CN101816666B - 连翘酯苷用作抗真菌药物增效剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,是连翘酯苷用作抗真菌药物增效剂的新用途。体内外实验表明,连翘酯苷与氟康唑、伊曲康唑、咪康唑或酮康唑等抗真菌药合用,能不同程度地提高对浅表部和深部真菌感染的治疗效果,并能使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用,因此连翘酯苷可用作抗真菌药物增效剂。本发明为连翘酯苷开辟了新的用途,将其用于抗真菌药物的增效剂,不仅能提高药物的抗真菌作用,而且在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下,使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用,还可降低抗真菌药物的用药剂量,从而为患者节省了医疗费用,减少药物的毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,是连翘酯苷用作抗真菌药物增效剂的新用途。
背景技术
连翘酯苷为中药连翘的主要有效成分之一。研究显示,连翘酯苷具有抗微生物、抗病毒、抗氧化、抑制弹性蛋白酶和诱生α干扰素等药理作用,但未见其有抗真菌作用的报道,更未见其作为抗真菌药物增效剂与抗真菌药物联合使用治疗真菌病的报道。
发明内容
本发明提供一种连翘酯苷作为抗真菌药物增效剂的新用途。经体外细胞实验和动物实验表明,连翘酯苷对氟康唑、伊曲康唑、咪康唑、酮康唑等抗真菌药物有明显的增效作用;对于临床耐药性真菌菌株,当抗真菌药物和连翘酯苷合用时,能明显降低抗真菌药物的用药剂量,并增强对耐药真菌的抑制作用,使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此可将连翘酯苷用作抗真菌药物的增效剂,用于不同深部或浅部真菌感染的治疗。
本发明为连翘酯苷开辟了新的用途,将其用于抗真菌药物的增效剂,不仅能提高药物的抗真菌作用,而且在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下,使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用,还可降低抗真菌药物的用药剂量,从而为患者节省了医疗费用,减少药物的毒副作用。
附图说明
图1为不同浓度的连翘酯苷与氟康唑合用时,治疗深部耐药白念珠菌感染小鼠的肾脏活菌数SDA平板图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图,对本发明作详细描述。
实施例1.连翘酯苷和氟康唑联用对不同临床真菌株的作用
材料和方法
1.试药:
连翘酯苷:上海融禾制药科技有限公司,批号090923。
氟康唑注射液:辉瑞制药有限公司,批号9167802。
二甲亚砜:上海世仪生物科技有限公司。
连翘酯苷用二甲亚砜配成溶液浓度为6.4mg/ml。
各试药置于-20℃保存。实验前,将药物取出置于35℃温箱融化,充分混匀,分别进行药效学检验。
2.菌株:
临床株:1)耐药白念珠菌,分103、904、18、38和0710448五株;2)热带念珠菌,分409、936、422、0710453和0710087五株;3)新生隐球菌,分34880和32609两珠。均由上海长海医院真菌室提供,分别采自长海医院不同科室临床样本,并经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化,白念珠菌、热带念珠菌和新生隐球菌等球状菌于30℃培养2周后,分别挑取单克隆再次划板活化,取第二次所得单克隆置SDA斜面,用上述方法培养后于4℃保存备用。
3.培养液:
1)RPMI 1640液体培养液:
RPMI1640(Gibco BRL)10g,NaHCO32.0g,吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g(0.165M),加三蒸水900ml溶解,1N NaOH调pH至7.0(25℃),三蒸水定容至1000ml,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,分装后于4℃保存备用。
2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA):
蛋白胨10g,葡萄糖40g,琼脂18g,加三蒸水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,调整pH至7.0,以三蒸水定容至1000ml,高压灭菌(121℃,15min)后于4℃保存备用。
3)YEPD培养液:
酵母浸膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加三蒸水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,三蒸水定容至1000ml,高压灭菌(121℃,15min)后于4℃保存备用。
4.仪器设备:
Multiskan MK3型酶标检测仪(芬兰Labsystems产品)
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)
SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)
5.菌液制备:
实验前,用接种圈从4℃保存的SDA培养基上分别挑取白念珠菌、热带念珠菌和新生隐球菌各球状菌少量,分别接种至1ml YEPD培养液,于30℃,200rpm振荡培养,活化16h,使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mlYEPD培养液中,用上述方法再次活化,培养16h,用血细胞计数板计数,以RPMI 1640培养液分别调整各菌液浓度至1×103~5×103CFU/ml。
6.药敏板制备:
各菌株分别取无菌96孔板一块,于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μl作空白对照;3~12号孔各加上述新鲜配制的菌液99μl;2号孔分别加菌液196μl和氟康唑2μl;12号孔不含药物,只加菌液100μl作阳性生长对照。调配不同浓度的连翘酯苷为:1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml。在每排的2号孔加相应浓度的连翘酯苷2μl,3~11号孔各加1μl。
对2~11号孔进行10级倍比稀释,使各孔的最终氟康唑药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml,各孔中DMSO含量均低于1%。将各药敏板于30℃恒温箱培养。
7.MIC80值判定:
在30℃恒温箱中,念珠菌培养48h、新生隐球菌培养72h,用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照孔比,以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC80(真菌生长80%被抑制时的药物浓度)。当药物的MIC80值超过测定浓度范围时,按以下方法进行统计:MIC80值高于最高浓度64μg/ml时,计为“>64μg/ml”;MIC80值为最低浓度或在最低浓度以下时,不作区别,均计为“≤0.125μg/ml”。
上述实验均平行操作2到3次,当MIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受,并以较高浓度作为MIC80值;当MIC80值相差两个浓度以上时,则需重新实验,直到符合要求为止。
实验结果见表1、表2和表3
表1连翘酯苷与氟康唑合用对5株临床耐药白念珠菌的MIC80值
注:FLC表示氟康唑(下同)。
表2连翘酯苷与氟康唑合用对5株热带念珠菌的MIC80值
表3连翘酯苷与氟康唑合用对2株新生隐球菌的MIC80值
由表1、2、3可见,16μg/ml的连翘酯苷与氟康唑合用,即可使临床耐药白念珠菌对氟康唑的MIC80值从>64μg/ml下降到0.125~0.25μg/ml,使临床热带念珠菌和新生隐球菌对氟康唑的MIC80值32~64μg/ml下降到0.125~0.5μg/ml,说明连翘酯苷能明显增强氟康唑的抗真菌作用。
实施例2:连翘酯苷与其他唑类抗真菌药物的联合用药
材料和方法
1.药物:
伊曲康唑、酮康唑和咪康唑均由第二军医大学药学院提供。
伊曲康唑、酮康唑和咪康唑用二甲亚砜配成6.4mg/ml,连翘酯苷用二甲亚砜配成6.4mg/ml,各试药置于-20℃保存。实验前,将药物取出置于35℃温箱融化,充分混匀,分别进行药效学检验。
其他实验步骤和方法同实施例1,实验结果见表4、5、6。
表4连翘酯苷与伊曲康唑(ITR)合用对4株临床耐药白念珠菌的MIC80值
表5连翘酯苷与咪康唑(MCZ)合用对4株临床耐药白念珠菌的MIC80值
表6连翘酯苷与酮康唑(KCZ)合用对3株临床耐药白念珠菌的MIC80值
由表4、5、6可见,连翘酯苷不仅可与氟康唑合用产生协同作用,而且与伊曲康唑、咪康唑、酮康唑等抗真菌药物同样具有抗菌增效作用。合用16μg/ml的连翘酯苷即可使伊曲康唑、咪康唑、酮康唑对耐药的白念珠菌的MIC80值从8~64μg/ml下降到0.0313~0.5μg/ml,且随连翘酯苷剂量增加效应增强,具有剂量依赖性。
实施例3:连翘酯苷与氟康唑合用对小鼠系统性真菌感染的保护作用
实验方法:
实验用的小鼠种系为清洁级ICR雌性小白鼠(18-20g),合格证编号:2007000501825,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。
耐药白念珠菌(103临床耐药菌株),经小鼠体内毒力恢复后,重新再SDA培养基上活化,YEPD液体培养基中生长至对数生长期。用生理盐水调整菌液浓度为3.0×106个/ml,按体重给予小鼠尾静脉注射0.1ml/10g,造成小鼠深部真菌感染模型。正常对照组小鼠尾静脉注射0.1ml/10g生理盐水。
33只小鼠随机分为7组,除正常对照组为3只外,其余每组5只,分别为真菌感染模型对照组(生理盐水)、氟康唑(0.5mg/kg)单用治疗组、连翘酯苷(9mg/kg)单用治疗组、连翘酯苷(1mg/kg)合用氟康唑(0.5mg/kg)治疗组、连翘酯苷(3mg/kg)合用氟康唑(0.5mg/kg)治疗组以及连翘酯苷(9mg/kg)合用氟康唑(0.5mg/kg)治疗组。在小鼠系统性真菌感染模型建立2h后,各给药组分别按体重腹腔注射给药0.2ml/10g,每天一次,连续给药4天,正常对照组则腹腔注射生理盐水0.2ml/10g。
最后一次给药后24小时处死33只,取双肾脏,称重后剪开,以5ml 0.9%生理盐水匀浆,再分别以0.9%生理盐水将匀浆液稀释1000倍。各取1000μl涂铺于SDA平皿上,于30℃真菌培养箱中培养48小时后计数菌落数目,计算肾脏活菌落数目(CFU/g)。
计算公式:CFU/g=菌落数×稀释倍数×50/肾重量(g)。
实验结果分别见表7、8和图1:
表7连翘酯苷与氟康唑合用对白念珠菌深部感染小鼠肾脏重量(g)的影响
注:FLC表示氟康唑;与正常组比较,#P<0.05;与FLC组比较,*P<0.05,**P<0.01(下同)。
表8连翘酯苷与氟康唑合用对白念珠菌深部感染小鼠肾脏菌落数(105CFU/g)的影响
由表7可见,白念珠菌深部感染的模型对照组小鼠肾脏重量明显高于正常对照组,有显著性差异,本模型是成功的;连翘酯苷与氟康唑分别单用时,小鼠肾脏重量与模型对照组无差异,说明单用连翘酯苷或氟康唑对白念珠菌深部感染没有治疗作用;连翘酯苷与氟康唑合用时,各组肾脏重量明显下降,特别是当连翘酯苷用量为9mg/kg时,该组肾脏重量与正常对照组无差异,充分显示了连翘酯苷对抗真菌药的增效作用。
由表8和图1可见,连翘酯苷与氟康唑分别单用时,连翘酯苷组白念珠菌深部感染小鼠肾脏菌落数与模型对照组相比无差异,氟康唑组虽然较模型对照组菌落数明显减少,但肾脏活菌数明显多于连翘酯苷与氟康唑合用组,连翘酯苷与氟康唑合用组与模型对照组差异特别显著,进一步显示了连翘酯苷对抗真菌药的增效作用。
上述实验结果表明连翘酯苷具有联合抗真菌药物治疗真菌感染的作用,因此可用作抗真菌药物的增效剂。
Claims (2)
1.连翘酯苷用作抗真菌药物增效剂在制备唑类抗真菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的连翘酯苷在制备唑类抗真菌药物中的应用,其特征在于所说的唑类抗真菌药物为氟康唑、伊曲康唑、酮康唑或咪康唑。
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