CN102552348B - 诃子用于制备抗真菌药物及抗真菌药物增效剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种诃子用于制备抗真菌药物及抗真菌药物增效剂的新用途。体内外实验表明，诃子对真菌感染有较好的治疗效果，并能使抗真菌药物氟康唑恢复对耐药真菌的作用，因此诃子可用作抗真菌治疗及抗真菌药物的增效剂。本发明为诃子开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

Description

诃子用于制备抗真菌药物及抗真菌药物增效剂的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种诃子用于制备抗真菌药物及抗真菌药物增效剂的用途。

背景技术

诃子为使君子科植物诃子的果实，味苦、酸、涩，性平，具有敛肺、涩肠、下气、利咽之功效。中医常将诃子用于治疗久泻、久痢、脱肛、喘咳痰嗽、久咳失音等症。现代药理研究显示，诃子具有抗菌、抗氧化、抗癌、强心、细胞损伤保护等药理作用，虽然亦有诃子体外抗真菌作用的报道，但未见诃子体内治疗真菌感染，也未见诃子作为抗真菌药物增效剂与抗真菌药物联合使用治疗真菌病的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诃子用于制备抗真菌药物及抗真菌药物增效剂的用途。体外细胞实验表明，诃子对各种临床真菌菌株如白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隐球菌具有抑制活性。体内动物实验，诃子的75%乙醇提取物可显著提高真菌感染小鼠的存活时间和存活率。当抗真菌药物氟康唑和诃子合用时，能明显降低抗真菌药物的用药剂量，并增强对耐药真菌的抑制作用，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此可将诃子用作抗真菌治疗及抗真菌药物的增效剂。

本发明提出一种诃子用于制备抗真菌药物及抗真菌药物增效剂的用途，其中：所述诃子的药材原料为使君子科植物诃子的果实。

本发明中，所述诃子是诃子药材水提物或乙醇提取物的一种。

本发明中，所述乙醇提取是指用75%乙醇提取。

本发明中，所述真菌包括1) 敏感菌株：敏感白色念珠菌（SC5314），近平滑念珠菌（22019），新生隐球菌；2）耐药菌株：耐药白色念珠菌（103），耐药热带念珠菌，天然耐药克柔念珠菌（ATCC2340），天然耐药光滑念珠菌（ATCC2281）。

本发明中，所述耐药菌株是对氟康唑耐受，敏感菌株是对氟康唑敏感。

本发明中，所述抗真菌药物包括：1）多烯类药物：如两性霉素B，甲帕霉素等；2）唑类药物：如氟康唑，咪康唑，酮康唑，伊曲康唑等；3）其他药物：如5-氟胞嘧啶，卡泊芬净等。

本发明为诃子开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

附图说明

图1为本发明实施例2中ICR小鼠感染白念珠菌103后的生存曲线图。在图1中，横坐标为感染天数（d），纵坐标为累积存活率（%）。

具体实施方式

以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1. 诃子对不同临床真菌株的作用

材料和方法

1.试药：

诃子药材：购于上海雷允上北区药品零售有限公司。

氟康唑：sigma公司，批号460M4707V。

二甲亚砜：上海世仪生物科技有限公司。

各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。

2.菌株：

临床株：1）白念珠菌，分103、SC5314两株；2）热带念珠菌2718，1株；3）光滑念珠菌ATCC1182，1株；4）克柔念珠菌ATCC2340，1株；5）近平念珠菌ATCC22019，1株；6）新生隐球菌，1株。光滑念珠菌和克柔念珠菌由安徽中医学院汪长中教授惠赠，其余均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA）划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隐球菌等球状菌于30℃培养2 周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA 斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3.培养液：

1）RPMI 1640 液体培养液：

RPMI1640（Gibco BRL）10 g，NaHCO₃ 2.0 g，吗啡啉丙磺酸 (Sigma)34.5 g（0.165 M），加三蒸水900 ml 溶解，1 N NaOH 调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000 ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

2）沙堡葡萄糖琼脂固体培养基（SDA）：

蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加三蒸水900 ml 溶解，加入2 mg/ml 氯霉素水溶液50 ml，调整pH 至7.0，以三蒸水定容至1000 ml，高压灭菌（121℃，15min）后于4℃保存备用。

3）YEPD 培养液：

酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 ml 溶解，加入2 mg/ml 氯霉素水溶液50 ml，三蒸水定容至1000 ml，高压灭菌（121℃，15min）后于4℃保存备用。

4.仪器设备：

Multiskan MK3型酶标检测仪（芬兰Labsystems产品）

隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）

THZ－82A台式恒温振荡器（上海跃进医疗器械厂）

SW-CT-IF型超净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）

5.诃子提取物的制备：

将诃子果实粉碎后，过60目筛，以1：20比例，用75％乙醇，85℃回流提取2h，溶液纱布过滤后，50℃减压回收乙醇，再于50℃烘箱烘干，粉碎成粉末，用DMSO溶解，配成浓度0.5g/ml（按生药量计算），分装后于-20℃保存备用。

6.菌液制备：

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA 培养基上分别挑取白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隐球菌各球状菌少量，分别接种至1 ml YEPD 培养液，于30℃，200 rpm 振荡培养，活化16 h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1 mlYEPD 培养液中，用上述方法再次活化，培养16 h ，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640 培养液分别调整各菌液浓度至1×10³～5×10³CFU/ml。

7.药敏板制备：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μl；2号孔加菌液198μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。在每排的2号孔加母液浓度为0.5g/ml的诃子或氟康唑各2μl。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终诃子药物浓度分别为5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、19.53、9.76μg/ml，氟康唑的药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。各孔中DMSO 含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

8.MIC₈₀值判定：

在30℃恒温箱中，念珠菌培养24 h，新生隐球菌培养72h，用酶标分析仪于630 nm 测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC₈₀（真菌生长80％被抑制时的药物浓度）。当药物的MIC₈₀值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：如以氟康唑为例，MIC₈₀值高于最高浓度64μg/ml时，计为“>64μg/ml”； MIC₈₀值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。

上述实验均平行操作2到3次，当MIC₈₀值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC₈₀值；当MIC₈₀ 值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果见表1

表1 诃子对7株临床真菌的MIC₈₀值（μg/ml）

菌株	诃子	FLC
			近平念珠菌ATCC22019	625	8
克柔念珠菌ATCC2340	312.5	>64
			热带念珠菌	1250	>64
光滑念珠菌ATCC1182	1250	>64
			新生隐球菌	625	8
白念珠菌103	625	>64
			白念珠菌SC5314	625	1

注：FLC表示氟康唑（下同）。

由表1可见，诃子对各种真菌均具有抑制活性，对克柔念珠菌的MIC₈₀为312.5μg/ml，对近平念珠菌、新生隐球菌、氟康唑耐药及敏感白念珠菌的MIC₈₀为625μg/ml，对热带念珠菌和光滑念珠菌的MIC₈₀为1250μg/ml。说明诃子体外具有抗真菌作用。

实施例2. 诃子对胃肠道来源白念珠菌小鼠感染的保护作用

1.试药：

诃子药材：购于上海雷允上北区药品零售有限公司。

5-氟尿嘧啶：购于sigma公司。

2.菌株：

临床株：白念珠菌103，由上海长海医院真菌室提供，采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA）划板活化，于30℃培养2 周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA 斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3.动物：

   20只雌性ICR小鼠（18-22g），购于上海斯莱克实验动物有限公司。

4.培养液：

1）沙堡葡萄糖琼脂固体培养基（SDA）：

蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加三蒸水900 ml 溶解，加入2 mg/ml 氯霉素水溶液50 ml，调整pH 至7.0，以三蒸水定容至1000 ml，高压灭菌（121℃，15min）后于4℃保存备用。

2）YEPD 培养液：

酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 ml 溶解，加入2 mg/ml 氯霉素水溶液50 ml，三蒸水定容至1000 ml，高压灭菌（121℃，15min）后于4℃保存备用。

5.仪器设备：

Multiskan MK3型酶标检测仪（芬兰Labsystems产品）

隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）

THZ－82A台式恒温振荡器（上海跃进医疗器械厂）

SW-CT-IF型超净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）

生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）

6.诃子提取物的制备：

诃子提取物制备方法同实施例1，最后粉末用0.5%羟甲基纤维素钠溶液配成0.5g/ml(浓度按生药量算)，分装后于-20℃保存备用。

7.菌液制备：

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA 培养基上分别挑取白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隐球菌各球状菌少量，分别接种至1 ml YEPD 培养液，于30℃，200 rpm 振荡培养，活化16 h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1 mlYEPD 培养液中，用上述方法再次活化，培养16 h ，用血细胞计数板计数，以0.85%生理盐水调整菌液浓度至1×10⁹CFU/ml。

8.胃肠道来源白念珠菌小鼠感染模型建立及给药：

20只雌性ICR小鼠（18-22g），每只静脉给予5-氟尿嘧啶200mg/kg（随后每隔五天静脉给予小鼠5-氟尿嘧啶200mg/kg）。第三天后，每只灌胃菌量为2×10⁸CFU，造成小鼠胃肠道来源的白念珠菌感染。将小鼠随机分成2组，标记为模型组、诃子5g/kg组。模型组灌胃0.2ml0.5%羟甲基纤维素钠溶液，给药组灌胃诃子5g/kg，每天一次，连续5天。观察并记录小鼠的死亡情况。 

统计方法：

Kaplan-Meier生存分析，统计软件SPSS17.0。

实验结果

诃子对胃肠道来源白念珠菌感染小鼠累计存活率的影响如图1(见说明书附图)。

       由图1可以看出，与模型组相比，诃子可延长胃肠道来源白念珠菌感染小鼠的存活时间。通过Kaplan-Meier生存分析，存在显著性差异（P<0.028）。提示了诃子提取物抗真菌的作用。

   实施例3. 诃子与氟康唑联合对不同临床真菌株的作用

材料和方法

1.药敏板制备：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液99μl；2号孔分别加菌液196μl和诃子75%的乙醇提取物2μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。调配不同浓度的氟康唑为：0.4 mg/ml、0.2 mg/ml。在每排的2号孔加相应浓度的氟康唑2μl，3~11号孔各加1μl。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终诃子75%的乙醇提取物浓度分别为5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、19.53、9.76μg/ml。各孔中DMSO 含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

其他实验步骤和方法同实施例1，实验结果见表2。

表2 诃子与氟康唑（4、1μg/ml）联合对6株临床真菌的MIC₈₀值（μg/ml）

 由表2可见，诃子不仅单用具有抗真菌作用，而且与抗真菌药物氟康唑协同具有抗菌增效作用。氟康唑单用对各种真菌菌株的MIC₈₀值为8~>64μg/ml。合用4μg/ml、1μg/ml的氟康唑后，诃子的MIC₈₀值对不同真菌菌株的MIC₈₀  值亦由312.5~1250μg/ml下降到≤4.88~312.5μg/ml，显示了诃子提取物对氟康唑的增效作用。

Claims (5)

1.诃子用于制备抗真菌药物增效剂的用途，其特征在于所述诃子的药材原料为使君子科植物诃子的果实，抗真菌药物为唑类药物或5-氟胞嘧啶。

2.根据权利要求1所述的诃子用于制备抗真菌药物增效剂的用途，其特征在于，所述的诃子是诃子药材水提物或乙醇提取物的一种。

3.根据权利要求2所述的诃子用于制备抗真菌药物增效剂的用途，其特征在于，所述的乙醇提取是指用75%乙醇提取。

4.根据权利要求1所述的诃子用于制备抗真菌药物增效剂的用途，其特征在于，所述的抗真菌药物及抗真菌药物增效剂所涉及的真菌为敏感菌株或耐药菌株。

5.根据权利要求4所述的诃子用于制备抗真菌药物增效剂的用途，其特征在于，所述的耐药菌株是对氟康唑耐受，敏感菌株是对氟康唑敏感。

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