CN103214536A - 从珊瑚中分离得到的多羟基甾体类化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，本发明提供了从采自南海的两种珊瑚(Menella Kanisa，Dichotella gemmacea)中分离得到的一类多羟基甾体类化合物，这类多羟基甾体类化合物的化学结构通式如式（Ⅰ）所示。本发明还提供了这类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。用MTT法对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验，试验结果显示，本发明的大部分化合物对A549和MG63有较好抑制效果。本发明对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一类从珊瑚中分离得到的多羟基甾体类化合物及其应用。
背景技术
中国南海地处亚热带区域，珊瑚资源尤为丰富，是世界上珊瑚最集中分布的海域之一，目前全世界发现的6100多种珊瑚中，中国海域就有719种。珊瑚是无脊椎低等动物，为众多的生物提供栖息地，如多毛科，双壳科，腹足科，鱼类等。珊瑚虽然自身缺乏有效的物理防御能力，却能分泌一些化学防御物质，抵御病原虫和其他生物的侵扰，这一现象是国际上研究珊瑚体内次级代谢产物的理论基础。珊瑚依据消化腔的分支数目可以分为八放珊瑚和六放珊瑚两个亚纲，八放珊瑚亚纲中的软珊瑚和柳珊瑚因含有结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物而成为海洋天然产物研究的热点。
小月柳珊瑚（Menella Kanisa）属腔肠动物门（Coelenterata）珊瑚虫纲(Anthoaoa)八放珊瑚亚纲(Octocorallia)柳珊瑚目(Gorgonacea)类尖柳珊瑚科（Paramuriceidae）小月柳珊瑚属（Menella）动物。小月柳珊瑚我国主要分布于广东沿海海域。目前尚无该珊瑚化学成分的研究报道。
蕾二歧灯芯柳珊瑚（Dichotella gemmacea）属腔肠动物门（Coelenterata）珊瑚纲（Anthozoa）八放珊瑚亚纲（Octocorallia）柳珊瑚目（Gorgonacea）鞭柳珊瑚科（Ellisellidae）动物。已从该种柳珊瑚中分离得二萜类化合物约有60个，（详见Bowden,B.F.,Coll,J.C.,Konig,G.M.Studies of Australian Soft Corals.XLVIII.New Briaran Diterpenoids From the Gorgonian Coral Junceela gemmacea.Aust.J.Chem,1990,43,151-159;He,H.Y.and Faulkner,D.J.new cholrinated diterpenes from the gorgonian junceella gemmacea.Tetrahedron,1991,47,3271-3280.Sun,J.F.,Huang,X.Y.Yang,X.W.,Meng,L.,Huang,C.G.,Zhou,X.F.,Yang,B.,Hu,J.,Chen,X.Q.,Wang,L.S.and Liu,Y.H.Dichotellides A-E,five new iodine-containing briarane type diterpenoids from.Dichotella gemmacea.Tetrahedron,2011,67,1245-1250.Li,C.,La,M.-P.,Sun,P.,Kurtan,T.,Mandi,A.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.Bioactive(3Z,5E)-11,20-Epoxybriara-3,5-dien-7,18-olide Diterpenoids from the South China Sea Gorgonian Dichotella gemmacea.Mar.Drugs,2011,9,1403–1418;Li,C.,La, M.-P.,Li,L.,Li,X.-B.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Krohn,K.,Sun,P.,Yi,Y.H.,Zhang,W.Bioactive11,20-Epoxy-3,5(16)-diene Briarane Diterpenoids from the South China Sea Gorgonian Dichotella gemmacea.J.Nat.Prod,2011,74,1658–1662.Li,C.,La,M.-P.,Tang,H.;Pan,W.-H.,Sun,P.,Krohn,K.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.Bioactive briarane diterpenoids from the South China Sea gorgonian Dichotella gemmacea.Bioorg.Med.Chem,Lett.2012,22,4368–4372;Sun,J.-F.,Han,Z.,Zhou,X.-F.,Yang,B.,Lin,X.,Liu,J.,Peng,Y.,Yang,X.-W.,Liu,Y.Antifouling briarane type diterpenoids from South China Sea gorgonians Dichotella gemmacea.Tetrahedron,2013,69,871–880.）。到目前为止有关从该种柳珊瑚中分离到Briarane型二萜类化合物具有抗肿瘤或抗菌活性的报道（Sun,J.F.,Huang,X.Y.Yang,X.W.,Meng,L.,Huang,C.G.,Zhou,X.F.,Yang,B.,Hu,J.,Chen,X.Q.,Wang,L.S.and Liu,Y.H.Dichotellides A-E,five new iodine-containing briarane type diterpenoids from.Dichotella gemmacea.Tetrahedron,2011,67,1245-1250;Li,C.,La,M.-P.,Sun,P.,Kurtan,T.,Mandi,A.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.Bioactive(3Z,5E)-11,20-Epoxybriara-3,5-dien-7,18-olide Diterpenoids from the South China Sea Gorgonian Dichotella gemmacea.Mar.Drugs,2011,9,1403–1418;Li,C.,La,M.-P.,Li,L.,Li,X.-B.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Krohn,K.,Sun,P.,Yi,Y.H.,Zhang,W.Bioactive11,20-Epoxy-3,5(16)-diene Briarane Diterpenoids from the South China Sea Gorgonian Dichotella gemmacea.J.Nat.Prod,2011,74,1658–1662.Li,C.,La,M.-P.,Tang,H.;Pan,W.-H.,Sun,P.,Krohn,K.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.Bioactive briarane diterpenoids from the South China Sea gorgonian Dichotella gemmacea.Bioorg.Med.Chem,Lett.2012,22,4368–4372.）。尚无关于甾体皂苷的报道。
发明内容
本发明的目的是从采自南海的两种珊瑚：小月柳珊瑚(Menella Kanisa）和蕾二歧灯芯柳珊瑚（Dichotella gemmacea)中分离得到新的化合物，并进一步发现这些新的化合物在制药方面的应用。
本发明从采自南海的两种珊瑚：小月柳珊瑚(Menella Kanisa）和蕾二歧灯芯柳珊瑚（Dichotella gemmacea)中分离得到21个多羟基甾体类化合物，分别命名为：
(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇（1）、24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇（2）、24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（3）、(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮（4）、(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（5）、(24R,22E)-22-烯- 麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（6）、胆甾-1β,3β-二醇-6-酮（7）、(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（8）、24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（9）、24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（10）、(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（11）、(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（12）、24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（13）、24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（14）,24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇(15)、(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(16)和胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(17)，胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-L-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯（18）、24(28)-5-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯（(19)、(22E)-5-22-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯（(20)、胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-2′,25-双乙酸酯（21）。
其中化合物1-17是从小月柳珊瑚中分离得到的，化合物18-21是从蕾二歧灯芯柳珊瑚中分离得到的，这些多羟基甾体类化合物的化学结构通式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）中各化合物的取代基如下：
经氢谱碳谱解析和1H和13C核磁共振数据鉴定，其中化合物1～14及化合物18～21为新化合物。
本发明还提供了上述化合物1-21的分离提取方法如下：
1.化合物1-17的分离提取
取新鲜小月柳珊瑚洗净剪碎，用重量比为5～10倍的丙酮(丙酮中加入少量水)超声提取至提取液无色，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取数次，合并萃取液，减压回收乙醚至干，得总浸膏。将总浸膏用正相硅胶色谱（200～300目）分离，用石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将总浸膏合并成21个部分。
Fr.15部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:2）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.15-1～Fr.15-8。Fr.15-7部分再经过正相硅胶色谱（400-600目）分离，二氯甲烷:甲醇30:1洗脱，薄层板监测，将组分分成6个部分（Fr.15-7-1～Fr.15-7-6）。Fr.15-7-3通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇：水的体积比为90：10的混合溶剂进行洗脱，紫外检测器检测，收集24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（3）、(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮（4）、(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（5）、(24R,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（6）和(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α-二醇-6-酮（16）。
Fr.19部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:2）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.19-1～Fr.19-5。Fr.19-4部分再经过正相硅胶色谱（400-600目）分离，二氯甲烷:甲醇20:1洗脱，薄层板监测，将组分分成19个部分（Fr.19-4-1～Fr.19-4-19）。Fr.19-4-7用半制备型RP-HPLC纯化（流 动相，95%的甲醇-水），示差检测器检测，收集含胆甾-1β,3β-二醇-6-酮（7）的流份。
Fr.19-4-16用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，95%的甲醇-水），示差检测器检测，收集得到9个组分（Fr.19-4-16-1～Fr.19-4-16-9）。Fr.19-4-16-1用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，90%的甲醇-水），紫外检测器检测，收集含(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇（1）的流份；Fr.19-4-16-4用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，84%的甲醇-水），示差检测器检测，收集含胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（17）的流份。Fr.19-4-16-3用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，87%的甲醇-水），紫外检测器检测，收集得到9个流份（Fr.19-4-16-3-a～Fr.19-4-16-3-i），Fr.19-4-16-3-d浓缩得到(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（11）。Fr.19-4-16-3-g用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，90%的乙腈-水），紫外检测器检测，收集含24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（9）和24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（13）的流份。Fr.19-4-16-3-h用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，78%的乙腈-水），紫外检测器检测，收集含(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（8）和(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（12）的流份。Fr.19-4-16-3-i用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，93%的乙腈-水），紫外检测器检测，收集含24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（10）和24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（14）的流份。
Fr.20部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:2）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.20-1～Fr.20-6。Fr.20-3部分再经过正相硅胶色谱（400-600目）分离，二氯甲烷:甲醇20:1、15:1、10:1洗脱，薄层板监测，将组分分成9个部分（Fr.20-3-1～Fr.20-3-9）。Fr.20-3-8通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇：水的体积比为90：10的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集含24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇（2）和24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇（15）的流份，减压回收至干，得化合物24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇（2）和24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇（15）。
2.化合物18-21的分离提取
取新鲜蕾二歧灯芯柳珊瑚洗净剪碎，用重量比为5～10倍的丙酮(丙酮中加入少量水)超声提取至提取液无色，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙酸乙酯萃取数次，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯至干，得总浸膏，总浸膏分配在甲醇/正己烷中，得到甲醇层浸膏。将甲醇层浸膏用正相硅胶色谱（200～ 300目）分离，用正己烷/丙酮系统梯度洗脱，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将甲醇层浸膏合并成16个部分。
Fr.4部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:1）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.4-1～Fr.4-8。Fr.4-3用正相硅胶色谱（200～300目）分离，用正己烷/丙酮系统梯度洗脱，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将总浸膏合并成13个部分，Fr.3-1～Fr.3-13。Fr.3-13通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇：水的体积比为90：10的混合溶剂进行洗脱，示差测器检测，控制流速1.5ml/min，恒定柱温温度30℃，收集收集保留时间为29.3min的流份，浓缩得到18(10.0mg),收集保留时间为27.1min的流份，浓缩得到19(5.1mg,),收集保留时间为25.2min的流份，浓缩得到20(7.8mg),收集保留时间为31.5min的流份，浓缩得到21(3.5mg)。
本发明还提供了上述化合物1～21在制备抗肿瘤药物中的应用。
用MTT法对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验，试验结果显示，本发明的大部分化合物对A549（人肺癌细胞）和MG63（人骨肉瘤细胞）具有抑制作用。
本发明对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1.制备化合物1-17。
取中国广西北海海域的小月柳珊瑚（(Menella kanisa）7100g，洗净，剪碎，用5倍重量的丙酮超声提取，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取6次，每次1000ml，合并萃取液，回收乙醚并浓缩至干，得总浸膏22.5g。将总浸膏经正相硅胶色谱（200～300目）分离，以体积比为80:1、40:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:5、1:15的石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，根据薄层板监测，各流分按极性大小收集，共收集得21个部分Fr.1～Fr.21。
Fr.15部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:2）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.15-1～Fr.15-8。Fr.15-7部分再经过正相硅胶色谱（400-600目）分离纯化（二氯甲烷:甲醇30:1洗脱），薄层板监测， 将组分分成6个部分（Fr.15-7-1～Fr.15-7-6）。Fr.15-7-3通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇：水的体积比为90：10的混合溶剂进行洗脱，紫外检测器检测，控制流速1.5ml/min，恒定柱温温度30℃，收集保留时间为44.2min的流份，浓缩得到3(2.1mg)，收集保留时间为36.2min的流份，浓缩得到4(2.0mg)，收集保留时间为52.9min的流份，浓缩得到5(0.8mg)，收集保留时间为54.5min的流份，浓缩得到6(1.5mg)，收集保留时间为48.4min的流份，浓缩得到16(1.7mg)。
Fr.19部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:2）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.19-1～Fr.19-5。Fr.19-4部分再经过正相硅胶色谱（400-600目）分离，二氯甲烷:甲醇20:1洗脱，薄层板监测，将组分分成19个部分（Fr.19-4-1～Fr.19-4-19）。Fr.19-4-7用半制备型RP-HPLC纯化（流动相，95%的甲醇-水；流速：1.5ml/min；柱温：30℃），示差检测器检测，收集保留时间40min的流份，浓缩得到7(1.5mg)。
Fr.19-4-16用半制备型RP-HPLC纯化（流动相：95%的甲醇-水；流速：1.5ml/min；柱温：30℃），示差检测器检测，收集得到9个组分（Fr.19-4-16-1～Fr.19-4-16-9）。Fr.19-4-16-1用半制备型RP-HPLC纯化（流动相：90%的甲醇-水；流速：2.0ml/min；柱温：30℃），紫外检测器检测，收集保留时间12.5min的流份，浓缩得到1(1.5mg)；Fr.19-4-16-4用半制备型RP-HPLC纯化（流动相：84%的甲醇-水；流速：1.5ml/min；柱温：30℃），示差检测器检测，收集保留时间81.8min的流份，浓缩得到17(10.3mg)。Fr.19-4-16-3用半制备型RP-HPLC纯化（流动相：87%的甲醇-水；流速：2.0ml/min；柱温：30℃），紫外检测器检测，收集得到9个流份（Fr.19-4-16-3-a～Fr.19-4-16-3-i），Fr.19-4-16-3-d的保留时间44.6min，浓缩得到11(1.3mg)。Fr.19-4-16-3-g用半制备型RP-HPLC纯化（流动相：90%的乙腈-水；流速：2.0ml/min；柱温：30℃），紫外检测器检测，收集保留时间为19.2min的流份，浓缩得到9(1.2mg)，收集保留时间为17.8min的流份，浓缩得到13(1.1mg)。Fr.19-4-16-3-h用半制备型RP-HPLC纯化（流动相：78%的乙腈-水；流速：2.0ml/min；柱温：30℃），紫外检测器检测，收集保留时间为28.2min的流份，浓缩得到8(2.0mg)，收集保留时间为27.0min的流份，浓缩得到12(1.8mg)。Fr.19-4-16-3-i用半制备型RP-HPLC纯化（流动相：93%的乙腈-水；流速：2.0ml/min；柱温：30℃），紫外检测器检测，收集保留时间为19.5min的流份，浓缩得到10(0.9mg)，收集保留时间为18.1min 的流份，浓缩得到14(1.2mg)。
Fr.20部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:2）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.20-1～Fr.20-6。Fr.20-3部分再经过正相硅胶色谱（400-600目）分离，二氯甲烷:甲醇20:1、15:1、10:1洗脱，薄层板监测，将组分分成9个部分（Fr.20-3-1～Fr.20-3-9）。Fr.20-3-8通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇：水的体积比为90：10的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集保留时间为30.1min和36.1min，减压回收至干，得化合物2(3.5mg)和15(4.5mg)。
(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇（1）为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z485.3032[M+Cl]-，及碳谱氢谱解析,给出该化合物的分子式为C27H46O5，分子量为450；
0(c0.15,MeOH)；IR(film)νmax：3381,2925,2854,1459,1376,966cm-1；1H和13C核磁共振数据见表1。
24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇（2）为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z433.3319[M-H]-，及碳谱氢谱解析，给出该化合物的分子式C27H46O4，分子量434；-11.3(c0.35,MeOH)；IR(film)νmax:3307,2924,2852,1459,1376cm-1；1H和13C核磁共振数据见表2。
24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（3）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z429.3372[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C28H46O3,分子量430；
-7.3(c0.21,MeOH);IR(film)νmax:3308,2923,2852,1698,1459,1376,977cm-1；1H和13C核磁共振数据见表3。
(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮（4）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z401.3058[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C26H42O3,分子量402；
-24.8(c0.20,MeOH);IR(film)νmax:3305,2953,2852,1708,1463,1381,963cm-1；1H和13C核磁共振数据见表4。
(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（5）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z429.3373[M-H]-，结合氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C28H46O3,分子量430；
-8.3(c0.08,MeOH)；IR(film)νmax:3315,2930,2854,1712,1459,1371,963cm-1；1H和13C核 磁共振数据见表5。
(24R,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（6）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z429.3366[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C28H46O3,分子量430；
-42.5(c0.15,MeOH)；IR(film)νmax:3307,2926,2854,1698,1458,1370,970cm-1；1H和13C核磁共振数据见表6。
胆甾-1β,3β-二醇-6-酮（7）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z417.3366[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C27H46O3,分子量418；
-5.1(c0.15,MeOH)；IR(film)νmax:3371,2931,2868,1699,1467,1381cm-1；1H和13C核磁共振数据见表7。
(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（8）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3163[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432；
-29.0(c0.20,MeOH)；IR(film)νmax:3390,2927,2853,1698,1463,1377,1122,964cm-1；1H和 13C核磁共振数据见表8。
24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（9）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3158[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432；
-29.4(c0.12,MeOH)；IR(film)νmax:3377,2926,2854,1699,1463,1376,960cm-1；1H和13C核磁共振数据见表9。
24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（10）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z445.3315[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C28H46O4,分子量446；-23.8(c0.09,MeOH)；IR(film)νmax:3400,2929,2870,1698,1465,1379cm-1；1H和13C核磁共振数据见表10。
(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（11）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z417.3007[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C26H42O4,分子量418；
-22.2(c0.13,MeOH)；IR(film)νmax:3390,2926,2853,1698,1456,1378,962cm-1；1H和 13C核磁共振数据见表11。
(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（12）为白色粉末。由高分辨质谱 （HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3163[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432；
+31.1(c0.18,MeOH)；IR(film)νmax:3365,2924,2851,1698,1456,1382,965cm-1；1H和13C核磁共振数据见表12。
24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（13）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3159[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432；+35.9(c0.11,MeOH)；IR(film)νmax:3334,2925,2853,1690,1466,1377,963cm-1；1H和13C核磁共振数据见表13。
24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（14）为白色粉末。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z445.3321[M-H]-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C28H46O4,分子量446；
+59.6(c0.12,MeOH)；IR(film)νmax:3305,2923,2850,1689,1464,1378,960cm-1；1H和13C核磁共振数据见表14。
24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇（15）为白色粉末，由1H-NMR及结合文献确定化合物结构[Li,R.;Huang,Z.;Fang,Z.;Liu,X.Acta.Sci.Nat.Univ.Sunyatseni.1990,29,100-105&Yamada,Y.;Suzuki,K.;Iguchi,K.;Kikuchi,H.;Tsukitani,Y.;Horini,H.;Nakanishi,H.Chem.Pharm.Bull.1980,28,473-478.]。
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表1.(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇（1）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表2.24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇（2）的1H和13C核磁共振数据（CD3OD,400MHz/125MHz）
J值：偶合常数
表3.24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（3）的1H和13C核磁共振数据（CDCl3,400MHz/125MHz）
J值：偶合常数
表4.(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮（4）的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表5.(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（5）的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表6.(24R,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮（6）的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表7.胆甾-1β,3β-二醇-6-酮（7）的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表8.(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（8）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表9.24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（9）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125 MHz)
J值：偶合常数
表10.24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（10）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表11.(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮（11）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表12.(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（12）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表13.24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（13）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
表14.24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮（14）的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值：偶合常数
实施例2.制备化合物18-21
取中国广西北海海域的蕾二歧灯芯柳珊瑚（Dichotella gemmacea）3.5kg，洗净，剪碎，用5倍重量的丙酮超声提取，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙酸乙酯萃取6次，每次1000ml，合并萃取液，回收乙酸乙酯并浓缩至干，得总浸膏16.1g。总浸膏分配在甲醇/正己烷中，得到甲醇层浸膏11.2g。将甲醇层浸膏用正相硅胶色谱（200～300目）分离，用正己烷/丙酮系统梯度洗脱，流动相从100:0到0:100，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将甲醇层浸膏合并成16个部分。
Fr.4部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱（流动相：甲醇:氯仿=1:1）洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.4-1～Fr.4-8。Fr.4-3用正相硅胶色谱（200～300目）分离，以体积比为10:1、8:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的正己烷/丙酮系统梯度洗脱，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将总浸膏合并成13个部分，Fr.3-1～Fr.3-13。Fr.3-13通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇：水的体积比为90：10的混合溶剂进行洗脱，示差测器检测，控制流速1.5ml/min，恒定柱温温度30℃，收集收集保留时间为29.3min的流份，浓缩得到18(10.0mg),收集保留时间为27.1min的流份，浓缩得到19(5.1mg,),收集保留时间为25.2min的流份，浓缩得到20(7.8mg),收集保留时间为31.5min的流份，浓缩得到21(3.5mg)。
胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-L-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯（18）:白色 粉末;由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z615.3870[M+Na]+，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C34H56O8,分子量592;
–82.8(c0.27,CHCl3);IR(film)νmax:3370,2928,1734,1072,1014cm-1;1H和13C核磁共振数据见表15。
24(28),5二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(19):白色粉末;由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z627.3885[M+Na]+，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C35H56O8,分子量604;
–84.3(c0.17,CHCl3);IR(film)νmax:3379,2931,1735,1068,999cm-1;1H和13C核磁共振数据见表16。
(22E)-5,22-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(20):白色粉末;由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z613.3719[M+Na]+，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C34H54O8,分子量590;
–78.6(c0.26,CHCl3);IR(film)νmax:3418,2933,1732,1053,1015cm-1;1H和13C核磁共振数据见表17。
胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-2′,25-双乙酸酯(21):白色粉末;由高分辨质谱（HR-ESI-MS）中准分子离子峰提供的精确分子量m/z657.3976[M+Na]+，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C36H58O9,分子量634;
–86.5(c0.12,CHCl3);IR(film)νmax:3390,2928,1738,1073,1003cm-1;1H和13C核磁共振数据见表18。
表15.胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-L-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯（18）的1H和13C核磁共振数据(pyridine-d5,400MHz/100MHz)
J值：偶合常数
表16.24(28)-5-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯（19）的1H和 13C核磁共振数据(pyridine-d5,600MHz/150MHz)
J值：偶合常数
表17.(22E)-5,22-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯（20）的1H和13C核磁共振数据(pyridine-d5,600MHz/150MHz)
J值：偶合常数
表18.胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-2′,25-双乙酸酯（21）的1H和13C核磁共振数据(pyridine-d5,400MHz/100MHz)
J值：偶合常数
实施例3.本发明多羟基甾体类化合物1-21的抗肿瘤实验。
一、实验方法
采用常规的MTT法（Mosmann,T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J.Immunol.Methods1983,65,55-63）对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验。
1.实验用细胞株：A549（人肺癌细胞）和MG63（人骨肉瘤细胞）。实验用细胞株来自中国科学院细胞所。
2.实验试剂、耗材和仪器：
DMEM培养液（Invitrigen）；1640培养液（Invitrigen）；McCoy's5a（Invitrigen）；血清（Invitrigen）；胰酶（Invitrigen）；DMSO(sigma)；MTT(sigma)；CCK8(日本同仁)；培养皿（Corning）；移液管（Corning）；96孔板（Corning）；CO2孵箱（SANYO）；酶标仪（Biotek76833）
3.实验用药：
本发明化合物1～21由实施例1和2制备
阳性对照药：阿霉素（Adriamycin）,购自广东金泰嵘医药科技有限公司。
4.细胞培养
A549细胞培养：人肺腺癌细胞（A549）用含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃5%CO2条件下培养，待细胞铺满培养皿底70%～80%后，用0.25%的胰酶进行消化，调整细胞密度至105个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。
MG63细胞培养：人骨肉瘤细胞（MG63），用含有10%胎牛血清的McCoy's5a培养液中，37℃5%CO2条件下培养，待细胞达到106左右时，1000rpm5min离心传代，调整细胞密度至105个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。
5.细胞活力检测实验
A549和MG63细胞活力检测实验：于实验前24h以104个/孔的细胞浓度接种96孔板。每孔分别给药1μl，终浓度分别达到30μg/ml，设立三个重复组、 及DMSO阴性对照组和阿霉素（30μg/ml）阳性对照组。给药后，37℃5%CO2条件下孵育24h。每孔加入10μl5mg/ml MTT(噻唑蓝)，37℃5%CO2条件下孵育4h。吸去培养板中的细胞培养液。每孔加入150μlDMSO溶液，于37℃下摇床震荡15min。用酶标仪检测570nm下的OD值。
二、实验结果
通过MTT法测定化合物1-21体外细胞毒活性，各化合物的肿瘤细胞抑制率见表19。
表19化合物1-21的肿瘤细胞增殖抑制试验(IC50μM)
“-”代表没有活性。
表19显示，化合物2、5、7、14、15、17、18、20对两株细胞有较好活性；化何物21对A549没有活性，对MG63有较好活性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (3)
1.多羟基甾体类化合物，其化学结构通式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）中各化合物的取代基如下：
2.如权利要求1所述的多羟基甾体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.多羟基甾体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的多羟基甾体类化合物是24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇、(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α-二醇-6-酮或胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮。
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