CN102040635A

CN102040635A - 一种连翘酯苷b和金石蚕苷单体的高效分离纯化方法

Info

Publication number: CN102040635A
Application number: CN 201010555338
Authority: CN
Inventors: 常建红; 郭建华; 刘丁
Original assignee: Pusi Biological Science & Technology Co Ltd Chengdu
Current assignee: Pusi Biological Science & Technology Co Ltd Chengdu
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2030-11-23
Also published as: CN102040635B

Abstract

本发明公开了一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离纯化方法，它是以广东紫珠药材为原料，先用极性溶剂对粉碎的药材进行提取，然后通过AB-8大孔树脂进行富集，除去糖类等大极性杂质，然后通过硅胶柱层析进行脱色粗分，再将粗分的半成品用制备型高效液相色谱柱进行分离纯化，示差折光检测器进行在线检测，针对性收集连翘酯苷B和金石蚕苷单体溶液，分别处理干燥，可获得纯度大于98%的连翘酯苷B和金石蚕苷单体。本发明可实现连翘酯苷B和金石蚕苷的同步分离，制备量大、收率高、产品质量好，适合工业化生产。

Description

一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种植物中单体活性成分的分离纯化方法，属医药技术领域，具体来说，本发明涉及一种从广东紫珠药材中分离高纯度连翘酯苷B和金石蚕苷单体的方法，以及连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分析方法。

背景技术

广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun．)为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属(Callicarpa L．)植物，别名万年青、珍珠风、臭常山、老鸦饭、金刀菜等，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、贵州、云南等地，收载于江西省药材标准(1996年版第24页)，其药用部位为干燥的茎枝及叶，具有收敛止血、清热解毒之功效。用于咯血，衄血，便血，肺胃出血，崩漏，肺热咳嗽，咽喉肿痛，烧伤，热毒疮疡，外伤出血。广东紫珠对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌在体外有较强的抑制作用，对实验性炎症早期的渗出产生明显的抑制炎症反应，可明显缩短出血和凝血时间，止血效果显著。化学成分研究表明，广东紫珠的主要活性成分为连翘酯苷B和金石蚕苷，除此之外还含有没食子酸、紫珠萜酮、谷甾醇、齐墩果酸、熊果酸、水杨酸、丙氨酸等多种成分。连翘酯苷B抗金黄色葡萄球菌和奇异变形杆菌的作用，以及金石蚕苷抗氧化、抑制红血球溶血的作用均与广东紫珠的药理作用密切相关。

广东紫珠药材是中国药典2010年版起草品种(YS一264)，连翘酯苷B和金石蚕苷是在《中国药典》2010年版一部中收载的指标成分，它们的结构式如下：

Figure 2010105553385100002DEST_PATH_IMAGE001

针对广东紫珠药理作用应用广泛，但主要是对其提取物的制备和应用，如申请号为200810014095.7的专利申请公开了“连翘酯苷B在制备治疗或预防急慢性肝损伤及肝纤维化的药物中的应用”。加之，连翘酯苷B和金石蚕苷已在2010年药典中被列为标准，这两种单体的需求量越来越大，尤其是金石蚕苷在药材中含量很低，从药材中分离出单体非常困难，而且目前市场上还没有连翘酯苷B和金石蚕苷克级产品的提供，也未有连翘酯苷B和金石蚕苷单体的制备分离报道，因此从广东紫珠中分离纯化连翘酯苷B和金石蚕苷单体显得非常必要，具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，提供一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离纯化方法，此方法不但可实现连翘酯苷B和金石蚕苷单体的同步分离，且分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可大量制备得到纯度大于98%的单体。同时本发明还提供了一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分析方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的分离纯化方法，包括步骤a、广东紫珠药材的提取和浓缩；步骤b、连翘酯苷B和金石蚕苷的富集；步骤c、连翘酯苷B和金石蚕苷半成品溶液的制备；步骤d、连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分离；步骤e、单体的浓缩及干燥处理。

上述步骤a—e的具体工艺方法如下：

a、广东紫珠药材的提取和浓缩：将广东紫珠药材粉碎成40~65目的粉末，加入药材重量5~10倍的乙醇溶液，50～70℃加热提取，每次提取2小时，共提取3次，合并提取液，于50~80℃条件下减压回收乙醇，浓缩至水溶液，过滤，得浓缩液；

所述乙醇溶液的体积百分比浓度为30%~50%。

步骤a也可采用加入药材重量5~10倍的蒸馏水进行水提取，过滤得水提取液。

b、连翘酯苷B和金石蚕苷的富集：将步骤a所得浓缩液或水提取液上活化好的AB-8大孔树脂进行吸附，吸附完全后，先用3倍柱体积的水进行洗脱，去掉糖类等大极性杂质，然后再用3倍柱体积的30%（V/V）乙醇解析，收集解析液，合并浓缩液至浸膏；

c、连翘酯苷B和金石蚕苷半成品溶液的制备：将步骤b制得的浓缩浸膏以60-80目硅胶拌样后进行硅胶层析柱色谱初分，采用二氯甲烷－甲醇洗脱体系，并按50：1－1：1的体积比由高到低作梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，得到连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液；

d、连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分离：利用制备型高效液相色谱柱，将步骤c所得连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液进行连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离，示差折光检测器在线检测，分别收集连翘酯苷B和金石蚕苷的单体溶液，分别于50℃减压浓缩，再分别进行二次高效液相色谱分离；

所述高效液相色谱柱的直径为8～30cm，粒度10μm、C₁₈填料，ρ=0.940（20℃）g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速100~300mL/min。

所述甲醇水溶液的体积百分比浓度为40%，且在该甲醇水溶液中加有0.5%（体积比）的磷酸。

e、单体溶液的浓缩及干燥处理：将步骤d所得单体溶液，分别于50～60℃减压回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附树脂富集，70～95%乙醇（V/V）解吸附，解吸液减压浓缩至粉末状，50℃与五氧化二磷共存真空干燥至恒重，即可收集分别得到连翘酯苷B和金石蚕苷单体产品。

本发明的有益效果表现在：

1、采用制备型高效液相色谱柱对连翘酯苷B和金石蚕苷单体进行分离，示差折光检测器在线检测，针对性收集连翘酯苷B和金石蚕苷单体，目标明确，避免了常规柱分离的盲目性和先分离后检测造成的资源浪费。

2、过程直观，目标性强，对产品的质量易于控制，产品纯度均在98%以上。

3、本发明整体工艺高效，环保，收率高，产量大，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明广东紫珠原料的高效液相色谱图

图2为本发明连翘酯苷B和金石蚕苷半成品的高效液相在线制备色谱图

图3为本发明连翘酯苷B单体（含量＞98%）的高效液相色谱图

图4为本发明金石蚕苷单体（含量＞98%）的高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1

一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离纯化方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

a、广东紫珠药材的提取和浓缩：取广东紫珠药材10kg，粉碎成50目粉末，加入药材重量5倍的体积百分比浓度为30%的乙醇溶液，60℃回流提取3次，每次2h，合并三次的提取液；于70℃减压回收乙醇，浓缩至水溶液，过滤，得浓缩液；

b、连翘酯苷B和金石蚕苷的富集：将步骤a所得浓缩液上活化好的AB-8大孔树脂进行吸附，吸附完全后先用3倍柱体积水进行洗脱，去掉糖类等大极性杂质，然后用3倍柱体积的30%（V/V）乙醇解析，收集解析液，合并浓缩至浸膏；

c、连翘酯苷B和金石蚕苷半成品溶液的制备：将步骤c制得的浓缩浸膏以60-80目硅胶拌样后进行硅胶层析柱色谱初分，采用二氯甲烷－甲醇洗脱体系，并依次按50：1，20：1，10：1， 5：1和1：1的体积比由高到低作梯度洗脱， TLC跟踪检测，收集洗脱液，得到连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液40g；

d、连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分离：利用制备型高效液相色谱柱，分离柱直径15cm，C₁₈填料，粒度10μm，ρ=0.940（20℃）g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速300mL/min，将步骤c所得连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液进行连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离，示差折光检测器在线检测，分别收集连翘酯苷B和金石蚕苷的单体溶液，分别浓缩，再分别进行二次高效液相色谱分离；

e、制备所得单体溶液的处理以及产品干燥：将步骤d所得单体溶液，分别于50～60℃减压回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附树脂富集，80%乙醇解吸附，解吸液减压浓缩至粉末状，50℃与五氧化二磷共存真空干燥至恒重，即可收集产品，分别得到连翘酯苷单体B 24g、金石蚕苷单体3g。

所得产品用反相高效液相色谱柱分离（RP-HPLC），分析液相检测，连翘酯苷B纯度98.61%，金石蚕苷纯度99.28%。

色谱柱填料为C₁₈，粒度5μm，流动相为含0.5%磷酸的40%甲醇水溶液（体积百分比浓度），检测波长为332nm；流速1mL/min。

实施例2

a、广东紫珠药材的提取和浓缩：取广东紫珠药材5kg，粉碎成60目粉末，加入5倍重量的体积百分比浓度为40%的乙醇溶液，55℃回流提取3次，每次2h，合并三次的提取液；于70℃减压回收乙醇，浓缩至水溶液，过滤，得浓缩液；

c、连翘酯苷B和金石蚕苷半成品溶液的制备：将步骤c制得的浓缩浸膏以60-80目硅胶拌样后进行硅胶层析柱色谱初分，采用二氯甲烷－甲醇洗脱体系，并依次按50：1，15：1，8：1， 4：1和1：1的体积比由高到低作梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，得到连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液22g；

d、连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分离：利用制备型高效液相色谱柱，分离柱直径15cm，C₁₈填料，粒度10μm，ρ=0.940（20℃）g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速140mL/min，将步骤c所得连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液进行连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离，示差折光检测器在线检测，分别收集连翘酯苷B和金石蚕苷的单体溶液，分别浓缩，再分别进行二次高效液相色谱分离；

e、制备所得单体溶液的处理以及产品干燥：将步骤d所得单体溶液，分别于50～60℃减压回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附树脂富集，95%乙醇解吸附，解吸液减压浓缩至粉末状，50℃与五氧化二磷共存真空干燥至恒重，即可收集产品，分别得到连翘酯苷B单体 13g、金石蚕苷单体1.8g。

所得产品用反相高效液相色谱柱分离（RP-HPLC），分析液相检测，连翘酯苷B纯度98.8%，金石蚕苷纯度99.1%。检测条件同实施例1。

实施例3

a、广东紫珠药材的提取和浓缩：取广东紫珠药材20kg，粉碎成40目粉末，加入8倍重量的体积百分比浓度为50%的乙醇溶液，65℃回流提取3次，每次2h，合并三次的提取液；于80℃减压回收乙醇，浓缩至水溶液，过滤，得浓缩液；

c、连翘酯苷B和金石蚕苷半成品溶液的制备：将步骤c制得的浓缩浸膏以硅胶（60-80目）拌样后进行硅胶层析柱色谱初分，采用二氯甲烷－甲醇洗脱体系，并依次按50：1，15：1，10：1， 5：1和1：1的体积比由高到低作梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，得到连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液90g；

d、连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分离：利用制备型高效液相色谱柱，分离柱直径20cm，C₁₈填料，粒度10μm，ρ=0.940（20℃）g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速300mL/min，将步骤c所得连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液进行连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效分离，示差折光检测器在线检测，分别收集连翘酯苷B和金石蚕苷的单体溶液，分别浓缩，再分别进行二次高效液相色谱分离；

e、制备所得单体溶液的处理以及产品干燥：将步骤d所得单体溶液，分别于50～60℃减压回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附树脂富集，75%乙醇解吸附，解吸液减压浓缩至粉末状，50℃与五氧化二磷共存真空干燥至恒重，即可收集产品，分别得到连翘酯苷B单体 50g、金石蚕苷单体6.5g。

所得产品用反相高效液相色谱柱分离（RP-HPLC），分析液相检测，连翘酯苷B纯度98.5%，金石蚕苷纯度98.8%。检测条件同实施例1。

实施例4

a、广东紫珠药材的提取和浓缩：取广东紫珠药材30kg，粉碎成50目粉末，加入10倍重量的水溶液，70℃回流提取3次，每次2h，合并三次的提取液，过滤；

b、连翘酯苷B和金石蚕苷的富集：将步骤a所得提取液上活化好的AB-8大孔树脂进行吸附，吸附完全后先用3倍柱体积水进行洗脱，去掉糖类等大极性杂质，然后用3倍柱体积的30%（V/V）乙醇解析，收集解析液，合并浓缩至浸膏；

c、连翘酯苷B和金石蚕苷半成品溶液的制备：将步骤c制得的浓缩浸膏以硅胶（60-80目）拌样后进行硅胶层析柱色谱初分，采用二氯甲烷－甲醇洗脱体系，并依次按50：1，12：1，6：1， 3：1和1：1的体积比由高到低作梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，得到连翘酯苷B和金石蚕苷半成品甲醇溶液125g；

e、制备所得单体溶液的处理以及产品干燥：将步骤d所得单体溶液，分别于50～60℃减压回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附树脂富集，75%乙醇解吸附，解吸液减压浓缩至粉末状，50℃与五氧化二磷共存真空干燥至恒重，即可收集产品，分别得到连翘酯苷B单体 75g、金石蚕苷单体9.5g。

所得产品用反相高效液相色谱柱分离（RP-HPLC），分析液相检测，连翘酯苷B纯度99.1%，金石蚕苷纯度99.3%。检测条件同实施例1。

Claims

1.一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的分离纯化方法，其特征在于：包括步骤a、广东紫珠药材的提取和浓缩；步骤b、连翘酯苷B和金石蚕苷的富集；步骤c、连翘酯苷B和金石蚕苷半成品溶液的制备；步骤d、连翘酯苷B和金石蚕苷单体的高效液相色谱分离；步骤e、单体的浓缩及干燥处理。

2.如权利要求1所述的一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤a—e的具体工艺方法如下：

a、广东紫珠药材的提取和浓缩：将广东紫珠药材粉碎成40~65目的粉末，加入药材重量5~10倍的乙醇溶液，50～70℃加热提取，每次提取2小时，共提取3次，合并提取液，于50~80℃条件下减压回收乙醇，浓缩至水溶液，过滤，得浓缩液；或者采用加入药材重量5~10倍的蒸馏水进行水提取，过滤得水提取液；

b、连翘酯苷B和金石蚕苷的富集：将步骤a所得浓缩液或水提取液上活化好的AB-8大孔树脂进行吸附，吸附完全后，先用3倍柱体积的水进行洗脱，去掉糖类等大极性杂质，然后再用3倍柱体积的30% 乙醇解析，收集解析液，合并浓缩液至浸膏；

e、单体溶液的浓缩及干燥处理：将步骤d所得单体溶液，分别于50～60℃减压回收甲醇，水溶液用活化好的AB-8大孔吸附树脂富集，70～95%乙醇解吸附，解吸液减压浓缩至粉末状，50℃与五氧化二磷共存真空干燥至恒重，即可收集分别得到连翘酯苷B和金石蚕苷单体产品。

3.如权利要求2所述的一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的分离纯化方法，其特征在于：步骤a所述乙醇溶液的体积百分比浓度为30%~50%。

4.如权利要求2所述的一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的分离纯化方法，其特征在于：步骤d所述高效液相色谱柱的直径为8～30cm，粒度10μm、C₁₈填料，ρ=0.940g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速100~300mL/min。

5.如权利要求2或4所述的一种连翘酯苷B和金石蚕苷单体的分离纯化方法，其特征在于：所述甲醇水溶液为含0.5%磷酸的40%甲醇水溶液。