CN109700859A - 朱砂七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的朱砂七的抗真菌应用，属于医药技术领域。本发明通过体外实验表明，朱砂七对真菌有较好的抑制效果，并能使抗真菌药物氟康唑恢复对耐药真菌的作用，因此朱砂七可用作抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂。本发明为朱砂七开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

Description

朱砂七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及朱砂七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用。

背景技术

朱砂七(Polygonum cillinerve)，别名朱砂莲、红药子，始载于《图经本草》，为蓼科Polygonum cillinerve(Nakai)Ohwl蓼属植物毛脉蓼的块根，其味苦、微涩、性凉、平，具有清热解毒、活血凉血、止血止泻、去风湿、强腰膝等功能。为重要的“太白七药”之一，且已被《陕西卫生志》列为陕西地道名贵草药。

但是目前，国内外未见朱砂七抗真菌作用和其对抗真菌药物增效作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供朱砂七在制备抗真菌药物及其增效剂中的应用。

本发明公开了朱砂七在制备抗真菌药物中的应用。

优选的，选用朱砂七的干燥根及根茎作为制备抗真菌药物的原料。

优选的，所述真菌包括敏感真菌菌株和耐药真菌菌株。

进一步的，所述敏感真菌菌株包括：敏感白色念珠菌SC5314、近平滑念珠菌22019和新生隐球菌32609；所述耐药真菌菌株包括：耐药白色念珠菌103、耐药热带念珠菌、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340和天然耐药光滑念珠菌ATCC2281。

本发明还公开了朱砂七在制备抗真菌药物增效剂中的应用。

优选的，抗真菌药物为氟康唑。

本发明还公开了一种抗真菌药物，由朱砂七醇提物与药用辅料制成，剂型为片剂、胶囊剂或注射剂。

优选的，朱砂七醇提物的制备方法如下：

将朱砂七干燥根及根茎粉碎成粉末，用乙醇冷凝回流提取，放冷、过滤除去残渣，将药液浓缩干燥制得。

优选的，所述的药用辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。

本发明还公开了一种抗真菌药物组合物，包括朱砂七醇提物和氟康唑。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的朱砂七用于制备抗真菌药物及其增效剂的用途，通过体外细胞实验表明，朱砂七对耐药白念珠菌103、敏感白色念珠菌SC5314、新生隐球菌32609、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340、近平滑念珠菌22019、天然耐药光滑念珠菌ATCC2281、耐药热带念珠菌具有不同程度的抗真菌作用，且与抗真菌药物合用能明显降低药物浓度，表现协同抗真菌作用，因此可将朱砂七用作抗真菌药物及其增效剂，为朱砂七开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物，为真菌感染治疗提供了新的候选药物。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、材料准备

1、试药

朱砂七：购于成都德思特生物技术有限公司，纯度≥99％，批号DST170411-006。

氟康唑(FLC))：sigma公司，批号036M4709V。

二甲亚砜：天津市天力化学试剂有限公司。

各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。

2、菌株

使用的菌株，包括：

1)敏感菌株：敏感白色念珠菌SC5314、近平滑念珠菌22019和新生隐球菌32609；

2)耐药菌株：耐药白色念珠菌103、耐药热带念珠菌、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340和天然耐药光滑念珠菌ATCC2281。

以上均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于30℃培养2-3天后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3、培养液/基

1)RPMI 1640液体培养液

RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO₃ 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g(0.165mol)，加三蒸水900mL溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)

蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

3)YEPD培养液

酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

4、仪器设备

隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；

THZ－82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；

SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

5、朱砂七和氟康唑贮备液

将购买的朱砂七，粉碎成细粉末，称取5g，用20倍体积(100mL)75％的乙醇，冷凝回流提取2小时，放冷，过滤除去残渣，将药液旋转浓缩至干燥，取15mL DMSO溶解完全，配制母液浓度为0.333g/mL，分装，-20℃保存待用。

将市售的氟康唑用DMSO溶解，配成浓度为6.4mg/mL，于-20℃保存备用。

6、菌液制备

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上分别挑取白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌各球状菌少量，分别接种至1mL YEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mL YEPD培养液中，用上述方法再次活化，培养16h，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液分别调整各菌液浓度至1×10³～5×10³CFU/mL。

二、朱砂七单独使用对不同真菌的作用

1、药敏板制备

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μL；2号孔加菌液198μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。在每排的2～11号孔各加母液浓度为0.3333g/mL的朱砂七2μL。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终朱砂七药物浓度分别为3330μg/mL、1665μg/mL、832.5μg/mL、416.3μg/mL、208.1μg/mL、104.1μg/mL、52.0μg/mL、26.0μg/mL、13.0μg/mL和6.5μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

2、MIC值判定：

在30℃恒温箱中，菌液培养24h，观察实验结果，并确定其MIC值。观察结束后，放回恒温培养箱中继续培养，菌液培养48h时再次观察实验结果并确定其MIC值。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度3330μg/mL时，计为“>3330μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤6.5μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果如下表1所示：

表1朱砂七单独使用对各种真菌的MIC值(μg/mL)

从表1可以看出，朱砂七作用各种真菌24h后，对耐药白色念珠菌103和敏感白色念珠菌SC5314的MIC值均为416.3μg/mL，对天然耐药克柔念珠菌ATCC2340、天然耐药光滑念珠菌ATCC2281和新生隐球菌32609的MIC值均为6.5μg/mL，对近平滑念珠菌22019和耐药热带念珠菌的MIC值均为832.5μg/mL；当药物作用48h后，对耐药白色念珠菌103、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340和新生隐球菌32609的MIC值分别为416.3μg/mL、13.0μg/mL和13.0μg/mL，这显示了朱砂七具有抗真菌作用。

三、朱砂七与氟康唑合用对各菌的作用

所用药物、菌株及实验材料同上述所示。

1、药敏板制备：

取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的各菌菌液(1×10³～5×10³CFU/mL)100μL；2号孔加菌液198μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。对2～11号孔加药，使2～11号孔的最终氟康唑药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL，朱砂七合用的药物浓度分别为1665、832.5、416.3、208.1、104.1、52.0、26.0、13.0、6.5、3.25和1.625μg/mL，单用的药物浓度分别为3330、1665、832.5、416.3、208.1、104.1、52.0、26.0、13.0和6.5μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将96孔板于30℃恒温箱培养。

在30℃恒温箱中，菌液培养24h，观察实验结果。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度64μg/mL时，计为“>64μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果见下表2：

表2朱砂七与氟康唑联合对各种真菌的MIC值(μg/mL)

注：FIC index for combination意思是组合指数，Mode of Interaction意思是相互作用模式。

由表2可见，朱砂七与抗真菌药物氟康唑联合使用具有抗菌增效作用。氟康唑单用对新生隐球菌32609的MIC值为8μg/mL，朱砂七MIC值为208.1μg/mL；两药合用后，氟康唑的MIC值下降到1μg/mL，朱砂七下降至1.625μg/mL。氟康唑单用对耐药热带念珠菌的MIC值为>64μg/mL，朱砂七MIC值为1665μg/mL；两药合用后，氟康唑的MIC值下降到0.25μg/mL，朱砂七下降至104.1μg/mL。显示了朱砂七和氟康唑的协同作用。

而氟康唑单用对耐药白色念珠菌103的MIC值为>64μg/mL，朱砂七MIC值为104.1μg/mL；两药合用后，氟康唑的MIC值下降到0.125μg/mL，朱砂七下降至52.0μg/mL。氟康唑单用对近平滑念珠菌22019的MIC值为4μg/mL，朱砂七MIC值为208.1μg/mL；两药合用后，氟康唑的MIC值下降到0.125μg/mL，朱砂七下降至104.1μg/mL。显示了朱砂七和氟康唑的相加作用。

综上所述，本发明通过体外实验表明，朱砂七对真菌有较好的抑制效果，并能使抗真菌药物氟康唑恢复对耐药真菌的作用，因此朱砂七可用作抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂。本发明为朱砂七开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物及抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

Claims (10)

1.朱砂七在制备抗真菌药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，选用朱砂七的干燥根及根茎作为制备抗真菌药物的原料。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌包括敏感真菌菌株和耐药真菌菌株。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述敏感真菌菌株包括：敏感白色念珠菌SC5314、近平滑念珠菌22019和新生隐球菌32609；所述耐药真菌菌株包括：耐药白色念珠菌103、耐药热带念珠菌、天然耐药克柔念珠菌ATCC2340和天然耐药光滑念珠菌ATCC2281。

5.朱砂七在制备抗真菌药物增效剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗真菌药物为氟康唑。

7.一种抗真菌药物，其特征在于，由朱砂七醇提物与药用辅料制成。

8.如权利要求7所述的抗真菌药物，其特征在于，朱砂七醇提物的制备方法如下：

将朱砂七干燥根及根茎粉碎成粉末，用乙醇冷凝回流提取，放冷、过滤除去残渣，将药液浓缩干燥制得。

9.如权利要求7所述的抗真菌药物，其特征在于，所述的药用辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。

10.一种抗真菌药物组合物，其特征在于，包括朱砂七醇提物和氟康唑。