CN102078345B - 一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法 - Google Patents
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，将软枣猕猴桃鲜果经过粗提、除杂、初步分离、聚酰胺柱色谱分离纯化、对分离纯化后的软枣猕猴桃总黄酮干粉进行制备色谱分离得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。该方法适合从软枣猕猴桃中提取分离纯化制备黄酮，可操作性强，制备效果好。通过本发明方法的实施，可以了解软枣猕猴桃黄酮组成及结构，为软枣猕猴桃综合开发利用提供支持。
Description
技术领域：
本发明主要涉及本方法涉及从一种水果中制备黄酮的方法，尤其是涉及一种从软枣猕猴桃中制备黄酮的方法。
背景技术：
软枣猕猴桃（Actinidia arguta Sieb.et Zucc）又名软枣子、猕猴梨、藤瓜和藤枣，为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)多年生落叶藤本植物，分布于东北、华北、山东、西北及长江流域，其中东北南部山区较多见。果实可食用，多汁，酸甜适口，风味独特。营养价值很高，含大量维生素C、B族维生素、氨基酸、类胡萝卜素、多糖、黄酮等多种营养成分。黄酮类化合物是一类植物中分布很广而且重要的多酚类天然产物，具有广泛的药理活性，如抗氧化作用、抗菌抗病毒作用、消炎作用、提高机体免疫力、抗肿瘤、降血压、降血脂、防治心脑血管疾病和保肝护肝等生理功能。但是，从东北野生软枣猕猴桃中制备黄酮化合物还未见报道，这对了解软枣猕猴桃黄铜组成与结构，以及为今后软枣猕猴桃综合开发利用带来了一些问题。
发明内容：
1、发明目的：
本发明提供了一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其目的在于了解软枣猕猴桃黄酮组成与结构，为软枣猕猴桃综合开发利用提供支持。
2、技术方案：
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过50～100目筛，采用体积分数为60～80%乙醇浸溶，液料比为1:5～10 g/mL，300～500w超声处理20min，超声处理，50～60℃水浴提取，离心取上清液，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液；
b、除杂：将步骤a中得到的粗提液减压浓缩，加入无水乙醇生成沉淀，取上清液，减压浓缩后依次用石油醚、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液；
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，体积分数70%乙醇为洗脱剂，收集洗脱液；
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，依次用水、甲醇-水梯度洗脱，甲醇-水的体积比1：9～4：6,分段接收，洗脱流分冷冻干燥成软枣猕猴桃总黄酮干粉；
e、对步骤d中的软枣猕猴桃总黄酮干粉进行制备色谱分离，得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
上述步骤a中于50～60℃水浴提取3h，提取物混合液于3～6℃，9000～11000 r/min离心10～20 min，取上清液，残渣用体积分数为60～80%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
上述步骤b中除杂按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
在步骤（2）中依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次。
在步骤c中进行初步分离时，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到25～35%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
步骤d中用聚酰胺柱色谱分离纯化时，将步骤c中洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水按体积比1：9～4：6的梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，洗脱流分，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
步骤d中甲醇-水按体积比为1：9、2：8、3：7和4：6的梯度洗脱。
上述步骤e中进行软枣猕猴桃黄酮制备色谱分离时，将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成25～35g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水体积比为45：55，流速3.0～7.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为50～70min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
3、优点及效果：
本发明为了解决对软枣猕猴桃黄酮组成与结构的确定，以及对软枣猕猴桃综合开发利用寻求途径的问题，从软枣猕猴桃果实成分方面进行研究，经过长期的试验，研制出这种从软枣猕猴桃中制备黄酮的方法，可最大程度保留软枣猕猴桃黄酮含量，较好地解决了从果实中制备黄酮的方法问题，从而了解软枣猕猴桃黄酮组成与结构，为软枣猕猴桃综合开发利用提供支持。通过实施，可以得到三种黄酮单组分。本发明的方法具有可操作性强，制备效果好，所用试剂毒性较小，安全等优点。
附图说明：
图1为本发明的色谱图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过50～100目筛，采用体积分数为60～80%乙醇浸溶，混合均匀，液料比为1:5～10 g/mL，300～500w超声处理20min，50～60℃水浴提取，离心取上清液，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
b、除杂：将步骤a中得到的粗提液减压浓缩，加入无水乙醇生成沉淀，取上清液，减压浓缩后依次用石油醚、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，体积分数70%乙醇为洗脱剂，收集洗脱液。
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，依次用水、甲醇-水梯度洗脱，甲醇-水的体积比1：9～4：6,分段接收，洗脱流分冷冻干燥成软枣猕猴桃总黄酮干粉。
e、对步骤d中的软枣猕猴桃总黄酮干粉进行制备色谱分离，得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
上述步骤a中于50～60℃水浴提取3h，提取物混合液于3～6℃，9000～11000 r/min离心10～20 min，取上清液，残渣用体积分数为60～80%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
上述步骤b中除杂按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，此时使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，达到除杂目的，去除沉淀，留上清液备用。
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
在步骤（2）中依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次。
在步骤c中进行初步分离时，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到25～35%后上样，这样做有助于黄酮溶解，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
步骤d中用聚酰胺柱色谱分离纯化时，将步骤c中洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水（1：9～4：6，V/V）梯度洗脱，即先用水洗脱后，再用甲醇-水的体积比依次按照1：9～4：6的比例分四次梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，之所以先用水洗脱，再用甲醇-水洗脱，是因为这样比单独用水洗脱或者单独用甲醇洗脱得到的黄酮含量大很多；用分析型高效液相色谱仪检测，当溶剂组成即甲醇与水的体积比依次取为1：9、2：8、3：7、4：6时得到的黄酮含量大，各比例洗脱液中各个黄酮单组分含量有所不同，说明黄酮有一定的极性，且各个黄酮单组分极性也各不相同。水-甲醇梯度洗脱液经高效液相色谱检测主要含有7个色谱峰分离较为理想，适合于制备型液相色谱制备。将甲醇与水的比例为1：9～4：6的四份洗脱液洗脱流分，减压浓缩后，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成25～35g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水（45：55，V/V），流速3.0～7.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，采用上述条件能够达到良好分离，分离时间为50～70min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。图1中所示的色谱图接收3个流分。
实施例1：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过80目筛，加入体积分数为70%乙醇浸溶，此时黄酮溶解度最佳，混合均匀，液料比为1:8 g/mL，300w超声处理20min，于55℃水浴提取3h，提取物混合液于4℃，10000 r/min离心15 min，取上清液，残渣用体积分数为70%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
b、除杂：按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，此时使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，达到除杂目的，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到30%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，将洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水（1：9、2：8、3：7、4：6，V/V）梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，将上述四份洗脱液洗脱流分，减压浓缩后，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
e、将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成30g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水（45：55，V/V），流速5.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为60min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
实施例2：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过50目筛，加入体积分数为60%乙醇浸溶，混合均匀，液料比为1:5 g/mL，500w超声处理20min，于50℃水浴提取3h，提取物混合液于3℃，9000 r/min离心10 min，取上清液，残渣用体积分数为60%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
b、除杂：按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，此时使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，达到除杂目的，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到25%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，将洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水（1：9、2：8、3：7、4：6，V/V）梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，将上述四份洗脱液洗脱流分，减压浓缩后，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
e、将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成25g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水（45：55，V/V），流速7.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为50min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
实施例3：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过100目筛，加入体积分数为80%乙醇浸溶，混合均匀，液料比为1:10 g/mL，400w超声处理20min，于60℃水浴提取3h，提取物混合液于6℃，11000 r/min离心20 min，取上清液，残渣用体积分数为80%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
b、除杂：按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，此时使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，达到除杂目的，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到35%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，将洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水（1：9、2：8、3：7、4：6，V/V）梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，将上述四份洗脱液洗脱流分，减压浓缩后，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
e、将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成35g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水（45：55，V/V），流速3.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为70min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
实施例4：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过60目筛，加入体积分数为65%乙醇浸溶，混合均匀，液料比为1:6 g/mL，350w超声处理20min，于52℃水浴提取3h，提取物混合液于5℃，9500 r/min离心12min，取上清液，残渣用体积分数为65%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
b、除杂：按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，此时使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，达到除杂目的，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到28%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，将洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水（1：9、2：8、3：7、4：6，V/V）梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，将上述四份洗脱液洗脱流分，减压浓缩后，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
e、将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成27g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水（45：55，V/V），流速6.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为55min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
实施例5：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过70目筛，加入体积分数为75%乙醇浸溶，混合均匀，液料比为1:7 g/mL，450w超声处理20min，于58℃水浴提取3h，提取物混合液于3℃，10500 r/min离心19 min，取上清液，残渣用体积分数为75%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
b、除杂：按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，此时使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，达到除杂目的，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到32%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，将洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水（1：9、2：8、3：7、4：6，V/V）梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，将上述四份洗脱液洗脱流分，减压浓缩后，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
e、将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成33g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水（45：55，V/V），流速4.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为65min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
实施例6：
一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过90目筛，加入体积分数为72%乙醇浸溶，混合均匀，液料比为1:9 g/mL，500w超声处理20min，于55℃水浴提取3h，提取物混合液于4℃，10000 r/min离心17 min，取上清液，残渣用体积分数为72%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
b、除杂：按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积百分比浓度达到80%以上，此时使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，达到除杂目的，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积百分比浓度达到26%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，再次去除糖类和蛋白质等其它杂质，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，将洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱（120cm*8cm，聚酰胺粉500g）中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水（1：9、2：8、3：7、4：6，V/V）梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，将上述四份洗脱液洗脱流分，减压浓缩后，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
e、将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成31g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样；制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水（45：55，V/V），流速5.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为60min，即得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
本发明这种干法提取软枣猕猴桃黄酮的方法与之前所采用的湿法提取软枣猕猴桃黄酮的方法相比，其优点在于：比较干法提取和湿法提取，软枣猕猴桃黄酮提取率相当，但干法提取更加节省溶剂用量，这在工业化生产中意义尤其巨大。软枣猕猴桃含水量在86%左右，以100g为例，湿法提取按料液比1:8g/mL需要溶剂800mL，用量很大；而干法提取法将鲜果烘干后只剩下十几克，如按料液比1:8，所需溶剂仅为一百二三十毫升，溶剂用量节省至少600mL，在大规模工业化生产中可较大程度减少溶剂用量，有效降低生产成本,采取此方法提取黄酮具有广阔的开发前景。
Claims (8)
1.一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
a、粗提：将软枣猕猴桃鲜果烘干、粉碎、过50～100目筛，体积分数60～80%乙醇浸溶，液料比为1:5～10 g/mL，300～500w超声处理20min， 50～60℃水浴提取，离心取上清液，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液；
b、除杂：将步骤a中得到的粗提液减压浓缩，加入无水乙醇生成沉淀，取上清液，减压浓缩后依次用石油醚、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液；
c、初步分离：用HPD-600大孔吸附树脂对步骤b中的软枣猕猴桃总黄酮提取液进行初步分离，体积分数70%乙醇为洗脱剂，收集洗脱液；
d、聚酰胺柱色谱分离纯化：将步骤c中收集的洗脱液减压浓缩后进行聚酰胺柱色谱层析，依次用水、甲醇-水梯度洗脱，甲醇-水的体积比1：9～4：6,分段接收，洗脱流分冷冻干燥成软枣猕猴桃总黄酮干粉；
e、对步骤d中的软枣猕猴桃总黄酮干粉进行制备色谱分离，制备液相色谱的分离条件：流动相甲醇-水体积比为45：55，流速3.0～7.0mL/min，上样量600μL，柱温为30℃，检测波长为340nm，分离时间为50～70min，得软枣猕猴桃各黄酮组分纯品。
2.根据权利要求1所述的一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：步骤a中于50～60℃水浴提取3h，提取物混合液于3～6℃，9000～11000 r/min离心10～20 min，取上清液，残渣用体积分数60～80%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后离心，合并两次提取液，并用旋转蒸发器减压浓缩，得到软枣猕猴桃总黄酮粗提液。
3.根据权利要求1所述的一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：步骤b中除杂按以下步骤进行：
（1）生成沉淀除杂：向步骤a中得到的粗提液中加入无水乙醇至乙醇体积浓度达到80%以上，使大量多糖、蛋白质等杂质形成沉淀与黄酮分开，去除沉淀，留上清液备用；
（2）液液萃取除杂：将步骤（1）中的上清液减压浓缩得浸膏，加水混悬后，依次用石油醚和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得到进一步纯化的软枣猕猴桃总黄酮提取液。
4.根据权利要求3所述的一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相无色为止，正丁醇萃取3次。
5.根据权利要求1所述的一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：在步骤c中进行初步分离时，向步骤b中得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇体积浓度达到25～35%后上样，先用蒸馏水冲洗至洗脱液无色澄清，然后用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后备用。
6.根据权利要求1所述的一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：步骤d中用聚酰胺柱色谱分离纯化时，将步骤c中洗脱液减压浓缩后得到的软枣猕猴桃总黄酮提取液缓慢倒入已处理好的聚酰胺填料的柱色谱中，充分吸附30min后按极性由高到低，依次用水、甲醇-水按体积比1：9～4：6的梯度洗脱，各梯度洗脱液均洗脱至无色为止，分段接收，洗脱流分，冷冻干燥得到纯度较高的软枣猕猴桃总黄酮干粉。
7.根据权利要求1所述的一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：将步骤d中经聚酰胺柱色谱分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成25～35g/L的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样。
8.根据权利要求1或6所述的一种软枣猕猴桃黄酮的制备方法，其特征在于：步骤d中甲醇-水按体积比为1：9、2：8、3：7和4：6的梯度洗脱。
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