CN104844438B - 一类具有四环并环结构的化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，本发明提供了一类具有四环并环结构的化合物，其化学结构如式（Ⅰ）所示。本发明还提供了该类化合物的制备方法；以及该类化合物在制备抗肿瘤药物、抗真菌药物、抗细菌药物、抗炎药物、以及PTP1B抑制剂中的应用。

Description

一类具有四环并环结构的化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类具有6/6/5/7四环并环结构的新骨架化合物，及其制备方法与在抗肿瘤、抗菌和PTP1B抑制活性方面的应用。
背景技术
以环戊烷并多氢菲为基本母核的化合物在自然界中广泛存在，它们的结构通式为四环并环（A/B/C/D，碳数分别为6/6/6/5），主要包括了甾体和四环三萜两大类化合物，在生物体内这两类化合物均由鲨烯经过不同途径环合而成。甾体化合物的结构式除含有四环母核外，还经常含有3β-OH、二个角甲基（C-10位和C-13位）和一个烃基侧链（C-17位，含C8～C10的烃基），甾体作为生物体细胞膜的重要组分在动物、植物和微生物中均大量分布。四环三萜化合物是由6个异戊二烯单元组成，其结构式在四环母核的基础上，通常含有3β-OH、5个角甲基（2x C-4位，C-10位、C-13位、C-14位）和1个烃基侧链（C-17位，含C8～C10的烃基），主要存在于高等植物和海参纲动物中，多以皂苷形式存在。具有环戊烷并多氢菲母核结构的这一家族化合物具有激素作用、抗炎、抗肿瘤、抗生育和增强免疫等非常丰富的生物活性，很多已经成为临床上广泛使用的药物（吴立军主编《天然药物化学》第4版，人民卫生出版社，2003，271-349；张文主编《海洋药物导论》第2版，上海科学技术出版社，2012，110-148）。
这一家族的少数化合物在环戊烷并多氢菲的母核结构基础之上经过生物体内的酶学修饰或化学家的结构改造，衍生出许多结构更为复杂的类似物。常见的是，在母核和侧链上发生不同位置、不同程度的烷基化、去烷基化或氧化，形成了这一家族的化学多样性。烷基化或去烷基化能够在母核或侧链（以侧链为主）不同位置引起碳数的增加或减少，如侧链数目拓展至C-0～C-12不等；C-4位上可以含2个角甲基、1个角甲基、不含角甲基或甲烯基；C-24位可以形成甲基或乙基等。在母核或侧链不同位置也都可以发生不同程度的氧化以及相关的脱水、还原、脱羧、酯化或环化等反应，进而引入羟基、醛酮、羧基、羧酸酯、环氧、醚、内酯等多种含氧官能团。这些反应使环戊烷并多氢菲的母核骨架发生改变，引起如多羟基取代，A环芳香化、降解，A、B、C、D环的氧化开裂以及环化等变化，形成了结构更为复杂的衍生物（Aiello,A.;Fattorusso,E.;Menna,M.Steroids from sponges:Recentreports.Steroids1999,64,687-714;Sica,D.;Musumeci,D.Secosteroids of marineorigin.Steroids2004,69,743-756;Sarma,N.S.;Krishna,M.S.;Pasha,S.G.;Rao,T.S.P.;Venkateswarlu,Y.;Parameswaran,P.S.Marine Metabolites:The Sterols of SoftCoral.Chemical Reviews2009,109,2803-2828)。海洋特殊的生活环境造成了其生物体内次生代谢产物变化的奇特性，从海绵、珊瑚和海洋微生物中发现了许多结构特异的环戊烷并多氢菲衍生物。结构的改变势必引起生物活性的变化，这类化合物因而也引起药物学家的广泛关注。
然而，环戊烷并多氢菲及其衍生物的这一家族化合物中迄今并未发现具有6/6/5/7四环并环结构类型的化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一类具有6/6/5/7四环并环的新骨架化合物或其衍生物。
本发明的另一的目的是提供上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物的制备方法。
本发明的再一的目的是提供上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物在制备抗肿瘤药物、抗真菌药物、抗细菌药物、抗炎药物、以及PTP1B抑制剂中的应用。
本发明的第一方面，是提供一类具有四环并环结构的化合物，所述的四环并环结构中各环碳数分别为6、6、5或7（即A/B/C/D四个环的碳数目分别为6/6/5/7），本发明的化合物具有如下化学结构通式：
式（Ⅰ）中：
R1、R2、R3、R4分别为A、B、C、D环上的一个或多个取代基，R1、R2、R3、R4彼此相同或不同，并且各自独立的为氢、卤素、羟基、过氧基、醚、氨基、硝基、巯基、羰基、腈基、羧基、烷基、环烷基、芳基、芳香性杂环基、饱和杂环基、烷氧基、芳氧基、芳香性杂环基氧基或饱和杂环基氧基；
A、B、C、D环中的化学键可以为单键，也可以为双键。
式（Ⅰ）中化合物选自以下化合物：
1.Swinhoeisterol A：C29H46O2，无色粉末，化学结构式如1所示；
2.Swinhoeisterol B：C29H46O3，无色晶体，化学结构式如2所示：
3.Swinhoeisterol C：C29H48O5，无色粉末，化学结构式如3所示；
4.Swinhoeisterol D：C29H46O6，无色晶体，化学结构式如4所示；
5.Swinhoeisterol E：C29H46O6，无色粉末，化学结构式如5所示。
本发明的第二方面，是提供上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物的制备方法。
将采自中国南海的新鲜海绵Theonella swinhoei冷冻后切碎后，用丙酮溶剂提取，所得的提取物浓缩后得到粗浸膏，将粗浸膏溶于水溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩后溶于90%甲醇溶液中，用石油醚萃取，所得萃取液浓缩得石油醚浸膏；石油醚浸膏干法上样进行硅胶柱色谱分离，以石油醚/二氯甲烷/丙酮（从20:1:0到0:1:10）为流动相梯度洗脱，得到19个组分（Fr.1-19）；其中Fr13进行Sephadex LH-20柱分离，用石油醚/二氯甲烷/丙酮（1.5:3:1）洗脱，TLC点板合并成5个组分（Fr13a-e）；Fr.13d和Fr.13e分别用制备型HPLC分离，获得化合物Swinhoeisterol A和Swinhoeisterol B；其中Fr14进行Sephadex LH-20柱分离，用石油醚/二氯甲烷/丙酮（1.5:3:1）洗脱，TLC点板合并成5个组分（Fr14a-f）；Fr.14d用制备型HPLC分离，获得化合物Swinhoeisterol C、Swinhoeisterol D和Swinhoeisterol E。
本发明的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物也可通过化学合成的方式制备得到。
本发明的第三方面，是提供上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物的制药用途。
本发明提供了上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤，具体为肺癌、结肠癌或骨肉瘤等。
本发明还提供了上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物在制备抗真菌药物中的应用。
所述的真菌，具体为白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌或新生隐球菌等。
本发明还提供了上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物在制备抗细菌药物中的应用。
所述的细菌，具体为大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林表皮葡萄球菌等。
本发明还提供了上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物在制备蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）抑制剂中的应用，可开发成治疗Ⅱ型糖尿病的药物。
本发明还提供了上述的6/6/5/7四环并环化合物或其衍生物在制备抗炎药物中的应用。
所述的抗炎药物的活性是具有COX-2抑制活性。
本发明的有益效果在于：
1、经体外抗肿瘤、体外抗真菌、体外抗细菌活性、体外PTP1B抑制活性和体外抗炎实验，本发明化合物对A549（人肺癌细胞）、Lovo（人结肠癌细胞）和MG63（人骨肉瘤细胞）等多种肿瘤细胞有明显抑制作用，对白念珠菌、近平滑念珠菌或热带念珠菌或新生隐球菌等多种真菌具有潜在的抗真菌活性，对大肠杆菌、巨大芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林表皮葡萄球菌等多种细菌具有潜在的抗细菌活性，对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）有潜在的抑制活性，对COX-2为靶点的炎症具有潜在的抗炎活性，对因此可用于制备抗肿瘤或抗真菌或抗细菌药物或PTP1B抑制剂或抗炎药物；
2、本发明为研制新的抗肿瘤或抗真菌或抗细菌药物或PTP1B抑制剂或抗炎药物提供了先导化合物，有利于开发利用海洋药用资源。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：本发明的化合物Swinhoeisterol A至E的制备
将采自中国南海的新鲜海绵Theonella swinhoei（由中科院青岛海洋所李锦和研究员鉴定）3.6kg冷冻后切碎后，用丙酮溶剂提取，所得的提取物浓缩后得到粗浸膏，将粗浸膏溶于水溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩后溶于90%甲醇溶液中，用石油醚萃取，所得萃取液浓缩得石油醚浸膏（13.6g）。石油醚浸膏干法上样进行硅胶柱色谱分离，以石油醚/二氯甲烷/丙酮（从20:1:0到0:1:10）为流动相梯度洗脱，得到19个组分（Fr.1-19）。
其中Fr13（2g）进行Sephadex LH-20柱分离，用石油醚/二氯甲烷/丙酮（1.5:3:1）洗脱，TLC点板合并成5个组分（Fr13a-e）。Fr.13d和Fr.13e分别用制备型HPLC分离，获得化合物Swinhoeisterol A(6.0mg,90%MeOH/H2O,2.0mL/min,tR=55.1min)和Swinhoeisterol B(2.5mg,94%MeOH/H2O,2.0mL/min,tR=22.4min)。
其中Fr14（1g）进行Sephadex LH-20柱分离，用石油醚/二氯甲烷/丙酮（1.5:3:1）洗脱，TLC点板合并成5个组分（Fr14a-f）。Fr.14d用制备型HPLC分离，获得化合物Swinhoeisterol C(5.0mg,93%MeOH/H2O,2.0mL/min,tR=30.1min)，Swinhoeisterol D(1.5mg,93%MeOH/H2O,2.0mL/min,tR=40.4min)和Swinhoeisterol E(2.1mg,94%MeOH/H2O,2.0mL/min,tR=60.4min)。
实施例2：本发明的化合物的鉴定
本发明从中国南海海绵Theonella swinhoei中分离到的5种新骨架的化合物，命名为Swinhoeisterol A–E，上述化合物具有如下化学结构式1-5：
1.Swinhoeisterol A：C29H46O2，无色粉末，化学结构式1，1H and13C NMR数据见表1。
2.Swinhoeisterol B：C29H46O3，无色晶体，化学结构式2，1H and13C NMR数据见表1。
3.Swinhoeisterol C：C29H48O5，无色粉末，化学结构式3，1H and13C NMR数据见表2。
4.Swinhoeisterol D：C29H46O6，无色晶体，化学结构式4，1H and13C NMR数据见表2。
5.Swinhoeisterol E：C29H46O6，无色粉末，化学结构式5，1H and13C NMR数据见表3。
表1.Swinhoeisterol A（化合物1）和Swinhoeisterol B（化合物2）的1H和13CNMR数据a
aδin ppm,in CDCl3,at500MHz for1H and125MHz for13C experiments.
表2.Swinhoeisterol C（化合物3）和Swinhoeisterol D（化合物4）的1H和13CNMR数据a
aδin ppm,in CDCl3,at500MHz for1H and125MHz for13C experiments.
表3.Swinhoeisterol E（化合物5）的1H和13C NMR数据a
aδin ppm,in CDCl3,at500MHz for1H and125MHz for13C experiments.
实施例3：本发明的具有6/6/5/7四环并环结构的化合物Swinhoeisterol A-E抗肿瘤实验
一、实验方法
采用常规的MTT法对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验。（MTT法参见如吕秋军主编《新药药理学研究方法》，化学工业出版社，2007：242-243）。
1.实验用细胞株：A549（人肺癌细胞）、Lovo（人结肠癌细胞）和MG63（人骨肉瘤细胞）。实验用细胞株来源于中国科学院细胞所。
2.实验试剂、耗材和仪器：
DMEM培养液（Invitrigen）；1640培养液（Invitrigen）；McCoy′s5a（Invitrigen）；血清（Invitrigen）；胰酶（Invitrigen）；DMSO(sigma)；MTT(sigma)；CCK8(日本同仁)；培养皿（Corning）；移液管（Corning）；96孔板（Corning）；CO2孵箱（SANYO）；酶标仪（Biotek76833）
3.实验用药：
本发明化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）
阳性对照药：阿霉素（Adriamycin）。
4.细胞培养
A549细胞培养：人肺腺癌细胞（A549）用含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃5%CO2条件下培养，待细胞铺满培养皿底70%～80%后，用0.25%的胰酶进行消化，调整细胞密度至105个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。
Lovo细胞培养：人结肠癌细胞（Lovo）用含有10%胎牛血清的DMEM培养培养液中，37℃5%CO2条件下培养，待细胞铺满培养皿底70%～80%后，用0.25%的胰酶进行消化，调整细胞密度至105个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。
MG63细胞培养：人骨肉瘤细胞（MG63），用含有10%胎牛血清的McCoy′s5a培养液中，37℃5%CO2条件下培养，待细胞达到106左右时，1000rpm5min离心传代，调整细胞密度至105个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。
5.细胞活力检测实验
A549、Lovo和MG63细胞活力检测实验：于实验前24h以104个/孔的细胞浓度接种96孔板。每孔分别给药1μl，终浓度分别达到30μg/ml，设立三个重复组、及DMSO阴性对照组和阿霉素（30μg/ml）阳性对照组。给药后，37℃5%CO2条件下孵育24h。每孔加入10μl5mg/mlMTT(噻唑蓝)，37℃5%CO2条件下孵育4h。吸去培养板中的细胞培养液。每孔加入150μl DMSO溶液，于37℃下摇床震荡15min。用酶标仪检测570nm下的OD值。
二、实验结果
通过MTT法测定化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）的体外细胞毒活性，各化合物的肿瘤细胞抑制率见表1，其中：样品浓度为30μg/ml，阿霉素浓度为30μg/ml；抑制率单位为%。
表4化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）的肿瘤细胞增殖抑制试验
化合物 A549 Lovo MG63
Swinhoeisterol A 12.6 13.4 10.3
Swinhoeisterol B 29.6 19.2 20.0
Swinhoeisterol C 9.2 9.2 10.4
Swinhoeisterol D 11.3 13.2 12.0
Swinhoeisterol E 19.1 18.9 24.1
阿霉素 3.08 3.56 3.17
由表4可见，化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）对A549（人肺癌细胞）、Lovo（人结肠癌细胞）和MG63（人骨肉瘤细胞）均有不同程度的要抑制作用。
实施例4：本发明具有6/6/5/7四环并环结构的化合物Swinhoeisterol A-E的抗真菌实验
一、实验方法
采用琼脂扩散法对本发明化合物进行体外抗菌试验（琼脂扩散法参见林勇主编《药用微生物基础》，化学工业出版社，2006，335-361）。
1、实验用菌株
均为临床株球状菌：白念珠菌，近平滑念珠菌，热带念珠菌，新生隐球菌，由长海医院真菌室提供，并经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA）划板活化，深部真菌于35℃培养一周，浅部真菌于28℃培养2周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
2、培养液
RPMI1640培养液：RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO32.0g，吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonic acid,MOPS,Sigma)34.5g(0.165M)，加三蒸水900ml溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，定容至1000ml，滤过消毒，4℃保存。沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4保存。
YEPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
3、实验用药
阳性对照：氟康唑(fluconazole)，酮康唑(ketoconazole)和伊曲康唑（ICZ）由第二军医大学药理学教研室提供。
4、测试方法
(1)菌液制备
实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取新生隐球菌、白念珠菌和近平滑念珠菌等球状菌少量，接种至1mlYEPD培养液，于35℃，250rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至1×103-5×103个/ml。
(2)药液制备
受试样品分别用DMSO配成6.4mg/ml的溶液，-20℃保存，实验前将药液取出置35℃温箱融化备用。
(3)药敏板制备
取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640100ml作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100ml；2号孔分别加菌液200ml和受试化合物溶液2ml。2～11号孔10级倍比稀释，使各孔中的药物终浓度分别为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25和0.125μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1%；12号孔不含药物，作阴性对照。各药敏板于35℃培养。
(4)MIC值判定
菌株分别于35℃培养24h和72h后，用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。与阴性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC80。
当样品的MIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC80值高于最高浓度64μg/ml时，计为>64μg/ml；MIC80值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为<0.125μg/ml。
上述实验均平行操作2到3次，当MIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC80值；当MIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
二、实验结果
对5种化合物进行了真菌的抑制活性筛选，结果显示Swinhoeisterol A-E（1-5）对4种真菌均有不同程度的抑制作用，见表5。
表5.抗真菌活性筛选(MIC80:μg/ml)
实施例5：本发明具有6/6/5/7四环并环结构的化合物Swinhoeisterol A-E的抗细菌实验
实验方法
采用琼脂扩散法对本发明化合物进行体外抗菌试验
1.试验用菌（由中国人民解放军第二军医大学海洋药物研究中心提供）
细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ATCC29213）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）。
2.实验用药
1）阳性对照药：青霉素(Penicillin)（购自哈药集团制药总厂）、链霉素(Streptomycin)（购自华北制药股份有限公司）；
2）阴性对照品：丙酮(Acetone)（购自国药集团化学试剂有限公司）；
3.实验步骤
将青霉素、链霉素、Swinhoeisterol A-E分别用丙酮配制成浓度为2mg/ml的溶液，单次测试用量25μl。将上述细菌按无菌操作的要求分别用7ml灭菌水配制成菌液，浓度为1.0×105cfu/ml，各用喷雾器取4ml菌液，分别均匀喷洒于各自培养皿的培养基表面（以Mueller-Hinton肉汤培养基培养实验菌，当其生长8-12h至约0.5个Mcfarland浓度时备用），再在每个培养皿内分别放置直径约1cm灭菌滤纸两块，覆盖于培养基表面，然后分别取上述配制的药液25μl滴于滤纸上，盖上培养皿盖子进行培养。各培养皿盖子上均注明相应培养基种类、菌种、化合物名称、接种时间。按时观察结果，测量抑菌圈的大小(半径)，平行试验3次，结果见表6。
表6.琼脂扩散实验活性筛选（mm）
样品 大肠杆菌 巨大芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 耐甲氧西林表皮葡萄球菌
Swinhoeisterol A 4.0 7.5 10.5 6.5
Swinhoeisterol B 8.5 9.5 13.0 13.5
Swinhoeisterol C 5.1 8.5 12.4 8.2
Swinhoeisterol D 11.5 14.3 10.3 15.1
Swinhoeisterol E 13.4 12.2 17.2 11.9
青霉素 6.5 6.0 15.0 \
链霉素 8.0 5.5 9.5 15.4
丙酮 \ \ \ \
由表6可见，Swinhoeisterol A-E（1-5）对大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。
实施例6：本发明具有6/6/5/7四环并环结构的化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）对PTP1B的抑制活性
PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一员，在体内各组织细胞中广泛表达，与酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）联合作用于各种蛋白底物，调节其酪氨酸磷酸化水平，进而调节细胞生理功能。PTP1B可以去磷酸化蛋白酪氨酸，在胰岛素信号转导通路中起着重要的负调控作用。上述研究表明，PTP1B有望成为治疗Ⅱ型糖尿病一个新的靶点。
活性测试采用磷酸酯酶测定法：是在30摄氏度，以适当浓度的磷酸对硝基苯酯（pNPP）作为底物的0.2mL反应液中进行。用50mL的3,3-戊二酸酯及1mL的EDTA配成pH=7.0的缓冲液。用0.15M的NaCl来保持溶液的离子强度，反应是通过加入酶开始，2-3分钟后通过加入1mL的1N NaOH来终止，底物非酶性质的水解是通过不加酶的测量系统来矫正的。对硝基苯酚产物的量是通过在405nm处，摩尔吸光系数为18000M-1cm-1的吸收来确定的。Michaelis-Menten动力学参数通过使用GraFit程序（Erithacus软件）直接将v对[S]数据带入Michaelis-Menten方程进行非线性回归得到。Ki值的测定：使用不同浓度的抑制剂，测定8个不同浓度的磷酸对硝基苯酯（0.2Km-5Km）的反应初速度，利用V=VmaxS/[Km(1+Ki)+S]方程得到（其中Ki值即IC50）。IC50值利用类似的方法得到。
上述实施例中制备得到的化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）抑制PTP1B的活性的IC50值分别为7.2，18.3，12.4，5.3和15.6μg/mL。
实施例7：本发明具有6/6/5/7四环并环结构的化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）的抗炎活性实验
为考察化合物的抗炎活性，对化合物Swinhoeisterol A-E（1-5）进行了抑制COX-2活性的筛选。
1、实验方法
2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酯（DCDHF-DA）、阳性对照药Celecoxib购于Sigma公司；上海Polarstar Plate Reader（BMG Labtechnologies,Australia）；Bac-to-BacTM重组杆状病毒表达系统、胎牛血清、RPMI-1640培养基、Grace培养液购于Gibco BRL公司，人单核细胞系THP-1和昆虫细胞Spodoptera frugiterda（sf-9）购于中科院上海生化细胞所。
THP-1细胞在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，Sf-9细胞于28℃下在含10％热灭活的胎牛血清的Grace培养液中培育。含重组人COX-2（hCOX-2）蛋白的昆虫sf-9细胞则按文献报道（史大永，李晓红，李敬，郭书举，苏华，海藻提取物环氧加酶-2抑制活性研究，海洋科学，2009，33，30-32）的方法制备，并在使用前储存于液氮中。所有测试化合物及对照药品溶于二甲亚砜中，并且二甲亚砜的最终浓度小于0.1%，花生四烯酸则溶于乙醇，乙醇的最终浓度小于0.1%。
含hCOX-2蛋白的sf-9细胞（1×105/mL）与受试化合物及阳性对照药（终浓度10μM）置于96孔板中预培养30min，再加入DCDHF-DA（终浓度2.5μM）和花生四烯酸（最终浓度2.5μM），10min后以485nm为激发波长，520nm的发射波长测定荧光吸收度，抑制率(IR%)的计算公式如下：
IR%=（C-Sam）/（C-B）*100
IR：Inhibitory rate；Sam：ROS production in drug treatment groups；B：Blank groups；C：Control groups
2、实验结果
表7.Swinhoeisterol A-E（1-5）抑制COX-2活性的筛选
样品 Celecoxib 1 2 3 4 5
抑制率(%，10μM) 40.0 53.2 57.9 27.1 36.8 44.3
由表7可见，Swinhoeisterol A-E（1-5）均具有不同程度的COX-2的抑制活性。
上述实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性或潜在的抗真菌活性或潜在的抗细菌活性或潜在的PTP1B抑制活性或潜在的抗炎活性，故可用于制备抗肿瘤或抗真菌或抗细菌药物或PTP1B抑制剂或抗炎药物，本发明为深入研究和开发新的抗肿瘤或抗真菌或抗细菌药物或PTP1B抑制剂或抗炎药物开辟了新的途径。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (12)

1.一类具有四环并环结构的化合物，其特征在于，所述的四环并环结构中各环碳数分别为6、6、5或7，其化学结构式如(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中：
R1、R2、R3、R4分别为A、B、C、D环上的一个或多个取代基，R1、R2、R3、R4彼此相同或不同，并且各自独立的为氢、卤素、羟基、过氧基、醚、氨基、硝基、巯基、羰基、腈基、羧基、烷基、环烷基、芳基。
2.一类具有四环并环结构的化合物，其特征在于，所述的化合物其化学结构式如1、2、3、4或5所示：
3.一种如权利要求1或2所述的具有四环并环结构的化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
将采自中国南海的新鲜海绵Theonella swinhoei冷冻后切碎后，用丙酮溶剂提取，所得的提取物浓缩后得到粗浸膏，将粗浸膏溶于水溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩后溶于90％甲醇溶液中，用石油醚萃取，所得萃取液浓缩得石油醚浸膏；石油醚浸膏干法上样进行硅胶柱色谱分离，以石油醚/二氯甲烷/丙酮从20:1:0到0:1:10为流动相梯度洗脱，得到19个组分Fr.1-19；其中Fr 13进行Sephadex LH-20柱分离，用石油醚/二氯甲烷/丙酮1.5:3:1洗脱，TLC点板合并成5个组分Fr.13a-e；Fr.13d和Fr.13e分别用制备型HPLC分离，获得化学结构式如1和2所示的化合物；其中Fr 14进行Sephadex LH-20柱分离，用石油醚/二氯甲烷/丙酮1.5:3:1洗脱，TLC点板合并成5个组分Fr.14a-f；Fr.14d用制备型HPLC分离，获得化学结构式如3、4和5所示的化合物。
4.一种如权利要求1或2所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌、结肠癌或骨肉瘤。
6.一种如权利要求1或2所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗真菌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的真菌为白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌或新生隐球菌。
8.一种如权利要求1或2所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗细菌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗细菌药物中的应用，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林表皮葡萄球菌。
10.一种如权利要求1或2所述的具有四环并环结构的化合物在制备蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B抑制剂中的应用。
11.一种如权利要求1或2所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗炎药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的具有四环并环结构的化合物在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，所述的抗炎药物的活性是具有COX-2抑制活性。
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