CN109394774A - 连翘酯苷b在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了连翘酯苷B在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒产品中的应用。采用钙荧光方法和手动膜片钳技术证实连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的抑制作用，连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的半数抑制浓度IC₅₀为3.7±0.7μM。连翘酯苷B是瞬时感受器电位香草素受体3通道的特异性抑制剂。采用小鼠皮肤瘙痒模型评价连翘酯苷B的抗瘙痒活性，连翘酯苷B对组胺引起的小鼠急性瘙痒有止痒作用。连翘酯苷B是瞬时感受器电位香草素受体3通道抑制剂，可用于制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒的产品。

Description

连翘酯苷B在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗 瘙痒产品中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及连翘酯苷B在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒产品中的应用。

背景技术

皮肤瘙痒是一种迫切需求搔抓来缓解的极为不舒服的皮肤感觉。作为一种常见的皮肤科疾病，瘙痒是特应性皮炎、荨麻疹、接触性皮炎、结节性痒疹、真菌病和银屑病等皮肤性疾病最常见的临床表现，同时也是很多系统性疾病如肾脏疾病、胆道疾病、甲状腺疾病、恶性肿瘤以及艾滋病等的伴随症状。反复的搔抓会引发致痒因子的释放和加重皮肤损伤，进而引起更加剧烈的瘙痒，严重的影响病人的生活质量。

目前，与瘙痒有关的神经通路和分子机制开始逐渐被人们发现，包括组胺依赖的瘙痒通路、组胺非依赖的瘙痒通路及这些通路所涉及的受体、递质、神经等。瞬时感受器电位（Transient receptor potential，TRP）是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类离子通道蛋白，由TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA、TRPN等七个亚家族组成，哺乳动物的瞬时感受器电位香草素受体亚家族（Transient receptor potential vanilloid，TRPV）又由TRPV1-6构成。瞬时感受器电位香草素受体3通道是一种温度敏感、钙离子通透的非选择性阳离子通道。瞬时感受器电位香草素受体3主要在人体皮肤角质细胞表达，最近研究证明，瞬时感受器电位香草素受体3与瘙痒的产生和发展相关，功能增强性瞬时感受器电位香草素受体3突变无论在大、小鼠还是在人类体内都会引起严重的搔抓行为，敲除瞬时感受器电位香草素受体3小鼠的搔抓反应明显减少，人类功能性增强的瞬时感受器电位香草素受体3突变会导致一种罕见的遗传性皮肤病Olmsted综合征，表现为手足进行性损毁、脱发和严重的瘙痒。研究提示，瞬时感受器电位香草素受体3是治疗瘙痒的靶点，抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道的化合物可用于治疗皮肤瘙痒。

为筛选瞬时感受器电位香草素受体3通道抑制剂，本案发明人构建了采用钙荧光方法，FlexStation 3多功能酶标仪测定激动剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB）引起的钙内流的瞬时感受器电位香草素受体3通道抑制活性评价体系，从毒副作用小的天然产物中寻找瞬时感受器电位香草素受体3通道抑制剂，发现了高活性化合物连翘酯苷B。

连翘酯苷B，属于咖啡酰基苯乙醇苷类化合物，英文名称forsythoside B，主要存在于连翘（Forsythia suspensa ( Thunb) Vahl.）、独一味（Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo）、裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）、广东紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun.）、大叶紫珠（Callicarpa macrophylla vahl.）、长叶紫珠（Callicarpa longissima Lamk.）、枇杷叶紫珠（Callicarpa kochiana Makino）、藤紫珠（Callicarpa peii H. T. Chang）、斑唇马先蒿（Pedicularis longiflora Rudolph.var. tubiformis (Klotz) Tsoong）、糙苏（Phlomis umbrosa Turcz.）、块根糙苏（Phlomis tuberosa L.）、毛地黄鼠尾草（Salvia digitaloides Diels）、裂叶沙穗（Eremostachys laciniata (L.) Bunge）、小叶丁香（Syringa pubescens Turcz.）、日本丁香（Syringa reticulata (Blume) H. Hara）、四齿四棱草（Schnabelia tetrodonta (Y. Z. Sun) C.Y. Wu & C.）等植物中。具有抗氧化作用（Cai H，Xie ZY，Liu GH，Sun XM，Peng GT，Lin BQ，Liao QF. B PLoS One，2014，9，e93000）、抑菌作用（钟海琴，张顺，蔡挺. 中国新药与临床杂志，2013，32，303-306）、抗炎作用（Dimitrova P，Kostadinova E，Milanova V，AlipievaK，Georgiev M，Ivanovska N. Phytother Res，2012，26，1681-1687）、抗脓毒作用（JiangWL，Xu Y，Zhang SP，Zhu HB，Hou J. Phytother Res，2012，26，981-987）、抑制胆碱酯酶作用（Georgiev M，Alipieva K，Orhan I，Abrashev R，Denev P，Angelova M. Food Chem，2011，128，100-105.）、抑制谷胱甘肽还原酶作用（Tandogan B，Guvenc A，Calis I，UlusuNNSYN. Int J Chem Kinet，2013，45，574-579）、抑制脂蛋白诱导的内皮素-1分泌作用（Martin-Nizard F，Sahpaz S，Kandoussi A，Carpentier M，Fruchart JC，Duriez P，Bailleul F. J PharmaPharmacol，2004，56，1607-1611）、抑制低密度脂蛋白过氧化作用（Seidel V，Verholle M，Malard Y，Tillequin F，Fruchart JC，Duriez P，Bailleul F，Teissier E. Phytother Res，2000，14，93-98）、抑制流感病毒H5N1作用（中国专利CN103127044 A）、紧缩毛孔作用（法国专利FR 3049194 A1）、治疗急慢性肝损伤和肝纤维化作用（中国专利CN 101496809 A）、治疗心血管疾病作用（中国专利CN 101919868 A）、心脏保护作用（Jiang WL，Fu FH，Xu BM，Tian JW，Zhu HB，Hou J. Phytomedicine，2010，17，635-639），神经保护作用（Jiang WL，Tian JW，Fu FH，Zhu HB，Hou J. Eur J Pharmacol，2010，640，75-81）和神经镇静作用（Daels-Rakotoarison DA，Seidel V，Gressier B，Brunet C，Tillequin F，Bailleul F，Luyckx M，Dine T，Cazin M，Cazin JC. Arzneimittel-Forschung，2000，50，16-23）。

但未见连翘酯苷B抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道和抗瘙痒作用的研究报道。

发明内容

本案发明人以组分结构理论为指导，从宏观到微观解析，微观到宏观表征广东紫珠止痒作用有效部位组分结构，以瞬时感受器电位香草素受体3通道为靶点寻找活性化合物。采用瞬时感受器电位香草素受体3通道抑制活性指标指导下的导向分离模式研究广东紫珠提取物止痒活性成分，从有效部位中分离鉴定了连翘酯苷B、金石蚕苷、松果菊苷、管花苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷。发现连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道有显著的抑制作用，因而完成了本发明。

本发明目的是提供连翘酯苷B在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒产品中的应用。

连翘酯苷B是如下结构式的化合物：

。

连翘酯苷B抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道，可在制备瞬时感受器电位香草素受体3通道抑制剂中应用，通过抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道止痒，可在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒产品中应用。

本发明采用钙荧光方法评价连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的抑制作用，连翘酯苷B能剂量依赖地抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道激动剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB）引起的钙内流，与非选择性抑制剂釕红相比，连翘酯苷B200 μM的抑制率显著高于釕红50 μM，连翘酯苷B100 μM和50 μM的抑制率低于釕红50μM。采用离子通道研究金标准手动膜片钳技术测定连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的抑制作用和量效关系，连翘酯苷B50 μM抑制2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB，50 μM）诱发的瞬时感受器电位香草素受体3通道电流，抑制率为81.5±7.0%，连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的半数抑制浓度IC₅₀为3.7±0.7 μM。采用手动膜片钳技术测定连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体1通道、瞬时感受器电位香草素受体4通道、瞬时感受器电位锚蛋白受体1通道的抑制作用，抑制作用显著弱于对瞬时感受器电位香草素受体3通道的抑制作用，连翘酯苷B是瞬时感受器电位香草素受体3通道的特异性抑制剂。采用小鼠皮肤瘙痒模型评价连翘酯苷B的抗瘙痒活性，连翘酯苷B对组胺引起的小鼠急性瘙痒有止痒作用。

本发明的连翘酯苷B在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒产品的应用优点为作用机制明确，连翘酯苷B可从连翘、独一味、裸花紫珠、广东紫珠、大叶紫珠、长叶紫珠、枇杷叶紫珠、藤紫珠等植物中分离，毒副作用小。

本发明还提供用本发明所述的连翘酯苷B以及药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。

本发明的含有所述连翘酯苷B的药物制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙等。

使用剂量根据病人的年龄、体重、病情严重程度和其他类似的因素而改变，连翘酯苷B的用量为50~200 mg/次，一日二次。

以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

具体实施方式

实施例1

钙荧光方法评价连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的抑制作用

HEK293细胞使用含10 % 胎牛血清的DMEM完全培养基进行培养及传代，待10 cm直径培养皿HEK293细胞长至90-100 %密度，用0.25%胰酶消化细胞，将细胞制备成2 ml细胞悬液，每孔80 μl细胞悬液滴于12孔板，补充1 ml 完全培养基，混匀后置孵箱37 °C，5% CO₂培养24小时后，12孔板内细胞长至80-90 %密度，使用脂质体转染试剂脂质体2000转染人瞬时感受器电位香草素受体3质粒。转染时，用50 μl还原血清培养基分别稀释1.6 μl的脂质体2000和0.8 μg的人瞬时感受器电位香草素受体3质粒，室温放置5分钟后将上述两种物质混合，室温放置20 分钟后将其滴入1孔细胞。4 小时后，弃去培养基，每孔加入80 μl 0.25%胰酶，立即加入800 μl 完全培养基，吹打均匀，接种于黑壁透明底96孔板，每孔100 μl，12孔板一孔传96孔板一列，置孵箱37 °C，5% CO₂培养。细胞培养过夜，细胞长至80-90 %密度，采用钙离子指示剂Cal-520TM PBX钙测定试剂盒进行检测。使用前，成分 A 加入200 μlDMSO，混合均匀，储存于-20 °C。96孔板每孔60 μl 钙染料，配制6 ml 染料：取5.4 mlHank's平衡盐溶液于药槽，加入0.6 ml 成分B（深紫色）和12 μl 成分 A（无色），混合均匀。每孔细胞弃去40 μl培养基，加入60 μl 钙染料，置孵箱37 °C，5% CO₂培养1.5小时。使用透明96孔板配制待测化合物，连翘酯苷B测试终浓度为50 μM，100 μM，200 μM，每孔体积200 μl。测试开始，将细胞板置于FlexStation 3多功能酶标仪底层，化合物板置于中层，专用枪头置于顶层。使用快速动力学荧光分析模块，激发波长485 nm，发射波长525 nm，每隔1.6秒读数一次，17 秒时加入待测物30 μl，100 秒时加入瞬时感受器电位香草素受体3通道激动剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB，200 μM）30 μl，采集数据至180 秒，统计100 -180 秒的相对荧光单位。结果表明，连翘酯苷B能剂量依赖地抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道激动剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯引起的钙内流，与非选择性抑制剂釕红相比，连翘酯苷B200 μM的抑制率显著高于釕红50 μM，连翘酯苷B100 μM和50 μM的抑制率低于釕红50μM。

实施例2

手动膜片钳技术测定连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的抑制作用和量效关系

瞬时表达人瞬时感受器电位香草素受体3通道的HEK293细胞培养24 h后，使用德国HEKA公司的EPC10 USB放大器及Patchmaster软件完成膜片钳全细胞记录。玻璃电极用P-97电极拉制仪完成，抛光后入水阻值4-5 MΩ。外液及化合物溶液使用重力灌流装置。膜电位保持在0 mV, 斜坡电压由-100到+100 mV 持续400 毫秒，取-80和+80 mV的平均值代表化合物对离子通道的时效图。结果表明，连翘酯苷B50 μM抑制2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB，50 μM）诱发的瞬时感受器电位香草素受体3通道电流，抑制率为81.5±7.0%，连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体3通道的半数抑制浓度IC₅₀为3.7±0.7 μM。

实施例3

连翘酯苷B对瞬时感受器电位香草素受体1通道、瞬时感受器电位香草素受体4通道、瞬时感受器电位锚蛋白受体1通道的抑制作用

采用手动膜片钳技术对瞬时转染人瞬时感受器电位香草素受体1通道、人瞬时感受器电位香草素受体4通道、人瞬时感受器电位锚蛋白受体1通道的HEK293细胞进行检测，结果表明连翘酯苷B50 μM对辣椒素1 μM诱发的瞬时感受器电位香草素受体1通道电流的抑制率为12.1 ± 3.7 %，连翘酯苷B50 μM对GSK101诱发的瞬时感受器电位香草素受体4通道电流的抑制率为14.8 ± 4.9 %，连翘酯苷B50 μM对异硫氰酸丙酯300 μM诱发的瞬时感受器电位锚蛋白受体1通道电流的抑制率为10.8 ± 4.5 %，都显著弱于对瞬时感受器电位香草素受体3通道通道的抑制作用，连翘酯苷B是瞬时感受器电位香草素受体3通道的特异性抑制剂。

实施例4

小鼠皮肤瘙痒模型评价连翘酯苷B的抗瘙痒活性

采用8-10周雄性C57BL/6小鼠，实验前一天剃去右侧颈背毛发，约1厘米×1厘米。随机分为空白对照组、模型组、给药组（0.3 μM，3 μM，30 μM），每组6-8只。实验开始前，小鼠放入有机玻璃观察盒（9厘米×9厘米×13厘米）适应性活动30分钟，随后使用30 G胰岛素注射针给空白对照组和模型组小鼠颈背部脱毛处皮下注射媒介溶剂50 μl，给药组注射不同浓度的连翘酯苷B溶液50 μl；30分钟后给空白对照组注射生理盐水50 μl，其余各组注射组胺溶液（100 μM）50 μl，摄像机录像30分钟。实验结束后，回放录像进行后肢搔抓行为统计，小鼠一次搔抓为从后肢抬起搔抓注射部位到放下或啃咬为一次（其中包括一簇快速、小幅的搔抓行为），统计观察时段小鼠注射同侧后肢搔抓注射部位的次数。结果表明，模型组注射组胺后小鼠搔抓次数为49.1 ± 6.2次，比空白对照组（3.4 ± 1.8次）显著增多。连翘酯苷B0.3 μM剂量组小鼠搔抓次数为22.5 ± 7.7次，连翘酯苷B3 μM剂量组小鼠搔抓次数为15.5 ± 4.9次，连翘酯苷B30 μM剂量组小鼠搔抓次数为5.8 ± 1.6次。

实施例5

连翘酯苷B的制备

取广东紫珠药材200g，加70%乙醇回流提取二次，每次2小时，每次加70%乙醇1200 ml，滤过，合并滤液，减压回收乙醇的广东紫珠提取物24.1 g。提取物加水200 ml使溶解，加于已处理好的D101型大孔吸附树脂柱上，填充大孔吸附树脂体积为500 ml，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用20%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用50%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物3.8 g。洗脱物加丙酮溶解，加于葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱上，填充大孔吸附树脂体积为500 ml，用丙酮洗脱，薄层色谱跟踪检测，得到主要含连翘酯苷B的洗脱液，收集洗脱液，减压浓缩至适量体积，经制备液相色谱分离，色谱柱：十八烷基键合硅胶，流动相为20%体积甲醇、79.8%体积水和0.2%体积冰乙酸，同步采用紫外检测器（334 nm）监视流出曲线以指导收集，收集液经减压浓缩，干燥后得连翘酯苷B。

实施例6

连翘酯苷B的结构鉴定

¹H-NMR（CD₃OD，500 MHz）：7.60（1H，d，J = 16.0 Hz，H-β'），7.07（1H，d，J = 1.6 Hz，H-2'），6.97（1H，dd，J = 8.0，2.0 Hz，H-6'），6.79（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5'），，6.71（1H，d，J =2.0 Hz，H-2），6.69（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），6.58（1H，dd，J = 8.0，2.0 Hz，H-6），6.27（1H，d，J = 16.0 Hz，H-α'），5.17（1H，d，J =1.6 Hz，rha-H-1），4.91（1H，d，J = 2.0 Hz，api-H-1），4.36（1H，d，J = 8.0 Hz，glu-H-1），4.01（1H，m，H-αa），3.71（1H，m，H-αb），2.80（2H，dt，J= 8.0，2.0 Hz，H-β）；¹³C-NMR（CD₃OD，125 MHz）：168.2（C-γ'），149.8（C-4'），148.0（C-β'），146.8（C-3'），146.1（C-3），144.7（C-4），131.5（C-1），127.7（C-1'），123.2（C-6'），121.3（C-6），117.1（C-α'），116.5（C-5'），116.4（C-5），115.3（C-2），114.8（C-2'），111.1（api-C-1），104.3（glu-C-1），103.0（rha-C-1），81.6（glu-C-3），80.6（api-C-3），78.1（api-C-2），76.2（glu-C-2），75.1（api-C-4），74.7（glu-C-5），73.8（rha-C-4），72.4（C-α，rha-C-2），72.1（rha-C-3），70.9（rha-C-5），70.4（glu-C-4），68.5（glu-C-6），65.7（api-C-5），36.6（C-β），18.4（rha-C-6）；ESI-MS m/z：757 [M+H]⁺。

实施例7

连翘酯苷B用药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙。上述制备工艺均为本领域常规操作，在此不加赘述。

实施例8

连翘酯苷B为原料制得的药物制剂不仅包括单独使用连翘酯苷B的药物制剂，还包括添加连翘酯苷B作为活性成分的药物制剂。

Claims (1)

1.连翘酯苷B在制备抑制瞬时感受器电位香草素受体3通道治疗瘙痒产品中的应用，其特征在于，所述连翘酯苷B是如下结构式的化合物：

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