CN102212002B - 一种高纯度丹酚酸a的批量制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明基于丹参化学成分的理化性质、色谱行为及其与单元分离技术适应性，提供了一种高纯度丹酚酸A的批量制备方法，其中含丹酚酸A的丹酚酸B转化液经联合色谱、反相色谱和正相硅胶色谱三次色谱纯化，联合色谱法为大孔树脂前沿色谱与大孔树脂置换色谱联用。该方法制备的产品质量稳定可控、成本可接受、可供注射药用。使用本方法制备的丹参酚酸A含量≥98％，丹参酚酸A总收率≥10％(以丹参酚酸B计)，总产率≥0.5％(以丹参药材计)。
Description
技术领域
本发明涉及一种高纯度丹酚酸A的批量制备方法。
背景技术
丹参是我国心脑血管病的基本治疗药物，因疗效确切，丹参已成为我国用量最大(1.5万吨/年)、销售额最高、制剂生产厂最多的中药(制剂生产厂960家，剂型主要有丹参滴丸、丹参注射液、丹参片、丹参颗粒、丹参冲剂和丹参胶囊)，此外丹参还与其它药材复方，用于肺心病、高脂血症、高血粘度综合征、哮喘、支气管肺炎、肝炎、肝硬化、肾病综合征、关节炎、糖尿病循环障碍、各种细菌性和病毒性感染、抗内毒素、肿瘤、硬皮病、皮肤炎、银屑病、过敏性紫癜、红斑狼疮、血栓闭塞性脉管炎、痤疮、难治性癫痫、视网膜病变等多种疾病的治疗。
丹参的主要有效成分是丹酚酸。现代药理研究表明，丹酚酸是以抗氧化、抗炎(通过NF-κβ途径抑制多种炎性细胞因子表达)为特点、同时具有保护脉管内皮细胞、降脂、升高高密度脂蛋白、保护心肌缺血缺氧、扩张冠脉血管、改善微循环、抑制血小板聚集、抑制纤维蛋白原合成、激活纤溶、抑制血栓形成、螯合钙铁离子等多种药理作用。在所有已知酚类化合物中(包括黄酮类化合物)丹酚酸类化合物的抗氧化活性最强，其中又以丹酚酸A(salvianolic acid A，SA)的活性最佳〔《中草药现代研究》II，1996，498-533.Yi Yang Hu et al.，World JGastroentero，2000；6(3)：402-404.Cheng Hai Liu et al.，World J Gastroentero，2000；6(3)：361-364.Yun-Lian Lin et al.J.Nat.Prod.2002，65，745-747.Lin YL et al..J.Ethnopharmacol.2005.Chen YF et al..J.Chromatogr A.2005；1088(1-2)：140-5.Hsu YC et al..J Biomed Sci.2005；12(1)：185-95.Lay IS et al..J Surg Res.2003；115(2)：279-85.Lay IS et al..Planta Med.2003；69(1)：26-32.Chen YL et al..J CellBiochem.2001；83(3)：484-93.Chen YH et al..J Cell Biochem.2001；82(3)：512-21.Hung HH et al..Histol Histopathol.2001；16(1)：175-83.Wu YJ et al..ArteriosclerThromb Vasc Biol.1998；18(3)：481-6.〕，但是，丹参中丹酚酸A的天然含量及其纯化技术一直制约着丹酚酸A的研发。
丹参药材中，主要含丹酚酸B，丹酚酸A的含量约为0.03％～0.06％。在高温处理丹参提取物制备丹酚酸A的技术建立，基本解决了其资源供给后，丹酚酸A的开发利用主要面临批量分离纯化的挑战。
中国专利CN1830947首次公开了的条件为101～140℃处理0.5～24小时。随后，CN100999470对CN1830947条件进行了细化，公开了丹参提取物或丹参总酚酸在pH3.5～6.0、110～130℃下处理1～6小时制备丹酚酸A的条件。
我国学者李连良首次用制备薄层色谱自丹参药材中制备了丹酚酸A(Lian-Niang L et al.Planta Med.1984 50(3)：227-8.)。台湾学者林云莲(Lin YL et al.J Nat Prod.2002；65(5)：745-7.19.Journal of the Chinese Chemical Society，2003，50，1079-108)报道了由大孔树脂HP20结合葡聚糖疑胶sephadex LH-20制备丹酚酸A方法。
CN1397276公开了聚酰胺或大孔树脂+硅胶两次色谱法纯化丹酚酸A的方法。CN1830947和CN1887849公开了大孔树脂、离子交换树脂、葡聚糖疑胶sephadex LH-20、反相树脂MCI-GEL-CHP-20P、C8或C18一次色谱法制备丹酚酸A的方法。CN1958555公开了大孔树脂、聚酰胺、离子交换树脂、葡聚糖疑胶sephadex LH-20、反相树脂MCI-GEL-CHP-20P、C8或C18两次色谱制备丹酚酸A的方法。CN100999470公开了大孔树脂+硅胶、聚酰胺或葡聚糖疑胶sephadexLH-20的两次色谱制备丹酚酸A的方法。
但由于丹酚酸A水溶性高、不结晶、共存大量性质相近化合物和拟“胶体”类杂质，目前文献报道和专利公开的纯化技术或不能批量制备(如葡聚糖疑胶sephadex LH-20价格高昂、流速低、处理量小；C8或C18处理量小、寿命短)，或产品达不到安全可控的药用要求，致使丹酚酸A至今没有得到实际应用。
根据色谱行为(附图1和附图2)，丹A待分离体系的化学物质分为四大类：1、前沿杂质(主要是以丹参酮为代表的低极性物质)；2、酚酸类杂质(主要是丹参素、原儿茶醛和丹B)；3、丹A邻近杂质；4、拟“胶体”类杂质(主要是以在TLC分析中原点处物质为代表的一类杂质)。
前沿杂质较容易分离，大孔吸附树脂便可有效实现；酚酸类杂质无论在反相色谱或正相色谱上均具有满足批量制备的分离度(分离度≥2)，分离难度不大。丹A原料药制备所面临的挑战是邻近杂质和拟“胶体”类杂质的分离。
其中，拟“胶体”类杂质是从色谱行为上对植物中目前尚未给出明确化学表征的一类物质。该类物质在正相和反相TLC上均主要集中于原点，却又少量全程分布于正相和反相TLC上；在TLC上没有明确的斑点，在HPLC又无明确的UV吸收峰；在任何极性的洗脱液洗脱时，都有少量被洗脱。这一独特的行为使拟“胶体”类杂质去除成为天然产物分离纯化关键问题之一，特别是对那些不能结晶的化合物。它的去除与否在很大程度上决定了目标化合物的纯度是否满足药用要求。作为口服制剂，只有在肠道游离的目标化合物才能被吸收，胶体与目标化合物相互作用强，影响生物利用度；作为注射剂，刺激、过敏、凝聚试验和异常毒性均可能与这类物质密切相关。
目前，分离拟“胶体”类化合物的相关技术有：1、膜分离技术；2、C18反相色谱；3、溶剂萃取；
膜分离技术尽管能有效去除拟“胶体”类杂质，但因其属于非切向力分离技术，目标化合物往往与这类杂质有极高亲和力，而导致目标化合物损失严重。此外，膜技术用于这类杂质的分离时，还面临膜孔阻塞和膜寿命的问题。
溶剂萃取技术中溶剂的选择性至关重要，效果也不理想。
传统的C18反相色谱因使用上样量小、pH范围有限、不能进行有效再生、寿命短、受限于成本等因素，不能广泛使用。
综上所述，目前迫切需要一个产品质量稳定可控、成本可接受、可供注射药用的丹酚酸A的批量生产方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一个产品质量稳定可控、成本可接受、可供注射药用的丹酚酸A的批量生产方法。
一种高纯度丹酚酸A的批量制备方法，其包含下列步骤：
(1)采用联合色谱法初步纯化丹酚酸A，所述的联合色谱法为大孔树脂前沿色谱与大孔树脂置换色谱联用；
(2)反相色谱进一步纯化丹酚酸A；
(3)正相色谱精制丹酚酸A。
其中，步骤(1)所述前沿色谱中的填料选自大孔吸附树脂ADS-5、D101或DM130，所述置换色谱的填料选自大孔吸附树脂ADS-8或HPD100，前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为(0.5～1)∶4。
优选的，步骤(1)前沿色谱填料为大孔吸附树脂ADS-5，置换色谱填料为ADS-8，前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为1∶5。
其中，步骤(1)所述的联合色谱法是：前沿色谱柱与置换色谱柱串联，丹参酚酸B转化液按先前沿色谱柱后置换色谱柱的顺序上样后，用20％～25％的醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，断开两柱，置换色谱柱用30-50％的醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，再用50-70％的醇洗脱收集含杂质的丹参酚酸A，前沿色谱柱直接再生使用。
优选的，步骤(1)所述的色谱联用方法是：前沿色谱柱与置换色谱柱串联，丹参酚酸B转化液按先前沿色谱柱后置换色谱柱的顺序上样后，用22％的醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，断开两柱，置换色谱柱用40％的醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，再用60％的醇洗脱收集含杂质的丹参酚酸A，前沿色谱柱直接再生使用。
其中，丹参酚酸A与置换色谱填料的重量比为1∶(30～50)。
优选的，丹参酚酸A与置换色谱填料的重量比为1∶40。
其中，步骤(2)所述的反相色谱填料为反相树脂CG161、SBC-MCI-GEL或MCI-GEL-CHP-20P，丹参酚酸A与反相色谱填料的重量比为1∶(30～50)。
优选的，丹参酚酸A与反相色谱填料的重量比为1∶40，反相色谱填料为CG161。
其中，步骤(2)所述的反相色谱操作为：上样后，用20％～25％醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，再用35％～40％醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，最后用50～70％醇溶液洗脱收集含杂质的丹参酚酸A。
优选的，步骤(2)所述的反相色谱操作为：上样后，用22％醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，再用38％醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，最后用60％醇溶液洗脱收集含杂质的丹参酚酸A。
其中，所述醇溶液为甲醇、乙醇或丙醇水溶液。
其中，步骤(3)所述的正相色谱填料为色谱硅胶，粒度100～200目。
其中，步骤(3)所述的正相色谱操作为：乙酸乙酯萃取经步骤(2)纯化的丹参酚酸A水溶液，浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约20％～30％，加入丹参酚酸A含量2～2.5倍的色谱硅胶旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端，硅胶湿柱依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯，或者8/2或7/3的正己烷/丙酮，或者95/5或98/2的氯仿/甲醇，或者95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脱完杂质，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯，或者7/3或6/4的正己烷/丙酮，或9/1的氯仿/甲醇，或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脱收集丹参酚酸A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯，或者6/4或5/5正己烷/丙酮，或85/15氯仿/甲醇或85/15二氯甲烷/甲醇洗脱合并的含杂质的丹参酚酸A。
综上所述，本发明通过将含丹酚酸A的丹酚酸B转化液经联合色谱、反相色谱和正相硅胶色谱三次色谱纯化，分离邻近杂质的主要策略是正相色谱与反相色谱联用，从而在正相色谱上不能有效分离的非同类物质往往在反相色谱上极易分离，丹A待分离体系中的邻近杂质是非酚酸类化合物，刚好满足这一要求，另外，本发明进一步通过反相色谱和正相硅胶色谱，并合理的配置各种填料的加入量，从而大大提高了分离丹A拟“胶体”类杂质的效率，并且成本大大降低。采用本发明提供的方法，可有效去除提取物中大量的拟“胶体”类杂质，经济方便，大大降低了后续分离负荷。并且待分离体系与树脂适应性好时，也能用于单体化合物的纯化，从而为大批量生产丹酚酸A提供了产品质量稳定可控、成本可接受、可供注射药用的方法。使用本方法制备的丹酚酸A含量≥98％，丹酚酸A总收率≥10％(以丹酚酸B计)，总产率≥0.5％(以丹参药材计)。
附图说明
图1丹参化学成分的TLC图谱
图2丹参化学成分的HPLC图谱
图3丹酚酸A制备的工艺流程图
图4工艺流程图-丹A的树脂纯化
图5工艺流程图-丹A的反相色谱纯化
图6工艺流程图-丹A的正相色谱纯化
图7产品样品的TLC图谱
图8产品样品的HPLC图谱
图9产品样品的紫外吸收光谱
图10产品样品的红外吸收光谱
图11产品样品的高分辨质谱图谱
图12产品样品的电喷雾电离负离子质谱图谱
图13产品样品的1H-NMR图谱
图14产品样品的13C-NMR图谱
其中，附图1中的各数字所代表的含义和具体条件为，1：丹酚酸B；2：丹酚酸A；3：丹参水提物；4：65％丹酚酸B；色谱条件：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长280nm，流动相梯度为：0～8分钟，8～18％B；8～15分钟，18～21％B；14～40分钟，21～34％B；溶剂剂A：H3PO4∶H2O＝0.02∶100；溶剂剂B：H3PO4∶CH3CN＝0.02∶100]。
附图8中的具体条件为色谱条件：ODS柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.2％磷酸水(30∶70)；检测波长：285nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min。
具体实施方式
下面结合附图详细对本发明进行描述。
经过系统的填料筛选、单元技术优化和单元技术组合的优化，本发明提供了一种高纯度丹酚酸A的批量制备方法，其过程包含以下步骤：
1、大孔树脂前沿色谱与大孔树脂置换色谱联用初步纯化丹酚酸A；
2、反相色谱色谱进一步纯化丹酚酸A；
3、正相色谱联用精制丹酚酸A。
步骤1所述前沿色谱的填料选自大孔吸附树脂ADS-5、D101或DM130，所述置换色谱的填料选自大孔吸附树脂ADS-8或HPD100，前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为(0.5～1)∶4。
步骤1所述的色谱联用方法是：丹B转化液(pH3.0)→上样串联色谱柱(ADS-5树脂前沿色谱柱与HPD-100树脂置换色谱柱串联)→20％酸性乙醇(1moL/L H3PO4调pH至3.0)洗脱至纯丹A出现(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分杂质和前杂丹A两段合并)→断开两柱。置换色谱柱→40％乙醇溶液洗脱至丹A微量(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测)→60％乙醇溶液洗脱残留丹A至无丹A(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分纯丹A、后杂丹A和杂质三段合并)。分别合并I级纯丹A、杂质丹A和杂质三段→专用纳滤机过滤浓缩→I级纯丹A浓缩液、杂质丹A浓缩液和杂质浓缩液(滤过液可重复使用)。杂质丹A浓缩液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇杂质丹A浓缩液→并入下次丹B转化液→再次分离。杂质浓缩液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇杂质浓缩液→弃去(附图4)。
置换色谱柱→＞80％乙醇洗脱3BV再生→去离子水洗脱2BV→下次使用。前沿色谱柱→＞80％乙醇洗脱3BV→去离子水洗脱2BV→2％NaOH溶液洗脱2BV→水洗至中性→下次使用。醇洗脱液→减压浓缩(70℃)回收乙醇→残液→弃去(附图4)。
步骤2中所述反相色谱的填料选自反相树脂CG161、SBC-MCI-GEL或MCI-GEL-CHP-20P，优选CG161，丹酚酸A与反相色谱填料的重量比为1∶(30～50)。
步骤2所述的反相色谱操作为：经步骤(1)初步纯化的I级纯丹酚酸A浓缩液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇丹A浓缩液→调pH至3.0→上样CG161M相树脂柱至黄色前沿为0.5柱床高度→水洗25个柱体积→20％酸性乙醇(1moL/LH3PO4调pH至3.0)洗脱(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分杂质和前杂丹A两段合并)→40％醇溶液洗脱至丹A微量(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，合并)→60％醇溶液洗脱至无丹A(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分为后杂丹A和杂质二段合并)。
分别合并纯丹A、杂质丹A和杂质三段→专用纳滤机过滤浓缩→II级纯丹A浓缩液、杂质丹A浓缩液和杂质浓缩液(滤过液可重复使用)。＞80％乙醇洗脱液经减压浓缩回收乙醇。杂质丹A浓缩液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇杂质丹A浓缩液→再次分离。杂质浓缩液→减压浓缩(70℃)回收乙醇→无醇杂质浓缩液→弃去(附图5)。
步骤3正相色谱填料为色谱硅胶，粒度100～300目，100目巳满足分离要求。
步骤3所述的正相色谱操作为：乙酸乙酯萃取经步骤(2)纯化的II级纯丹酚酸A浓缩液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇丹A浓缩液→乙酸乙酯萃取3次(乙酸乙酯与无醇丹A浓缩液的体积比为1∶4)→乙酸乙酯萃取液→减压浓缩(50℃)回收乙酸乙酯至小体积→丹A乙酸乙酯浓缩液(固含量约25～30％)→加入硅胶(2～2.5倍)拌匀→旋转蒸发器中减压干燥(50℃)→流动性固体样品→硅胶湿柱(正己烷预装)→7/3正己烷/叔丁基甲基醚(7/3的正己烷/乙酸乙酯、7/3正己烷/丙酮、98/2氯仿/甲醇或98/2二氯甲烷/甲醇)洗脱至丹A检出(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分杂质和丹A两段合并)→6/4正己烷/叔丁基甲基醚(6/4的正己烷/乙酸乙酯、6/4正己烷/丙酮、9/1氯仿/甲醇或9/1二氯甲烷/甲醇)洗脱至丹A微量(按柱体积收集洗脱液→TLC定性检测→合并)。丹A段→减压浓缩(50℃)回收溶剂至干→丹A产品。杂质段→减压浓缩(50℃)回收溶剂至干→残渣→弃去(附图6)。
下面，参照附图3，结合具体实施方式再进一步给出本发明完整的工艺过程。其中附图3中已经明确示出的内容不再重复描述。需要说明的是，下面只是将其中涉及的重点内容进一步加以描述，但以下所有的过程及其工艺条件并不是作为必要条件加以描述的。
步骤1：树脂处理
将本工艺所用的ADS-5、HPD100、ADS-8大孔吸附树脂和CG-161反相树脂分别装入各自的色谱柱内→加入丙酮淹没树脂→真空脱气→丙酮洗脱至流出丙酮清澈→95％乙醇洗脱至流出乙醇加水不显浑浊为标准→去离子水洗脱至流出液无醇味(一般为洗脱5个柱体积)→4％NaOH浸泡过夜→4％NaOH洗脱2个柱体积(BV)→去离子水洗脱至中性→4％HCl浸泡过夜→4％HCl洗脱2BV→去离子水洗脱至中性(流速均为2cm/min)。
树脂再生：使用后的大孔吸附树脂仍保留有一定量的强吸附物质，使树脂吸附分离能力大幅度下降，需将其去除，以再生树脂的吸附分离能力。再生方法视强吸附物质的种类和量而异。
对污染严重的前沿色谱柱树脂ADS-5的再生方法为：乙醇进行洗脱至近无色→去离子水洗脱3BV→2％NaOH洗脱至近无色→去离子水洗脱至中性。
对污染较轻的置换色谱树脂HPD100和CG161的再生方法为：乙醇进行洗脱至近无色→去离子水洗脱至中性(流速均为2cm/min)即可。使用3～5次后，若树脂吸附能力明显下降后，按ADS-5的再生方法处理1次。
步骤2：丹酚酸B的提取
丹参药材(含丹酚酸B 6.1％)→干燥、粉碎过筛(40目，40公斤)→水提取(100℃，480L×3)→水提取液(丹酚酸B 2318克、含量11.36％，固体总重20.4公斤，溶液浓1.61mg/ml)。
步骤3：丹酚酸B的纯化
丹参水提液(1.6mg SB/ml，pH 3.0，1440L)→串连色谱柱(Φ100×1000ADS-5与Φ200×1500HPD-100串连)→去离子水洗脱3BV→断开两柱→70％甲醇洗脱分别洗脱3BV→浓缩至干(固体总重2878克，含丹酚酸B 65.3％、共1878克)
步骤4：催化转化丹酚酸B生成丹酚酸A
丹酚酸B粗品(2878g，65.3％SB)→180L水溶解→加入尿素(79g，为0.5丹酚酸B摩尔数)→溶解→110℃转化4小时→降至室温→调pH至3.0→丹酚酸B转化液[固体总重3264克，含丹酚酸A 21％、共685.4克，产率36.5％(以丹酚酸B计)]。
步骤5：丹酚酸A的初步纯化
丹酚酸B转化液(3.81mg SA/mL，pH 3.0，180L)→串连色谱柱(Φ100×500ADS-5与Φ200×1000HPD100串连)→20％酸性乙醇(pH 3.0)洗脱前杂至纯SA出现(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→A段)→断开两柱。40％醇溶液洗脱置换色谱柱至SA微量(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→B段)→60％醇溶液洗脱残留SA至无SA(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→C段)。B段总重502克，丹酚酸A 410.2克，含量81.7％，收率61％。A+C段总重457克，丹酚酸A 137.1克，含量30.1％，收率20％。
步骤6：丹酚酸A的反相色谱纯化
丹酚酸A粗品(B段502克，含量81.7％)→溶于水中(10mg SA/mL，pH3.0，41L)→CG161S反相树脂柱(Φ200×500，柱床高15cm)→20％酸性乙醇(pH 3.0)洗脱前杂至纯SA出现(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→A段)→40％醇溶液洗脱至SA微量(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→B段)→60％醇溶液洗脱残留SA至无SA(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→C段)。B段总重346.5克，丹酚酸A 328.1克，含量94.7％，收率80％。A+C段总重145克，丹酚酸A 61.5克，含量42.4％，收率15％。
步骤7：丹酚酸A的正相色谱精制
丹酚酸A粗品(94.7％SA，346.5g)→溶于少量乙酸乙酯(约800ml)→加入800g硅胶拌匀→旋转蒸发器中减压干燥成流动性粉未(50℃)→硅胶湿柱(Φ100×1000，正己烷预装1500g硅胶)→正己烷/叔丁基甲基醚(7/3)洗脱至SA检出(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→A段)→正己烷/叔丁基甲基醚(6/4)洗脱至SA微量(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→B段)→正己烷/叔丁基甲基醚(5/5)洗脱至洗脱液无色(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→C段)。B段总重209.1克(金黄色粉未)，丹酚酸A 201.2克，含量96.2％，收率61.3％。A+C段总重98克，丹酚酸A 49.2克，含量50.2％，收率14.7％。
步骤8：丹酚酸A的结构确认
对步骤7所得产品进行了相关的理化性质和结构检测，结果如下。下述数据与文献(中国医学科学院药物研究所，中草药现代研究，第二卷.1996，P 496；Li LNet al.Planta Medica 50，227～228；Lin，Yun-Lian.Journal of the Chinese ChemicalSociety(Taipei，Taiwan)2003，50(5)：1079-1083；Chunbo Ai et al.Journal of NaturalProducts，1988，51(1)：145；Yinshi Sun et al.Journal of Chromatography B 2009，877：733-737)报道的salvianolic acid A的数据一致。
1、产品样品的TLC检测(图7)
2、产品样品的HPLC检测(图8)
3、产品样品的旋光性
表1丹酚酸A的旋光性
4、产品样品的紫外吸收光谱(图9)
表2产品样品的摩尔消光系数
5、产品样品的红外吸收光谱(图10)
表3产品样品的红外光谱测定数据
6、产品样品的质谱检测
(1)、高分辨质谱(图11)
高分辨质谱测得：(M+Na+)517.11052，推测分子式为C26H22O10Na(计算值：517.11107)。
(2)、电喷雾电离图谱(图12)
电喷雾电离质谱测得：(M-H)-1493.28，符合分子式C26H21O10(计算值：493.11)。
7、产品样品的1H NMR检测(图13)
表4产品样品的1H NMR谱数据
*溶剂为DMSO
8、产品样品的13C-NMR检测(图14)
表5产品样品的13C-NMR光谱数据(ppm)及归属
Claims (7)
1.一种高纯度丹参酚酸A的批量制备方法，包含下列步骤：
(1)采用联合色谱法初步纯化丹参酚酸A，所述的联合色谱法为大孔树脂前沿色谱与大孔树脂置换色谱联用；
(2)反相色谱进一步纯化丹参酚酸A；
(3)正相色谱精制丹参酚酸A；
其特征在于步骤(1)所述的联合色谱法是：前沿色谱柱与置换色谱柱串联，丹参酚酸B转化液按先前沿色谱柱后置换色谱柱的顺序上样后，用20%～25%的醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，断开两柱，置换色谱柱用30-50%的醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，再用50-70%的醇洗脱收集含杂质的丹参酚酸A，前沿色谱柱直接再生使用；所述前沿色谱中的填料为大孔吸附树脂ADS-5，所述置换色谱的填料为大孔吸附树脂HPD100；
步骤(2)所述的反相色谱操作为：上样后，用20%～25%醇溶液洗脱至洗脱液中检出丹参酚酸A，再用35%～40%醇溶液洗脱收集丹参酚酸A至丹参酚酸A微量，最后用50～70%醇溶液洗脱收集含杂质的丹参酚酸A；
步骤(3)所述的正相色谱操作为：乙酸乙酯萃取经步骤(2)纯化的丹参酚酸A水溶液，浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约20%～30%，加入丹参酚酸A含量2～2.5倍的色谱硅胶旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端洗脱。
2.按照权利要求1所述丹参酚酸A的批量制备方法，其特征在于步骤(1)前沿色谱的填料与置换色谱的填料重量比为(0.5～1):4。
3.按照权利要求1所述丹参酚酸A的批量制备方法，其特征在于丹参酚酸A与置换色谱填料的重量比为1:(30～50)。
4.按照权利要求1所述丹参酚酸A的批量制备方法，其特征在于步骤(2)所述的反相色谱填料为反相树脂CG161、SBC-MCI-GEL或MCI-GEL-CHP-20P，丹参酚酸A与反相色谱填料的重量比为1:(30～50)。
5.按照权利要求1所述丹参酚酸A的批量制备方法，其特征在于所述醇溶液为甲醇、乙醇或丙醇水溶液。
6.按照权利要求1所述丹参酚酸A的批量制备方法，其特征在于步骤(3)所述的正相色谱填料为色谱硅胶，粒度100～200目。
7.按照权利要求1所述丹参酚酸A的批量制备方法，硅胶湿柱依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯、或者8/2或7/3的正己烷/丙酮、或者95/5或98/2的氯仿/甲醇、或者95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脱完杂质，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯、或者7/3或6/4的正己烷/丙酮、或9/1的氯仿/甲醇、或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脱收集丹参酚酸A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯、或者6/4或5/5正己烷/丙酮、或85/15氯仿/甲醇、或85/15二氯甲烷/甲醇洗脱合并的含杂质的丹参酚酸A。
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