CN104127413B - 光甘草定用于制备抗真菌药物增效剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，光甘草定用于制备抗真菌药物增效剂的新用途。体外实验表明，光甘草定对真菌感染有较好的治疗效果，并能使抗真菌药物氟康唑恢复对耐药真菌的作用，因此光甘草定可用作抗真菌药物的增效剂。本发明为光甘草定开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

Description

光甘草定用于制备抗真菌药物增效剂的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种光甘草定用于制备抗真菌药物增效剂的用途。

背景技术

光甘草定是光果甘草中的异黄烷类成分之一。现代药理研究显示，光甘草定具有抗菌、抗氧化、降血脂和降压等药理作用，虽然亦有光甘草定体外抗真菌作用的报道，但未见光甘草定作为抗真菌药物增效剂，与抗真菌唑类药物联合使用治疗真菌病的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种光甘草定用于制备抗真菌药物增效剂的用途。体外细胞实验表明，当抗真菌药物氟康唑和光甘草定合用时，能明显降低抗真菌药物的用药剂量，并增强对耐药真菌的抑制作用，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此可将光甘草定用作抗真菌药物的增效剂。

本发明提出一种光甘草定用于制备抗真菌药物增效剂的用途，其中：所述光甘草定为光果甘草中的异黄烷类成分，抗真菌药物为唑类药物。

本发明中，所述真菌包括1) 敏感菌株：敏感白色念珠菌（SC5314），近平滑念珠菌（22019），新生隐球菌32609；2）耐药菌株：耐药白色念珠菌（103），耐药热带念珠菌

本发明中，所述耐药菌株是对氟康唑耐受，敏感菌株是对氟康唑敏感。

本发明为光甘草定开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物的增效剂，不仅为真菌治疗提供了新的候选药物，而且提高了现有药物的抗真菌作用，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，降低了抗真菌药物的用药剂量，从而为患者节省了医疗费用，减少药物的毒副作用。

附图说明

图1为不同浓度的光甘草定单用或与氟康唑合用时，对耐药白念珠菌的抑菌圈图。A平板为光甘草定单用（浓度为64，32，16，8mg）对耐药白念珠菌103的抑菌圈；B平板为光甘草定（浓度为64，32，16，8mg）与氟康唑（FLC，浓度为64mg/ml）合用对耐药白念珠菌103的抑菌圈；C平板为光甘草定（浓度为64，32，16，8mg）与氟康唑（FLC，浓度为8mg）合用对耐药白念珠菌103的抑菌圈。

图2为不同浓度的光甘草定单用或与氟康唑合用时，分别对敏感白念珠菌，热带念珠菌和新生隐球菌的抑菌圈图。第一行的平板为光甘草定单用（浓度为64，32，16，8mg）分别对敏感白念珠菌（C. albicans），热带念珠菌(C. tropicalis)和新生隐球菌(C.neoformans)的抑菌圈；第二行的平板为光甘草定（浓度为64，32，16，8mg）与氟康唑（FLC，浓度为8mg）合用分别对敏感白念珠菌（C. albicans），热带念珠菌(C. tropicalis)和新生隐球菌(C. neoformans)的抑菌圈。

具体实施方式

以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1. 光甘草定与氟康唑联合对不同临床真菌株的作用

材料和方法

1.试药：

光甘草定：购于上海融禾医药科技发展有限公司，纯度>98%。

氟康唑：sigma公司，批号460M4707V。

二甲亚砜：上海世仪生物科技有限公司。

各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。

2.菌株：

临床株：1）白念珠菌分别为SC5314 1株和25株临床耐药白念菌分离株；2）热带念珠菌2718，1株； 3）新生隐球菌，1株。菌株均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA）划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于30℃培养2周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA 斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3.培养液：

1）RPMI 1640 液体培养液：

RPMI1640（Gibco BRL）10 g，NaHCO₃ 2.0 g，吗啡啉丙磺酸 (Sigma)34.5 g（0.165M），加三蒸水900 ml 溶解，1 N NaOH 调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000 ml，0.22µm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

2）沙堡葡萄糖琼脂固体培养基（SDA）：

蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加三蒸水900 ml 溶解，加入2 mg/ml 氯霉素水溶液50 ml，调整pH 至7.0，以三蒸水定容至1000 ml，高压灭菌（121℃，15min）后于4℃保存备用。

3）YEPD 培养液：

酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 ml 溶解，加入2 mg/ml 氯霉素水溶液50 ml，三蒸水定容至1000 ml，高压灭菌（121℃，15min）后于4℃保存备用。

4.仪器设备：

Multiskan MK3型酶标检测仪（芬兰Labsystems产品）；

隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；

THZ－82A台式恒温振荡器（上海跃进医疗器械厂）；

SW-CT-IF型超净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；

5.光甘草定和氟康唑贮备液：

将光甘草定和氟康唑用DMSO溶解，配成浓度6.4mg/ml，于-20℃保存备用。

6.菌液制备：

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA 培养基上分别挑取白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌各球状菌少量，分别接种至1 ml YEPD 培养液，于30℃，200 rpm 振荡培养，活化16 h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1 mlYEPD 培养液中，用上述方法再次活化，培养16 h ，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640 培养液分别调整各菌液浓度至1×10³～5×10³CFU/ml。

7.药敏板制备：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100µl作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100µl；2号孔加菌液198µl；12号孔不含药物，只加菌液100µl作阳性生长对照。在每排的2号孔加母液浓度为0.5g/ml的光甘草定或氟康唑各2µl。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终光甘草定药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和0.125µg/ml，氟康唑的药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125µg/ml。各孔中DMSO 含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

8.MIC₈₀值判定：

在30℃恒温箱中，念珠菌培养24 h，新生隐球菌培养72h，用酶标分析仪于630 nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC₈₀（真菌生长80％被抑制时的药物浓度）。当药物的MIC₈₀值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：如以氟康唑为例，MIC₈₀值高于最高浓度64µg/ml时，计为“>64µg/ml”； MIC₈₀值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125µg/ml”。

上述实验均平行操作2到3次，当MIC₈₀值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC₈₀值；当MIC₈₀ 值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果见表1

表1 光甘草定与氟康唑联合对25株耐药白念珠菌的MIC₈₀值（μg/ml）

注：FLC表示氟康唑，Gla表示光甘草定。

由表1可见，光甘草定不仅单用具有抗真菌作用，而且与抗真菌药物氟康唑协同具有抗菌增效作用。氟康唑单用对25株耐药白念珠菌的MIC₈₀值为64~>256μg/ml，光甘草定单用对25株耐药白念珠菌的MIC₈₀值为32~64μg/ml。两药合用后，氟康唑的MIC₈₀值对各菌株的MIC₈₀值下降到1~4μg/ml，光甘草定下降至4μg/ml，显示了光甘草定提取物对氟康唑的增效作用。

实验结果见表2

表2 光甘草定与氟康唑联合对其他酵母真菌的MIC₈₀值（μg/ml）

注：FLC表示氟康唑，Gla表示光甘草定。

由表2可见，光甘草定不仅单用对其他酵母真菌具有抑菌作用，而且与抗真菌药物氟康唑协同具有抗菌增效作用。氟康唑单用对其他酵母真菌的MIC₈₀值为1~>64μg/ml，光甘草定MIC₈₀值为32~64μg/ml。两药合用后，氟康唑的MIC₈₀值对各菌株的MIC₈₀值下降到≤0.125~4μg/ml，光甘草定下降至1~8μg/ml，显示了光甘草定提取物对氟康唑的增效作用。

实施例2. 光甘草定与氟康唑联合对不同临床真菌株的抑菌圈

实验方法：

1、药物，菌株，材料同实施例1；

2、实验步骤：

将临床耐药及敏感白念珠菌103，SC5314，热带念珠菌，近平滑念珠菌和新生隐球菌。

以1：100接种至1 ml YEPD 培养液，于30℃，200 rpm 振荡培养，活化16 h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1 mlYEPD 培养液中，用上述方法再次活化，16 h 后，用血细胞计数板计数，以0.9%生理盐水稀释调整菌液浓度至1×10⁶～5×10⁶CFU/ml。取3ml菌液，铺于常规YEPD 固体培养基或含氟康唑64mg/ml的YEPD 固体培养基上，于30℃培养箱中孵育30分钟后，轻轻倾倒掉上层液体，再放入30℃培养箱，待琼脂表面液体挥干后取出，在其上面放上含有不同剂量的药物的无菌纸片（直径6mm），纸片中含DMSO的量均不超过5ml。含药纸片分别含有：光甘草定64mg、32mg、16mg、8mg，氟康唑8mg，两药合用纸片为氟康唑8mg分别合用光甘草定64mg、32mg、16mg、8mg，空白对照纸片含DMSO 5ml。将琼脂培养平皿倒置于30℃培养箱中孵育，48小时后观察抑菌圈内外菌落状态。

实验结果分别见图1和图2，由图1和图2可见，光甘草定与氟康唑分别单用时，对各种真菌的抑菌圈很小。当光甘草定与氟康唑合用时，抑菌圈明显大于两药单药组，且抑菌圈内无菌生长。进一步显示了光甘草定对抗真菌药的增效作用。

上述实验结果表明光甘草定具有联合抗真菌药物治疗真菌感染的作用，因此可用作抗真菌药物的增效剂。

Claims (1)

1.光甘草定和氟康唑在制备抗真菌药物中的用途，其特征在于所述光甘草定为光果甘草中的异黄烷类成分，所述的抗真菌药物所涉及的真菌为新生隐球菌。