml组、氟康唑0.5mg/ml+甲氧基欧芹酚150mg/ml组、氟康唑0.5mg/ml+甲氧基欧芹酚300mg/ml组。

造模后2h给药，灌胃给药，给药体积0.2ml/10g，每天1次，连续四天。观察开始给药后30天内小鼠的死亡情况。

统计方法：

Kaplan-Meier生存分析，统计软件SPSS17.0。

实验结果

甲氧基欧芹酚与氟康唑合用对耐药白念珠菌深部感染小鼠累计存活率的影响如见附图2。

由图2可以看出，与单独使用氟康唑相比，甲氧基欧芹酚与氟康唑合用，可显著延长白念珠菌深部感染小鼠的存活时间，显示了其对抗菌药的增效作用。

Claims (1)

1.蛇床子香豆素用于制备抗真菌药物增效剂产品的用途，其中所述的蛇床子香豆素为其单体化合物甲氧基欧芹酚，所述的抗真菌药物是氟康唑，所述的真菌是白念珠菌。