CN103214536B - 从珊瑚中分离得到的多羟基甾体类化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,本发明提供了从采自南海的两种珊瑚(Menella?Kanisa,Dichotella?gemmacea)中分离得到的一类多羟基甾体类化合物,这类多羟基甾体类化合物的化学结构通式如式(Ⅰ)所示。本发明还提供了这类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。用MTT法对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验,试验结果显示,本发明的大部分化合物对A549和MG63有较好抑制效果。本发明对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一类从珊瑚中分离得到的多羟基甾体类化合物及其应用。
背景技术
中国南海地处亚热带区域,珊瑚资源尤为丰富,是世界上珊瑚最集中分布的海域之一,目前全世界发现的6100多种珊瑚中,中国海域就有719种。珊瑚是无脊椎低等动物,为众多的生物提供栖息地,如多毛科,双壳科,腹足科,鱼类等。珊瑚虽然自身缺乏有效的物理防御能力,却能分泌一些化学防御物质,抵御病原虫和其他生物的侵扰,这一现象是国际上研究珊瑚体内次级代谢产物的理论基础。珊瑚依据消化腔的分支数目可以分为八放珊瑚和六放珊瑚两个亚纲,八放珊瑚亚纲中的软珊瑚和柳珊瑚因含有结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物而成为海洋天然产物研究的热点。
小月柳珊瑚(MenellaKanisa)属腔肠动物门(Coelenterata)珊瑚虫纲(Anthoaoa)八放珊瑚亚纲(Octocorallia)柳珊瑚目(Gorgonacea)类尖柳珊瑚科(Paramuriceidae)小月柳珊瑚属(Menella)动物。小月柳珊瑚我国主要分布于广东沿海海域。目前尚无该珊瑚化学成分的研究报道。
蕾二歧灯芯柳珊瑚(Dichotellagemmacea)属腔肠动物门(Coelenterata)珊瑚纲(Anthozoa)八放珊瑚亚纲(Octocorallia)柳珊瑚目(Gorgonacea)鞭柳珊瑚科(Ellisellidae)动物。已从该种柳珊瑚中分离得二萜类化合物约有60个,(详见Bowden,B.F.,Coll,J.C.,Konig,G.M.StudiesofAustralianSoftCorals.XLVIII.NewBriaranDiterpenoidsFromtheGorgonianCoralJunceelagemmacea.Aust.J.Chem,1990,43,151-159;He,H.Y.andFaulkner,D.J.newcholrinatedditerpenesfromthegorgonianjunceellagemmacea.Tetrahedron,1991,47,3271-3280.Sun,J.F.,Huang,X.Y.Yang,X.W.,Meng,L.,Huang,C.G.,Zhou,X.F.,Yang,B.,Hu,J.,Chen,X.Q.,Wang,L.S.andLiu,Y.H.DichotellidesA-E,fivenewiodine-containingbriaranetypediterpenoidsfrom.Dichotellagemmacea.Tetrahedron,2011,67,1245-1250.Li,C.,La,M.-P.,Sun,P.,Kurtan,T.,Mandi,A.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.Bioactive(3Z,5E)-11,20-Epoxybriara-3,5-dien-7,18-olideDiterpenoidsfromtheSouthChinaSeaGorgonianDichotellagemmacea.Mar.Drugs,2011,9,1403–1418;Li,C.,La,M.-P.,Li,L.,Li,X.-B.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Krohn,K.,Sun,P.,Yi,Y.H.,Zhang,W.Bioactive11,20-Epoxy-3,5(16)-dieneBriaraneDiterpenoidsfromtheSouthChinaSeaGorgonianDichotellagemmacea.J.Nat.Prod,2011,74,1658–1662.Li,C.,La,M.-P.,Tang,H.;Pan,W.-H.,Sun,P.,Krohn,K.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.BioactivebriaranediterpenoidsfromtheSouthChinaSeagorgonianDichotellagemmacea.Bioorg.Med.Chem,Lett.2012,22,4368–4372;Sun,J.-F.,Han,Z.,Zhou,X.-F.,Yang,B.,Lin,X.,Liu,J.,Peng,Y.,Yang,X.-W.,Liu,Y.AntifoulingbriaranetypediterpenoidsfromSouthChinaSeagorgoniansDichotellagemmacea.Tetrahedron,2013,69,871–880.)。到目前为止有关从该种柳珊瑚中分离到Briarane型二萜类化合物具有抗肿瘤或抗菌活性的报道(Sun,J.F.,Huang,X.Y.Yang,X.W.,Meng,L.,Huang,C.G.,Zhou,X.F.,Yang,B.,Hu,J.,Chen,X.Q.,Wang,L.S.andLiu,Y.H.DichotellidesA-E,fivenewiodine-containingbriaranetypediterpenoidsfrom.Dichotellagemmacea.Tetrahedron,2011,67,1245-1250;Li,C.,La,M.-P.,Sun,P.,Kurtan,T.,Mandi,A.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.Bioactive(3Z,5E)-11,20-Epoxybriara-3,5-dien-7,18-olideDiterpenoidsfromtheSouthChinaSeaGorgonianDichotellagemmacea.Mar.Drugs,2011,9,1403–1418;Li,C.,La,M.-P.,Li,L.,Li,X.-B.,Tang,H.,Liu,B.-S.,Krohn,K.,Sun,P.,Yi,Y.H.,Zhang,W.Bioactive11,20-Epoxy-3,5(16)-dieneBriaraneDiterpenoidsfromtheSouthChinaSeaGorgonianDichotellagemmacea.J.Nat.Prod,2011,74,1658–1662.Li,C.,La,M.-P.,Tang,H.;Pan,W.-H.,Sun,P.,Krohn,K.,Yi,Y.H.,Li,L.,Zhang,W.BioactivebriaranediterpenoidsfromtheSouthChinaSeagorgonianDichotellagemmacea.Bioorg.Med.Chem,Lett.2012,22,4368–4372.)。尚无关于甾体皂苷的报道。
发明内容
本发明的目的是从采自南海的两种珊瑚:小月柳珊瑚(MenellaKanisa)和蕾二歧灯芯柳珊瑚(Dichotellagemmacea)中分离得到新的化合物,并进一步发现这些新的化合物在制药方面的应用。
本发明从采自南海的两种珊瑚:小月柳珊瑚(MenellaKanisa)和蕾二歧灯芯柳珊瑚(Dichotellagemmacea)中分离得到21个多羟基甾体类化合物,分别命名为:
(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇(1)、24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇(2)、24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(3)、(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(4)、(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(5)、(24R,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(6)、胆甾-1β,3β-二醇-6-酮(7)、(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(8)、24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(9)、24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(10)、(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(11)、(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(12)、24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(13)、24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(14),24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇(15)、(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(16)和胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(17),胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-L-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(18)、24(28)-5-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯((19)、(22E)-5-22-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯((20)、胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-2′,25-双乙酸酯(21)。
其中化合物1-17是从小月柳珊瑚中分离得到的,化合物18-21是从蕾二歧灯芯柳珊瑚中分离得到的,这些多羟基甾体类化合物的化学结构通式如式(Ⅰ)所示:
式(Ⅰ)中各化合物的取代基如下:
经氢谱碳谱解析和1H和13C核磁共振数据鉴定,其中化合物1~14及化合物18~21为新化合物。
本发明还提供了上述化合物1-21的分离提取方法如下:
1.化合物1-17的分离提取
取新鲜小月柳珊瑚洗净剪碎,用重量比为5~10倍的丙酮(丙酮中加入少量水)超声提取至提取液无色,减压回收丙酮至无丙酮味,用等体积水分散,乙醚萃取数次,合并萃取液,减压回收乙醚至干,得总浸膏。将总浸膏用正相硅胶色谱(200~300目)分离,用石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱,通过薄层板监测,根据馏分极性大小收集,将总浸膏合并成21个部分。
Fr.15部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:2)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.15-1~Fr.15-8。Fr.15-7部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离,二氯甲烷:甲醇30:1洗脱,薄层板监测,将组分分成6个部分(Fr.15-7-1~Fr.15-7-6)。Fr.15-7-3通过半制备型RP-HPLC纯化,以甲醇:水的体积比为90:10的混合溶剂进行洗脱,紫外检测器检测,收集24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(3)、(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(4)、(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(5)、(24R,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(6)和(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(16)。
Fr.19部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:2)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.19-1~Fr.19-5。Fr.19-4部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离,二氯甲烷:甲醇20:1洗脱,薄层板监测,将组分分成19个部分(Fr.19-4-1~Fr.19-4-19)。Fr.19-4-7用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,95%的甲醇-水),示差检测器检测,收集含胆甾-1β,3β-二醇-6-酮(7)的流份。
Fr.19-4-16用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,95%的甲醇-水),示差检测器检测,收集得到9个组分(Fr.19-4-16-1~Fr.19-4-16-9)。Fr.19-4-16-1用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,90%的甲醇-水),紫外检测器检测,收集含(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇(1)的流份;Fr.19-4-16-4用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,84%的甲醇-水),示差检测器检测,收集含胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(17)的流份。Fr.19-4-16-3用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,87%的甲醇-水),紫外检测器检测,收集得到9个流份(Fr.19-4-16-3-a~Fr.19-4-16-3-i),Fr.19-4-16-3-d浓缩得到(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(11)。Fr.19-4-16-3-g用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,90%的乙腈-水),紫外检测器检测,收集含24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(9)和24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(13)的流份。Fr.19-4-16-3-h用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,78%的乙腈-水),紫外检测器检测,收集含(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(8)和(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(12)的流份。Fr.19-4-16-3-i用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,93%的乙腈-水),紫外检测器检测,收集含24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(10)和24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(14)的流份。
Fr.20部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:2)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.20-1~Fr.20-6。Fr.20-3部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离,二氯甲烷:甲醇20:1、15:1、10:1洗脱,薄层板监测,将组分分成9个部分(Fr.20-3-1~Fr.20-3-9)。Fr.20-3-8通过半制备型RP-HPLC纯化,以甲醇:水的体积比为90:10的混合溶剂进行洗脱,示差检测器监测,收集含24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇(2)和24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇(15)的流份,减压回收至干,得化合物24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇(2)和24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇(15)。
2.化合物18-21的分离提取
取新鲜蕾二歧灯芯柳珊瑚洗净剪碎,用重量比为5~10倍的丙酮(丙酮中加入少量水)超声提取至提取液无色,减压回收丙酮至无丙酮味,用等体积水分散,乙酸乙酯萃取数次,合并萃取液,减压回收乙酸乙酯至干,得总浸膏,总浸膏分配在甲醇/正己烷中,得到甲醇层浸膏。将甲醇层浸膏用正相硅胶色谱(200~300目)分离,用正己烷/丙酮系统梯度洗脱,通过薄层板监测,根据馏分极性大小收集,将甲醇层浸膏合并成16个部分。
Fr.4部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:1)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.4-1~Fr.4-8。Fr.4-3用正相硅胶色谱(200~300目)分离,用正己烷/丙酮系统梯度洗脱,通过薄层板监测,根据馏分极性大小收集,将总浸膏合并成13个部分,Fr.3-1~Fr.3-13。Fr.3-13通过半制备型RP-HPLC纯化,以甲醇:水的体积比为90:10的混合溶剂进行洗脱,示差测器检测,控制流速1.5ml/min,恒定柱温温度30℃,收集收集保留时间为29.3min的流份,浓缩得到18(10.0mg),收集保留时间为27.1min的流份,浓缩得到19(5.1mg,),收集保留时间为25.2min的流份,浓缩得到20(7.8mg),收集保留时间为31.5min的流份,浓缩得到21(3.5mg)。
本发明还提供了上述化合物1~21在制备抗肿瘤药物中的应用。
用MTT法对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验,试验结果显示,本发明的大部分化合物对A549(人肺癌细胞)和MG63(人骨肉瘤细胞)具有抑制作用。
本发明对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1.制备化合物1-17。
取中国广西北海海域的小月柳珊瑚((Menellakanisa)7100g,洗净,剪碎,用5倍重量的丙酮超声提取,减压回收丙酮至无丙酮味,用等体积水分散,乙醚萃取6次,每次1000ml,合并萃取液,回收乙醚并浓缩至干,得总浸膏22.5g。将总浸膏经正相硅胶色谱(200~300目)分离,以体积比为80:1、40:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:5、1:15的石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱,根据薄层板监测,各流分按极性大小收集,共收集得21个部分Fr.1~Fr.21。
Fr.15部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:2)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.15-1~Fr.15-8。Fr.15-7部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离纯化(二氯甲烷:甲醇30:1洗脱),薄层板监测,将组分分成6个部分(Fr.15-7-1~Fr.15-7-6)。Fr.15-7-3通过半制备型RP-HPLC纯化,以甲醇:水的体积比为90:10的混合溶剂进行洗脱,紫外检测器检测,控制流速1.5ml/min,恒定柱温温度30℃,收集保留时间为44.2min的流份,浓缩得到3(2.1mg),收集保留时间为36.2min的流份,浓缩得到4(2.0mg),收集保留时间为52.9min的流份,浓缩得到5(0.8mg),收集保留时间为54.5min的流份,浓缩得到6(1.5mg),收集保留时间为48.4min的流份,浓缩得到16(1.7mg)。
Fr.19部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:2)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.19-1~Fr.19-5。Fr.19-4部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离,二氯甲烷:甲醇20:1洗脱,薄层板监测,将组分分成19个部分(Fr.19-4-1~Fr.19-4-19)。Fr.19-4-7用半制备型RP-HPLC纯化(流动相,95%的甲醇-水;流速:1.5ml/min;柱温:30℃),示差检测器检测,收集保留时间40min的流份,浓缩得到7(1.5mg)。
Fr.19-4-16用半制备型RP-HPLC纯化(流动相:95%的甲醇-水;流速:1.5ml/min;柱温:30℃),示差检测器检测,收集得到9个组分(Fr.19-4-16-1~Fr.19-4-16-9)。Fr.19-4-16-1用半制备型RP-HPLC纯化(流动相:90%的甲醇-水;流速:2.0ml/min;柱温:30℃),紫外检测器检测,收集保留时间12.5min的流份,浓缩得到1(1.5mg);Fr.19-4-16-4用半制备型RP-HPLC纯化(流动相:84%的甲醇-水;流速:1.5ml/min;柱温:30℃),示差检测器检测,收集保留时间81.8min的流份,浓缩得到17(10.3mg)。Fr.19-4-16-3用半制备型RP-HPLC纯化(流动相:87%的甲醇-水;流速:2.0ml/min;柱温:30℃),紫外检测器检测,收集得到9个流份(Fr.19-4-16-3-a~Fr.19-4-16-3-i),Fr.19-4-16-3-d的保留时间44.6min,浓缩得到11(1.3mg)。Fr.19-4-16-3-g用半制备型RP-HPLC纯化(流动相:90%的乙腈-水;流速:2.0ml/min;柱温:30℃),紫外检测器检测,收集保留时间为19.2min的流份,浓缩得到9(1.2mg),收集保留时间为17.8min的流份,浓缩得到13(1.1mg)。Fr.19-4-16-3-h用半制备型RP-HPLC纯化(流动相:78%的乙腈-水;流速:2.0ml/min;柱温:30℃),紫外检测器检测,收集保留时间为28.2min的流份,浓缩得到8(2.0mg),收集保留时间为27.0min的流份,浓缩得到12(1.8mg)。Fr.19-4-16-3-i用半制备型RP-HPLC纯化(流动相:93%的乙腈-水;流速:2.0ml/min;柱温:30℃),紫外检测器检测,收集保留时间为19.5min的流份,浓缩得到10(0.9mg),收集保留时间为18.1min的流份,浓缩得到14(1.2mg)。
Fr.20部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:2)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.20-1~Fr.20-6。Fr.20-3部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离,二氯甲烷:甲醇20:1、15:1、10:1洗脱,薄层板监测,将组分分成9个部分(Fr.20-3-1~Fr.20-3-9)。Fr.20-3-8通过半制备型RP-HPLC纯化,以甲醇:水的体积比为90:10的混合溶剂进行洗脱,示差检测器监测,收集保留时间为30.1min和36.1min,减压回收至干,得化合物2(3.5mg)和15(4.5mg)。
(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇(1)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z485.3032[M+Cl]-,及碳谱氢谱解析,给出该化合物的分子式为C27H46O5,分子量为450;0(c0.15,MeOH);IR(film)νmax:3381,2925,2854,1459,1376,966cm-1;1H和13C核磁共振数据见表1。
24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇(2)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z433.3319[M-H]-,及碳谱氢谱解析,给出该化合物的分子式C27H46O4,分子量434;-11.3(c0.35,MeOH);IR(film)νmax:3307,2924,2852,1459,1376cm-1;1H和13C核磁共振数据见表2。
24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(3)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z429.3372[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C28H46O3,分子量430;-7.3(c0.21,MeOH);IR(film)νmax:3308,2923,2852,1698,1459,1376,977cm-1;1H和13C核磁共振数据见表3。
(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(4)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z401.3058[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C26H42O3,分子量402;-24.8(c0.20,MeOH);IR(film)νmax:3305,2953,2852,1708,1463,1381,963cm-1;1H和13C核磁共振数据见表4。
(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(5)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z429.3373[M-H]-,结合氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C28H46O3,分子量430;-8.3(c0.08,MeOH);IR(film)νmax:3315,2930,2854,1712,1459,1371,963cm-1;1H和13C核磁共振数据见表5。
(24R,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(6)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z429.3366[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C28H46O3,分子量430;-42.5(c0.15,MeOH);IR(film)νmax:3307,2926,2854,1698,1458,1370,970cm-1;1H和13C核磁共振数据见表6。
胆甾-1β,3β-二醇-6-酮(7)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z417.3366[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C27H46O3,分子量418;-5.1(c0.15,MeOH);IR(film)νmax:3371,2931,2868,1699,1467,1381cm-1;1H和13C核磁共振数据见表7。
(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(8)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3163[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432;-29.0(c0.20,MeOH);IR(film)νmax:3390,2927,2853,1698,1463,1377,1122,964cm-1;1H和13C核磁共振数据见表8。
24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(9)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3158[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432;-29.4(c0.12,MeOH);IR(film)νmax:3377,2926,2854,1699,1463,1376,960cm-1;1H和13C核磁共振数据见表9。
24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(10)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z445.3315[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C28H46O4,分子量446;-23.8(c0.09,MeOH);IR(film)νmax:3400,2929,2870,1698,1465,1379cm-1;1H和13C核磁共振数据见表10。
(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(11)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z417.3007[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C26H42O4,分子量418;-22.2(c0.13,MeOH);IR(film)νmax:3390,2926,2853,1698,1456,1378,962cm-1;1H和13C核磁共振数据见表11。
(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(12)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3163[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432;+31.1(c0.18,MeOH);IR(film)νmax:3365,2924,2851,1698,1456,1382,965cm-1;1H和13C核磁共振数据见表12。
24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(13)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z431.3159[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C27H44O4,分子量432;+35.9(c0.11,MeOH);IR(film)νmax:3334,2925,2853,1690,1466,1377,963cm-1;1H和13C核磁共振数据见表13。
24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(14)为白色粉末。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z445.3321[M-H]-,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C28H46O4,分子量446;+59.6(c0.12,MeOH);IR(film)νmax:3305,2923,2850,1689,1464,1378,960cm-1;1H和13C核磁共振数据见表14。
24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α,6β-四醇(15)为白色粉末,由1H-NMR及结合文献确定化合物结构[Li,R.;Huang,Z.;Fang,Z.;Liu,X.Acta.Sci.Nat.Univ.Sunyatseni.1990,29,100-105&Yamada,Y.;Suzuki,K.;Iguchi,K.;Kikuchi,H.;Tsukitani,Y.;Horini,H.;Nakanishi,H.Chem.Pharm.Bull.1980,28,473-478.]。
(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(16)为白色粉末,1H-NMR,13C-NMR,DEPT,HSQC,HMBC及结合文献确定化合物结构[Yasuyuki,E.;Yuichi,H.;Hiroshi,F.;Koichi.S.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications.1993,194,1529-1535.]。
胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(17)为白色粉末,1H-NMR及结合文献确定化合物结构[Qiu,Y.-Q.;Qi,S.-H.;Zhang,S.;Yang,J.;Xiao,Z.-H.Pharmazie.2006,61,645-647.]。
表1.(23E)-23-烯-胆甾-25-过氧-3β,5α,6β-三醇(1)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表2.24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α,6β-四醇(2)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表3.24(28)-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(3)的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表4.(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β,5α-二醇-6-酮(4)的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表5.(24S,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(5)的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表6.(24R,22E)-22-烯-麦角甾-3β,5α-二醇-6-酮(6)的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表7.胆甾-1β,3β-二醇-6-酮(7)的1H和13C核磁共振数据(CDCl3,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表8.(22E)-22-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(8)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表9.24(25)-烯-胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(9)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表10.24(28)-烯-麦角甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(10)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表11.(22E)-22-烯-24-降胆甾-1β,3β,5α-三醇-6-酮(11)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表12.(22E)-22-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(12)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表13.24(25)-烯-胆甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(13)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
表14.24(28)-烯-麦角甾-3β,5α,6β-三醇-1-酮(14)的1H和13C核磁共振数据(CD3OD,400MHz/125MHz)
J值:偶合常数
实施例2.制备化合物18-21
取中国广西北海海域的蕾二歧灯芯柳珊瑚(Dichotellagemmacea)3.5kg,洗净,剪碎,用5倍重量的丙酮超声提取,减压回收丙酮至无丙酮味,用等体积水分散,乙酸乙酯萃取6次,每次1000ml,合并萃取液,回收乙酸乙酯并浓缩至干,得总浸膏16.1g。总浸膏分配在甲醇/正己烷中,得到甲醇层浸膏11.2g。将甲醇层浸膏用正相硅胶色谱(200~300目)分离,用正己烷/丙酮系统梯度洗脱,流动相从100:0到0:100,通过薄层板监测,根据馏分极性大小收集,将甲醇层浸膏合并成16个部分。
Fr.4部分经过SephandexLH-20凝胶柱色谱(流动相:甲醇:氯仿=1:1)洗脱,根据薄层板检测监测,收集合并得Fr.4-1~Fr.4-8。Fr.4-3用正相硅胶色谱(200~300目)分离,以体积比为10:1、8:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的正己烷/丙酮系统梯度洗脱,通过薄层板监测,根据馏分极性大小收集,将总浸膏合并成13个部分,Fr.3-1~Fr.3-13。Fr.3-13通过半制备型RP-HPLC纯化,以甲醇:水的体积比为90:10的混合溶剂进行洗脱,示差测器检测,控制流速1.5ml/min,恒定柱温温度30℃,收集收集保留时间为29.3min的流份,浓缩得到18(10.0mg),收集保留时间为27.1min的流份,浓缩得到19(5.1mg,),收集保留时间为25.2min的流份,浓缩得到20(7.8mg),收集保留时间为31.5min的流份,浓缩得到21(3.5mg)。
胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-L-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(18):白色粉末;由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z615.3870[M+Na]+,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C34H56O8,分子量592;–82.8(c0.27,CHCl3);IR(film)νmax:3370,2928,1734,1072,1014cm-1;1H和13C核磁共振数据见表15。
24(28),5二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(19):白色粉末;由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z627.3885[M+Na]+,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C35H56O8,分子量604;–84.3(c0.17,CHCl3);IR(film)νmax:3379,2931,1735,1068,999cm-1;1H和13C核磁共振数据见表16。
(22E)-5,22-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(20):白色粉末;由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z613.3719[M+Na]+,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C34H54O8,分子量590;–78.6(c0.26,CHCl3);IR(film)νmax:3418,2933,1732,1053,1015cm-1;1H和13C核磁共振数据见表17。
胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-2′,25-双乙酸酯(21):白色粉末;由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z657.3976[M+Na]+,及氢谱碳谱解析,给出该化合物的分子式为C36H58O9,分子量634;–86.5(c0.12,CHCl3);IR(film)νmax:3390,2928,1738,1073,1003cm-1;1H和13C核磁共振数据见表18。
表15.胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-L-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(18)的1H和13C核磁共振数据(pyridine-d5,400MHz/100MHz)
J值:偶合常数
表16.24(28)-5-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(19)的1H和13C核磁共振数据(pyridine-d5,600MHz/150MHz)
J值:偶合常数
表17.(22E)-5,22-二烯-胆甾-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-25-单乙酸酯(20)的1H和13C核磁共振数据(pyridine-d5,600MHz/150MHz)
J值:偶合常数
表18.胆甾-5-烯-3β,19,25-三醇-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷-2′,25-双乙酸酯(21)的1H和13C核磁共振数据(pyridine-d5,400MHz/100MHz)
J值:偶合常数
实施例3.本发明多羟基甾体类化合物1-21的抗肿瘤实验。
一、实验方法
采用常规的MTT法(Mosmann,T.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.J.Immunol.Methods1983,65,55-63)对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验。
1.实验用细胞株:A549(人肺癌细胞)和MG63(人骨肉瘤细胞)。实验用细胞株来自中国科学院细胞所。
2.实验试剂、耗材和仪器:
DMEM培养液(Invitrigen);1640培养液(Invitrigen);McCoy's5a(Invitrigen);血清(Invitrigen);胰酶(Invitrigen);DMSO(sigma);MTT(sigma);CCK8(日本同仁);培养皿(Corning);移液管(Corning);96孔板(Corning);CO2孵箱(SANYO);酶标仪(Biotek76833)
3.实验用药:
本发明化合物1~21由实施例1和2制备
阳性对照药:阿霉素(Adriamycin),购自广东金泰嵘医药科技有限公司。
4.细胞培养
A549细胞培养:人肺腺癌细胞(A549)用含有10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃5%CO2条件下培养,待细胞铺满培养皿底70%~80%后,用0.25%的胰酶进行消化,调整细胞密度至105个/ml,以每孔100μl接种于96孔板中,于18~24h后进行实验。
MG63细胞培养:人骨肉瘤细胞(MG63),用含有10%胎牛血清的McCoy's5a培养液中,37℃5%CO2条件下培养,待细胞达到106左右时,1000rpm5min离心传代,调整细胞密度至105个/ml,以每孔100μl接种于96孔板中,于18~24h后进行实验。
5.细胞活力检测实验
A549和MG63细胞活力检测实验:于实验前24h以104个/孔的细胞浓度接种96孔板。每孔分别给药1μl,终浓度分别达到30μg/ml,设立三个重复组、及DMSO阴性对照组和阿霉素(30μg/ml)阳性对照组。给药后,37℃5%CO2条件下孵育24h。每孔加入10μl5mg/mlMTT(噻唑蓝),37℃5%CO2条件下孵育4h。吸去培养板中的细胞培养液。每孔加入150μlDMSO溶液,于37℃下摇床震荡15min。用酶标仪检测570nm下的OD值。
二、实验结果
通过MTT法测定化合物1-21体外细胞毒活性,各化合物的肿瘤细胞抑制率见表19。
表19化合物1-21的肿瘤细胞增殖抑制试验(IC50μM)
“-”代表没有活性。
表19显示,化合物2、5、7、14、15、17、18、20对两株细胞有较好活性;化何物21对A549没有活性,对MG63有较好活性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (2)
1.多羟基甾体类化合物,其化学结构通式如式(Ⅰ)所示:
式(Ⅰ)中各化合物的取代基如下:
2.如权利要求1所述的多羟基甾体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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