CN109134491A

CN109134491A - 双氢青蒿素衍生物在制备治疗非自身免疫滑膜炎药物中的应用

Info

Publication number: CN109134491A
Application number: CN201810851406.9A
Authority: CN
Inventors: 刘吉华; 余伯阳; 樊梦霖
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明公开了四种双氢青蒿素衍生物（DC24,32,37,38）在治疗非自身免疫滑膜炎中的应用及其作用机制。在抗LPS诱导的RAW264.7细胞NO生成和软骨损伤、抗骨关节炎性滑膜炎、抗运动性滑膜炎和抗急性创伤性滑膜炎研究中，四种双氢青蒿素衍生物显示出优于已有青蒿素类药物的抗炎及软骨保护活性，并且对多种非自身免疫滑膜炎具有良好治疗作用。其可能的抗炎作用机制为四种双氢青蒿素均可通过抑制NF‑κB信号通路的激活，下调TNF‑α、IL‑1β水平发挥抗炎作用。

Description

双氢青蒿素衍生物在制备治疗非自身免疫滑膜炎药物中的应用

技术领域

本发明属于化学医药领域。具体地说是涉及新型双氢青蒿素衍生物在治疗非自身免疫性滑膜炎中的应用。

背景技术

滑膜炎(synovitis)是指具有滑膜的组织由于受到机械、生物、化学等刺激，产生炎性反应，引起滑膜组织充血、水肿、血管通透性增高，滑液过度分泌，吸收减少，从而导致关节肿胀、疼痛、关节腔积液、活动受限等的一种关节病变。病理改变为滑膜细胞增生，血管生成和炎性细胞浸润^1-3。

膝关节是全身关节中滑膜最多的关节，因此滑膜炎以膝关节较为多见。导致膝关节滑膜炎形成的原因众多，临床上多由于急慢性创伤或慢性劳损所致的滑膜无菌性炎症。膝关节滑膜炎分为急性滑膜炎和慢性滑膜炎两种。

1.急性滑膜炎

急性滑膜炎多由外伤所致。膝关节遭受骨折、脱位、韧带断裂、软骨损伤等创伤后，关节、滑膜同时受损，膝关节发热、肿痛、筋肉拘挛、关节屈伸障碍，形成急性滑膜炎⁴。

1.1创伤性滑膜炎

创伤性滑膜炎是膝关节受到损伤(创伤、手术等)后引起的滑膜非感染性炎症反应性疾病。病理表现为关节滑膜层损伤，滑膜血管扩张、充血，产生大量渗出液，红细胞、白细胞、浆细胞及巨噬细胞、胆红素、脂肪、纤维素等外渗，同时滑膜细胞活跃增生，产生大量粘液素，关节积液肿胀。其急性期如未及时有效控制，有12.6％的患者形成顽固性、反复发作的慢性滑膜炎，严重影响生活质量及运动能力。目前研究者认为其发生机制可能为：①刺激损伤感觉神经末梢或传入神经，发生初期炎症反应；②刺激损伤组织，引起代谢及理化方面的转变，表现为原发性变质，并释放和生成某些生物活性物质；③致炎因子或炎症灶的代谢产物被吸收入血，引起相应器官和神经体液调节作用改变，导致全身发生炎症反应⁵。因此，在急性期快速、有效地终止炎症反应、促进组织修复是治疗此类滑膜炎的重点，对骨关节的保护和预后至关重要^6,7。

1.2运动性膝关节创伤性滑膜炎

当膝关节长时间单一动作超量运动之后，关节腔内压升高，氧分压下降，滑膜组织充血、水肿，红、白细胞及纤维素渗出，某程度与运动量正相关。当渗出速度超过滑膜代偿性的吸收速度时，关节积液、肿胀，进而使关节腔内压继续升高，氧分压再度下降，形成恶性循环。久之滑膜退变，脂肪化生等慢性无菌炎症改变⁸。单一动作超量运动后膝关节产生滑膜炎主要原因为：膝关节软骨磨损后，掉下的渣滓刺激周围的滑膜发炎，形成滑膜炎。除此之外，半月板的退变、损伤和韧带撕裂也有可能造成的滑膜炎。因此，临床主要运用抗炎及软骨保护药物对运动性膝关节创伤性滑膜炎进行治疗。

2.慢性滑膜炎

慢性滑膜炎多见于老年人，多继发于骨关节炎。关节受伤较轻或长期慢性劳损，加之风、寒、湿邪侵袭，可使膝部逐渐出现肿胀、功能障碍，进而形成慢性滑膜炎。其主要病理改变为滑膜血管扩张、充血，产生大量渗出液、血浆及血细胞外渗，同时滑膜细胞活跃而产生大量粘液素⁹。渗液中含有白细胞、红细胞、胆红素、脂肪粘液素和纤维素等，严重者呈血样。关节积液导致关节肿胀、关节功能受限。处理不及时可发生滑膜粘连、肥厚、软骨萎缩等，进一步影响关节功能。

2.1骨关节炎性滑膜炎

骨关节炎(osteoarthritis,OA)被公认为是一种非细菌性退行性慢性疾病，特征为关节软骨的退变和退化。膝关节骨关节炎可产生受累关节的疼痛、肿胀、僵硬感、变形，甚至关节活动范围受限，因此严重影响患者的生活质量，重者还会丧失劳动和生活能力，给患者本人、家庭和社会带来沉重的负担。研究发现，骨性关节炎的早期到晚期，都伴随有滑膜炎的发生与发展^10,11。膝骨关节炎性滑膜炎是膝关节滑膜受到急性创伤或慢性劳损等刺激时，引起滑膜损伤、破裂，产生膝关节腔内积血或积液的一种非感染性炎症反应¹²。

骨关节炎性滑膜炎的发生机制为：创伤或劳损引起关节软骨降解，软骨碎片掉入关节接触滑膜，诱发滑膜炎症。软骨碎片刺激滑膜细胞分泌炎症介质，这些介质不仅可以激活存在于软骨表层的软骨细胞，导致金属蛋白酶的合成，并最终加速软骨退化，而且通过滑膜细胞自身诱发滑膜血管生成、增加炎性细胞因子和基质金属蛋白酶的合成，合成的炎性因子再次重复这一过程，形成恶性循环^13-15。对骨关节炎的药物治疗主要以抗炎、镇痛及软骨保护为主，外用和(或)口服非甾体抗炎药，以及使用氨基葡萄糖和氨基软骨素保护关节软骨、促进损伤修复，延缓OA的发展并减轻症状。

2.2类风湿性滑膜炎

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性自身免疫疾病，类风湿性滑膜炎是RA的基本病理表现形式。主要特征为滑膜细胞增殖，新生的肉芽组织逐渐向软骨边缘部扩展，形成滑膜血管翳。与其它慢性滑膜炎的病因不同，类风湿性滑膜炎是由免疫异常激活引发，自身免疫损伤造成的关节滑膜炎症持久反复发作，浸润的炎性细胞促进滑膜细胞增生并释放蛋白聚糖酶和胶原酶降解软骨基质中的蛋白聚糖和胶原，造成关节软骨的破坏^16,17。滑膜炎的发生与淋巴细胞浸润引起滑膜细胞增生及血管翳形成有关，随后滑膜分泌大量促炎症细胞因子并释放出多种基质金属蛋白酶¹⁸。现有治疗RA药物的一线药物主要有甲氨蝶呤、糖皮质激素等，运用免疫抑制剂抑制免疫过度激活。以甲氨蝶呤为代表的免疫抑制剂能够有效的改善免疫异常，减轻由免疫过度激活引起的关节炎症，但不具备即刻止痛与抗炎作用，因此常以非甾体抗炎药辅助治疗¹⁹。

研究发现急慢性滑膜炎症产生的炎性递质既可以直接作用于关节软骨，还可以作用于调节关节软骨代谢的一些细胞因子和蛋白酶，一方面直接导致关节软骨结构发生改变，破坏和降解软骨基质；另一方面，使一些细胞因子和蛋白酶发生理化作用，加速关节退变的过程^20,21。滑膜炎将导致不同程度的关节功能受损，运动受限并伴随红肿疼痛等炎症表现，严重影响患者的生活质量，造成社会负担。目前急慢性滑膜炎的治疗以减少渗出、缓解疼痛和恢复功能为目的。但现有的药物治疗效果一般，无法彻底根治，导致患者最终只能采取手术干预。而手术治疗主要清除增生滑膜、嵌入软骨间的脂肪组织与剥离的关节软骨，并修平关节面等，改善关节活动能力，但并不能达到治愈目的。

因此，研发一种疗效好、见效快、毒副作用小的抗滑膜炎药物一直是研究者关注的焦点。青蒿素是经典的抗疟药，从80年代开始，青蒿素及其衍生物逐渐被发现具有抗炎、抗病毒、免疫抑制等活性，且安全性较好^[21]。研究表明，青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素和青蒿琥酯等可通过抑制巨噬细胞释放炎性因子TNF-α、IL-6，以及抑制iNOS和COX-2的表达，发挥抗炎作用^22,23。

由于滑膜炎初期的滑膜血管新生和细胞增殖类似于肿瘤细胞的部分特征，因此预期细胞凋亡诱导剂对抑制滑膜增生有效。研究发现青蒿琥酯可通过阻断NF-κB和PI3K激酶/Akt信号通路，抑制滑膜成纤维样细胞增殖；且能下调与血管形成有关的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达^24,25。青蒿素类化合物不仅能通过诱导细胞凋亡抑制滑膜炎发作，还能以非细胞凋亡方式发挥其抗炎作用²⁶。且青蒿素类化合物在多种疾病中具有细胞保护活性，具有减轻软骨、滑膜损伤进而从机制上缓解滑膜炎的潜质。青蒿素类化合物长期服用不良反应低，有口服、注射多种给药方式，与现有抗滑膜炎药物相比青蒿素类化合物具有更高的安全性，其抗炎及细胞保护作用综合了现有慢性滑膜炎治疗目的。但其抗炎作用与现有非甾体抗炎药相比并不突出，因此，对青蒿素类化合物进行以增效为目的的结构修饰将推动抗滑膜炎药物的研发。

发明内容

针对现有对滑膜炎的治疗不足及青蒿素类活性特点，发明人基于结构拼合原理，将9α-羟基双氢青蒿素与具有抗炎、抗肿瘤等活性的肉桂酸类化合物^27-29拼合，制备了一系列双氢青蒿素肉桂酸衍生物³⁰。

双氢青蒿素衍生物在制备治疗非自身免疫滑膜炎药物中的应用，其特征在于所述的衍生物为如下结构式任意一种

实验证明，制备的系列双氢青蒿素肉桂酸衍生物中的四种衍生物具有优于现有商品化青蒿素类药物的抗炎及软骨保护活性，且通过抑制NF-κB通路的激活，下调TNF-α、IL-1β水平等相关机制，改善骨关节炎性滑膜炎、运动性滑膜炎和急性创伤性滑膜炎症状，从而表明四种衍生物(DC24,32,37,38)具有更好的治疗滑膜炎能力。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了四种衍生物(DC24,32,37,38)抗炎及软骨保护能力与现有青蒿素类药物对比；衍生物显示出优于现有青蒿素类药物的能力。

四种衍生物(DC24,32,37,38)降低LPS诱导滑膜成纤维细胞中促炎因子释放；衍生物能够通过抑制NF-κB通路激活发挥抗炎活性。

四种衍生物(DC24,32,37,38)在抗骨关节滑膜炎症中的应用；在体内，四种衍生物(DC24,32,37,38)12.5mg/kg能够明显改善骨关节炎性滑膜炎症，显著降低OA大鼠血清中TNF-α及IL-1β含量。体外，四种衍生物(DC24,32,37,38)1μM能够抑制OA-FLS中TNF-α及IL-1β转录水平。

四种衍生物(DC24,32,37,38)在运动创伤性滑膜炎中的应用；衍生物能够明显改善模型大鼠关节部位的氧分压降低及滑膜血细胞浸润。

四种衍生物(DC24,32,37,38)在急性创伤性滑膜炎中的应用；衍生物能够明显改善模型大鼠软骨降解和骨结构破坏。

优选的，所述衍生物还含有药学上可接受的辅料。

(优选的，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。)

本发明的有益效果在于：本发明提供了四种双氢青蒿素衍生物的一种新的药理学活性。在体外实验研究中，与现有青蒿素类药物相比，抗炎活性显著增加。并研究了四种衍生物对三种非自身免疫性滑膜炎的药效及抗炎机制，通过抑制NF-κB通路激活衍生物能够治疗以上三种滑膜炎，因此四种衍生物可用于制备抗滑膜炎药物。

附图说明

图1四种衍生物(DC24,32,37,38)及青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素和青蒿琥酯对LPS激活的RAW264.7细胞释放NO的抑制作用(A)及对LPS诱导软骨损伤的抑制作用(B)

图2四种衍生物(DC24,32,37,38)对NF-κB通路激活的抑制作用(##P<0.01,###P<0.001vs.Control,***P<0.001vs.Model)，其中A，D，G，J为DC24,32,37,38的western blot结果；B，E，H，K为对应的p-p65/p65的结果；C、F、I、M为对应的p-IκB-α/IκB-α的结果。

图3四种衍生物(DC24,32,37,38)(12.5mg/kg)对OA大鼠血清中TNF-α(A)及IL-1β水平的下调作用(B)(###P<0.001vs.Control,***P<0.001vs.Model)

图4四种衍生物(DC24,32,37,38)对OA-FLS中TNF-α及IL-1β的转录抑制作用(A-D)(**P<0.01,***P<0.001vs.Control)

图5四种衍生物(DC24,32,37,38)(12.5mg/kg)对运动创伤性滑膜炎大鼠血清中TNF-α(A)及IL-1β(B)水平的下调作用(###P<0.001vs.Control,**P<0.01,***P<0.001vs.Model)

图6四种衍生物(DC24,32,37,38)(12.5mg/kg)对急性创伤性滑膜炎大鼠中的软骨降解，骨结构破坏等症状，其中a为对照组，b为模型组，c为DC24，d为DC32，e为DC37，f为DC38。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。

结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐条件。

实施例1

四种衍生物合成及鉴定参考本实验室报道³⁰。简述如下：

9α，12α-二-(对甲基肉硅酸)双氢青蒿素酯(DC24)的制备

将0.5mmol 9α-羟基双氢青蒿素和1.3mmol对甲基肉桂酸溶于10mL无水二氯甲烷中，氮气保护和冰浴条件下，将1.3mmolDMAP和1.5mmolEDCI加入三颈圆底烧瓶中，温度自然，搅拌反应12h，TLC检测反应完毕后，旋干，乙酸乙酯溶解，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸镁干燥，旋干，残留物经柱层析得到白色粉末，产率：54％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝7.79(d,J＝16.0,1H),7.71(d,J＝16.0,1H),7.57–7.53(m,4H),7.42–7.38(m,6H),6.49(d,J＝16.0,1H),6.44(d,J＝16.0,1H),5.94(d,J＝9.8,1H),5.60y(s,1H),4.64(td,J＝10.9,4.4,1H),2.69(ddd,J＝9.9,7.1,4.7,1H),2.49–2.37(m,1H),2.20–2.06(m,2H),1.93(dt,J＝9.1,4.4,2H),1.64–1.54(m,4H),1.46(d,J＝3.8,3H),1.02(d,J＝6.2,3H),0.91(d,J＝7.1,3H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ＝166.51,165.42,146.25,145.32,134.28,130.53,130.46,128.94,128.23,128.15,117.87,117.46,104.60,91.80,91.22,79.15,75.46,49.08,42.77,41.39,36.09,31.71,27.58,25.92,24.58,15.44,12.04.HRESIMS(m/z)：611.2615[M+Na]⁺(calcd forC₃₅H₄₀NaO₈,611.2615).

9α，12α-二-(邻氯肉桂酸)双氢青蒿素酯(DC32)的制备

将0.5mmol 9α-羟基双氢青蒿素和1.3mmol邻氯肉桂酸溶于10mL无水二氯甲烷中，氮气保护和冰浴条件下，将1.3mmolDMAP和1.5mmolEDCI加入三颈圆底烧瓶中，温度自然，搅拌反应12h，TLC检测反应完毕后，旋干，乙酸乙酯溶解，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸镁干燥，旋干，残留物经柱层析得到白色簇状结晶，产率50％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝8.19(d,J＝16.0,1H),8.14(d,J＝16.0,1H),7.65(ddd,J＝9.7,7.4,2.0,2H),7.45(ddd,J＝7.5,5.7,1.6,2H),7.33(dddd,J＝11.1,9.4,5.0,2.6,4H),6.52(d,J＝16.0,1H),6.46(d,J＝16.0,1H),5.95(d,J＝9.8,1H),5.62(s,1H),4.66(td,J＝10.9,4.5,1H),2.77–2.65(m,1H),2.52–2.38(m,1H),2.25–2.05(m,2H),1.96(dt,J＝14.3,4.5,2H),1.80–1.54(m,4H),1.48(s,3H),1.04(d,J＝6.2,3H),0.94(d,J＝7.1,3H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ＝166.05,164.99,142.04,141.11,135.11,135.06,132.55,131.28,131.22,130.22,127.78,127.70,127.13,120.47,120.10,104.62,91.96,91.21,79.12,75.71,49.06,42.75,41.33,36.08,31.66,27.52,25.93,24.55,15.44,12.08.HRESIMS m/z 651.1517[M+Na]⁺(calcd for C₃₃H₃₄Cl₂NaO₈,651.1523).

9α，12α-二-(3,4-二甲氧基肉硅酸)双氢青蒿素酯(DC37)的制备

将0.5mmol 9α-羟基双氢青蒿素和1.3mmol3,4-二甲氧基肉桂酸溶于10mL无水二氯甲烷中，氮气保护和冰浴条件下，将1.3mmolDMAP和1.5mmolEDCI加入三颈圆底烧瓶中，温度自然，搅拌反应12h，TLC检测反应完毕后，旋干，乙酸乙酯溶解，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸镁干燥，旋干，残留物经柱层析得到白色粉末，产率53％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝7.72(d,J＝15.9,1H),7.64(d,J＝15.9,1H),7.17–7.09(m,2H),7.06(dd,J＝4.9,1.9,2H),6.87(dd,J＝8.4,4.4,2H),6.36(d,J＝15.9,1H),6.30(d,J＝15.9,1H),5.94(d,J＝9.8,1H),5.59(s,1H),4.63(td,J＝10.9,4.5,1H),3.93(s,3H),3.92(s,3H),3.91(s,6H),2.67(ddd,J＝9.8,7.1,4.7,1H),2.48–2.37(m,1H),2.19–2.05(m,2H),1.92(dt,J＝9.0,4.4,2H),1.59(dtt,J＝22.7,15.9,8.0,4H),1.46(s,3H),1.01(d,J＝6.2,3H),0.90(d,J＝7.1,3H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ＝166.74,165.64,151.37,151.30,149.28,149.26,146.16,145.23,127.27,122.85,122.71,115.52,115.11,111.07,109.74,104.59,91.67,91.21,79.15,77.22,75.23,55.99,55.91,55.88,49.06,42.77,41.45,36.09,31.74,27.63,25.92,24.59,15.45,12.06.HRESIMS m/z703.2736[M+Na]⁺(cacld for C₃₇H₄₄NaO₁₂,703.2725).

9α，12α-二-(2,3,4-三甲氧基肉硅酸)双氢青蒿素酯(DC38)的制备

将0.5mmol 9α-羟基双氢青蒿素和1.3mmol2,3,4-三甲氧基肉桂酸溶于10mL无水二氯甲烷中，氮气保护和冰浴条件下，将1.3mmolDMAP和1.5mmolEDCI加入三颈圆底烧瓶中，温度自然，搅拌反应12h，TLC检测反应完毕后，旋干，乙酸乙酯溶解，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸镁干燥，旋干，残留物经柱层析得到白色粉末，产率58％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝7.94(d,J＝16.2,1H),7.88(d,J＝16.2,1H),7.27(t,J＝8.7,2H),6.70(dd,J＝8.8,4.1,2H),6.49(d,J＝16.1,1H),6.42(d,J＝16.1,1H),5.93(d,J＝9.8,1H),5.60(s,1H),4.62(td,J＝10.9,4.3,1H),3.95(s,3H),3.92(s,3H),3.90(s,3H),3.89(s,3H),3.88(s,3H),3.87(s,3H),2.68(ddd,J＝9.8,7.2,4.6,1H),2.53–2.34(m,1H),2.16(dt,J＝12.7,4.2,1H),2.12–2.04(m,1H),1.98–1.89(m,2H),1.56(td,J＝11.2,6.0,4H),1.46(s,3H),1.01(d,J＝6.2,3H),0.90(d,J＝7.1,3H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ＝167.08,166.00,155.75,155.68,153.51,153.40,142.38,141.34,140.29,123.62,123.39,121.36,116.73,116.38,107.60,104.56,91.65,91.23,79.23,75.20,61.47,61.44,60.90,56.08,49.12,42.80,41.40,36.11,31.74,27.61,25.96,24.58,15.44,12.07.HRESIMS m/z763.2956[M+Na]⁺(calcd for C₃₉H₄₈NaO₁₄,763.2936).

实施例2、四种衍生物(DC24,32,37,38)与青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素和青蒿琥酯抗炎活性比较

抗NO释放：取融合度达到80-90％的RAW264.7细胞，吹打混悬后计数，接种于96孔板，每孔10⁴cell。于对数生长期给药，四种衍生物(DC24,32,37,38)及青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素和青蒿琥酯(1μM)预处理细胞1h，之后模型组及各个给药组加入LPS(1μg/mL)，24h后Griess法测定NO含量，使用酶标仪测定540nm处吸收值。NO释放抑制率＝(A_模型-A_给药)/(A_模型-A_对照)×100％。

软骨细胞保护实验：培养软骨细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基调细胞密度为4×10⁴/mL，吸取100μL接种于96孔培养板，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育培养12h。于对数生长期给药，四种衍生物(DC24,32,37,38)及青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素和青蒿琥酯(1μM)预处理细胞1h，之后模型组及各个给药组加入LPS(1μg/mL)，之后向培养体系中添加25mM D-半乳糖胺，共培养24h。MTT法测定各组吸收值(A)，损伤抑制率＝(A_给药-A_模型)/(A_对照-A_模型)×100％。

如图1A所示四种青蒿素衍生物能够有效的抑制LPS激活的RAW264.7细胞释放NO，其抗炎活性优于现有五种商品化青蒿素类化合物。如图1B所示四种青蒿素衍生物能够有效的抑制LPS造成软骨细胞损伤，其软骨保护活性优于现有五种商品化青蒿素类化合物。

实施例3、四种衍生物(DC24,32,37,38)抗滑膜炎机制研究

实验方法：1.大鼠滑膜成纤维细胞原代提取

(1)大鼠脱颈椎处死，用75％酒精浸泡2min。用酒精给膝关节局部进行消毒，在膝关节正中处纵行切开皮肤，将肌肉分离，露出膝盖骨后继续向下分离，可以看到平滑光亮的滑膜组织。再用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，取出滑膜层组织。用上述方法采集另一侧膝关节滑膜层组织。

(2)将分离的滑膜组织用PBS漂洗后放入培养皿中。用眼科剪剪碎滑膜组织成小块，放入Φ3cm培养皿中。加入2mLⅡ型胶原酶。摇床上37℃ 80rpm，消化3h。

(3)消化后，取出培养皿，吹打混匀细胞悬液，转入离心管中，1000rpm离心5min。

(4)弃部分含有脂肪细胞上清液约1-2mL，再加入2mL 20％FBS-DMEM培养基混匀后，1200rpm离心10min。

(5)弃上清，加4mL 20％FBS-DMEM培养基，吹打混匀细胞沉淀。转入干净的培养瓶中，置于培养箱中培养。

(6)次日去掉未贴壁的细胞。2-3天更换1次培养液，在倒置显微镜下观察细胞生长状况。

2.取融合度达到80-90％的FLS细胞，吹打混悬后计数，接种于6孔板，每孔5×10⁵cell。于对数生长期给药，模型组及各个给药组加入LPS(1μg/mL)，四种衍生物(DC24,32,37,38)给药浓度0.1,0.3,1μM，24h后提取细胞蛋白，westernblot测定NF-κB通路关键蛋白p65、IκB含量。

如图2所示，四种衍生物(DC24,32,37,38)在0.1,0.3,1μM下均能显著抑制p65及IκB-α磷酸化，进而抑制NF-κB通路激活，下调滑膜炎症。

实施例4、四种衍生物(DC24,32,37,28)抗骨关节炎滑膜炎症药效研究

1.骨关节炎(OA)滑膜炎症模型建立

4％木瓜蛋白酶溶液配制：称取KH₂PO₄0.024g，Na₂HPO₄0.358g，NaOH 0.01g，NaCl0.4g，溶于8mL超纯水，加入NaOH溶液调节pH至8.0。再加入EDTA·2Na7.44mg，充分震荡溶解后，加入木瓜蛋白酶粉剂0.4g，加入盐酸溶液调节pH至6.5，再用超纯水定容至l0mL，于4℃保存。

麻醉SD大鼠，向大鼠双膝关节腔内注射0.2mL 4％的木瓜蛋白酶溶液，空白对照组大鼠双膝关节腔内注射等量生理盐水。每3天注射一次，连续三次，造模2周后灌胃给予药用玉米油混悬的青蒿素衍生物DC24、32、37及DC38(12.5mg/kg)，对照及模型组给予等体积玉米油，每天1次，连续给药2周。末次给药后1h处死大鼠，取血，室温静置后3000rpm，离心15min，取血清以ELISA测定TNF-α及IL-1β水平。

2.OA大鼠滑膜成纤维细胞原代提取方法同实施例3

取融合度达到80-90％的FLS细胞，吹打混悬后计数，接种于6孔板，每孔5×10⁵cell。于对数生长期给药，四种衍生物(DC24,32,37,38)终浓度1μM。24h后提取mRNA测定衍生物对TNF-α及IL-1β转录水平影响。

如图3所示，四种衍生物(DC24,32,37,38)12.5mg/kg能够显著降低OA大鼠血清中TNF-α及IL-1β含量。

如图4所示，四种衍生物(DC24,32,37,38)1μM能够抑制OA-FLS中TNF-α及IL-1β转录水平。

实施例5、四种衍生物(DC24,32,37,38)抗运动创伤性滑膜炎药效研究

将大鼠放置在跑台上主动运动，每日两小时，上下午各1个小时，每15分钟休息5分钟，连续运动3天，形成滑膜炎模型。于第4天灌胃给予药用玉米油混悬的青蒿素衍生物DC24、32、37及DC38(12.5mg/kg)，连续给药2周。使用组织液压测量仪和组织氧分压测量仪测定大鼠双膝关节腔内压及氧分压。取血处死取膝关节滑膜进行组织学染色，ELISA测定血清中TNF-α及IL-1β水平。

表1大鼠关节腔内压及氧分压测定结果(kPa，x±s)

表2大鼠膝关节滑膜组织染色检查结果(个)

如表1、2所示，衍生物能够明显改善模型大鼠关节部位的氧分压降低及滑膜血细胞浸润。

如图5所示，四种衍生物(DC24,32,37,38)12.5mg/kg能够显著降低运动创伤性滑膜炎大鼠血清中TNF-α及IL-1β含量。

实施例6、四种衍生物(DC24,32,37,38)抗急性创伤性滑膜炎药效研究

Hulth法为经典手术造模方式，通过切除前后交叉韧带、内侧副韧带及内侧半月板造成关节失稳，使关节面间磨损增加，促使关节软骨退变。实验造模方法本身所造成的创伤性滑膜炎及关节积血等均可能对研究骨性关节炎的病理进程、组织病理特征或软骨生化代谢的变化等造成一定的影响。此模型与人类创伤后(半月板损伤、交叉韧带损伤等)骨关节滑膜炎相似。

按3mL/kg腹腔注射水合氯醛，麻醉SD大鼠，选取右膝关节，用刀沿髌韧带内侧缘切开皮肤，切口大约0.5cm。切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，用尖刀将内侧副韧带切断，并切除内侧半月板。用5-0可吸收线单独缝合关节囊，以5-0丝线间断缝合皮肤。对照组以同样的方法打开关节囊，但不将内侧副韧带切断及内侧半月板的切除，髌骨复位及生理盐水清洗伤口后关闭关节囊，缝合手术切口。术后肌注1次青霉素(4×10⁷U/L)1mL抗感染。1周后灌胃给予药用玉米油混悬的青蒿素衍生物DC24、32、37及DC38(12.5mg/kg)，对照及模型组给予等体积玉米油，每天1次，连续给药2周。末次给药后1h处死大鼠，取左侧膝关节，去除骨头和皮肤后称重、匀浆。取上清以ELISA法测定组织NO、TNF-α含量。右膝关节以多聚甲醛固定后经脱钙、包埋、封片和染色等步骤，制作组织切片按Mankin进行评分。同时取膝关节滑膜进行组织学染色。

表3 Mankin关节软骨组织学分级(总计0-14)

表4对创伤性膝骨关节炎大鼠膝骨关节炎NO、TNF-α含量及Mankin评分的影响(x±s)

图6结果显示，四种青蒿素衍生物DC24、32、37及DC38(12.5mg/kg)能够有效改善急性创伤性关节炎的软骨降解，骨结构破坏等症状，降低炎症反应，减少关节腔NO、TNF-α含量，具有治疗急性创伤性关节炎潜质。

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Claims

1.双氢青蒿素衍生物在制备治疗非自身免疫滑膜炎药物中的应用，其特征在于所述的衍生物为如下结构式任意一种