CN103044251B - 一种丹酚酸a制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉一种丹参丹酚酸A制备方法，取丹参药材制成丹参提取液，丹参提取液通过催化转化，再通过一系列的分离、洗脱处理等步骤后，采用微波真空干燥，提供了一种非常适合产业应用且生产成本较低的新的制备丹酚酸A的工艺方法。

Description

一种丹酚酸A制备方法

技术领域

本发明涉及一种丹酚酸A制备方法。

技术背景

丹参制剂是我国心脑血管疾病的基本治疗药物，因疗效确切，丹参已成为我国用量最大、销售额最高、制剂生产厂最多，临床剂型最全的中药之一。丹参有效化学成分主要有两大类：脂溶性丹参酮类化合物和水溶性酚酸类化合物。研究表明：丹酚酸类在抗肝脏损伤、抗动脉粥样硬化及细胞凋亡以及改善记忆功能障碍等方面有着显著的活性。其中又以丹酚酸A(Salvianolic acid A)抗氧化活性最强，丹酚酸A结构如下：

但是，丹酚酸A的天然含量极低(约为丹参药材的0.01-0.06％)，使得原药材成本过高，分离纯化难度过大，严重制约着药物的开发和研究，成为其产业化的瓶颈。现有技术中，也一自努力尝试找到一种适于实际生产应用的提取制备丹酚酸A的生产工艺。例如，中国专利CN101041620A公开了采用水温浸、离心、树脂层析、萃取、浓缩干燥制备丹酚酸A的方法，但其最终提取物得率为3％0，产率低，生产成本高。又如，中国专利CN101121658A公开了水提取、高温高压反应、树脂层析、萃取、真空干燥或冷冻干燥制备丹酚酸A的方法。而中国专利CN101480423A公开了用乙醇/水洗脱大孔树脂所得的丹酚酸A溶液，干燥(优选减压干燥或真空干燥)，得到丹酚酸A提取物最高含量为91.26％的方法。但以上专利文献中对丹酚酸A的破坏很大。成本极高，有机残留严重，极不易保存与使用。

综上所述，上述现有技术均存在实际生产过程中无法克服的缺陷。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明提供了一种丹参丹酚酸A制备方法。

本发明提供的一种丹参丹酚酸A制备方法，以丹参为原料，制备方法如下：

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～5mm颗粒，每次加3～15倍量、45～95℃水温浸提取，同时以10～50转/分速度搅拌，或加3～15倍量水煎煮提取，共提取1～3次，每次提取1～4小时；提取液减压浓缩至相对密度1.0～1.25(60℃)，加入乙醇使含醇量在50％～85％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～5mm颗粒，每次加3～15倍量30％～60％乙醇回流提取，每次提取1～4小时，共提取1～3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

将上述丹参提取液加水稀释至每1ml含丹酚酸B1～30mg，水溶液用碱调pH至3.5～6.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.1～3％的氯化锌作为催化剂，在100～140℃温度加热转化1～6小时；

转化液调pH值至2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A1～10mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶35～1∶70，树脂柱径高比为1∶4～1∶30，分别用1～8倍柱体积水、1～10倍柱体积10％～40％乙醇洗脱，除去杂质，再用2～10倍柱体积20％～60％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的20％～60％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1ml含1-10mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶25，分别用1～10倍柱体积水、5～20倍柱体积20％～60％乙醇溶液洗脱除杂，再用4～15倍柱体积40％～90％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的40％～90％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调酸pH至2.0～4.0，用水溶液1～8倍量的叔丁基甲基醚，分2～6次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A1g～10g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；

把搅拌样硅胶加到已装好的5～20倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶4～1∶25，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱6～30倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱6～30倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收后的丹酚酸A加5～20倍量水溶解，微波真空干燥，得丹酚酸A。

优选的，制备方法如下：

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～3mm颗粒，每次加5～12倍量、60～90℃水温浸提取，同时以15～40转/分速度搅拌，或加5～12倍量水煎煮提取，共提取2～3次，每次提取2～4小时；提取液减压浓缩至相对密度1.0～1.20(60℃)，加入乙醇使含醇量在60％～80％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～3mm颗粒，每次加5～12倍量40％～55％乙醇回流提取，每次提取2～4小时，共提取2～3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

将上述丹参提取液加水稀释至每1ml含丹酚酸B5～20mg，水溶液用碱调pH至3.5～5.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.2～2％的氯化锌作为催化剂，在100～140℃温度加热转化2～6小时；

转化液调pH值至 2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A2～6mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40～1∶60，树脂柱径高比为1∶4～1∶20，分别用1～5倍柱体积水、3～8倍柱体积15％～30％乙醇洗脱，除去杂质，再用2～6倍柱体积30％～50％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的30％～50％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1ml含3-7mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶7～1∶15，树脂柱径高比为1∶6～1∶15，分别用2～6倍柱体积水、8～18倍柱体积30％～50％乙醇溶液洗脱除杂，再用6～12倍柱体积50％～70％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的50％～70％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调酸pH至2.0～4.0，用水溶液2-5倍量的叔丁基甲基醚，分2～5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A3g～8g的萃取液，加入1～2倍量硅胶，搅拌，挥干；

把搅拌样硅胶加到已装好的7～15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶7～1∶15，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱12～25倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱12～25倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收后的丹酚酸A加8～15倍量水溶解，微波真空干燥，得丹酚酸A。

更优选的，制备方法如下：

取丹参药材，切成饮片，每次加8倍量、85℃水保温浸提取，同时以25转/分速度搅拌，共提取3次，每次提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.0～1.20(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

提取液加水稀释至每1ml含丹酚酸B10mg，水溶液用碱凋pH至3.5～4.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.5％的氯化锌作为催化剂，在110～140℃温度加热转化4小时；

转化液调pH值至 2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶8，分别用2倍柱体积水、5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调酸pH至2.5～3.0，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A5g的萃取液，加入1.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱20倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱20倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收后的丹酚酸A加10倍量水溶解，微波真空干燥，得丹酚酸A。

优选的，微波真空干燥温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。

优选的，微波真空干燥温度：50-85℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。

优选的，微波真空干燥温度：55-80℃，回差温度2-3℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率25-60KW，干燥120-140分钟。

优选的，其中所述的丹酚酸B、丹酚酸A采用高效液相检测，检测条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

检测波长286nm；流速1.0ml/min；柱温30℃；

理论塔板数按丹酚酸A计应不低于10000；

对照品溶液的制备精密称取丹酚酸A对照品10mg、丹酚酸B对照品10mg到100ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；

供试品溶液的制备：精密量取相当于10mg丹酚酸A及10mg丹酚酸B样品到100ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度，即得；

洗脱以甲醇为流动相A，以0.1-0.5％磷酸为流动相B，按下述条件进行梯度洗脱，运行60分钟；

0-10分钟时，甲醇的比例由30％升至40％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由70％降至60％；

10-30分钟时，甲醇的比例由40％升至55％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由50％降至45％；

30-60分钟时，甲醇的比例由55％升至80％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由45％降至20％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算丹酚酸B、丹酚酸A含量。

本发明经过系统的筛选和优化，首先比较确定了起始原料丹酚酸B的提取溶剂和提取方法，由于丹酚酸B水溶性较好，确定了采用水提取或低浓度醇提取，又由于丹酚酸B热稳定性较差，确定了采用热水温浸提取并加搅拌提取方法，或用低浓度乙醇回流提取，使提取溶度低于100℃，保持丹酚酸B不被破坏，通过正交实验确定了最佳溶剂用量和提取时间，得到了适应工业化生产的丹酚酸B最佳提取工艺的。

本发明与现有技术对比表明：起始原料用丹参药材直接提取即可进行投料转化，不需对丹酚酸B进行纯化后再进行转化，即本发明催化转化反应中，反应原料丹酚酸B不需要高纯度，例如不需要丹酚酸B的纯度≥50％。一般认为反应原料越纯越好，然而，本发明的催化转化反应中，丹酚酸B的纯度高低对转化反应效果没有影响。相反，丹酚酸B纯度＞50％时不但产生大量杂质，且没有提高转化率，因此，本发明取得了预料不到的技术效果。

另外，本发明还可以将低浓度与高浓度的丹酚酸B混合，只需配成合适的起始转化浓度即可，同样可以达到转化成丹酚酸A的目的。因此，这种转化原料的制备工艺非常简单，生产成本降低的同时也非常适于实际产业中的应用。

再者，本发明通过反复实验比较，首先确定了对丹酚酸A产率产生重要影响的因素如转化前丹酚酸类化合物的浓度、pH值、温度、时间等。在此基础上，又通过付出大量的时间、物质和精力反复实验对温度、pH值、时间、丹酚酸B的浓度及其他相关条件进行了研究，以及这些因素彼此之间如何协同作用共同对丹酚酸A产率产生影响，从而确定了丹酚酸B转化丹酚酸A的需要控制的最佳温度、pH值、时间等，并将丹酚酸B起始浓度控制在1mg/ml～30mg/ml，从而使得本发明丹酚酸A转化率更加明显优于其他转化条件。化学反应中，反应物的纯度与浓度常常影响反应的效果。一般情况下对反应物有浓度要求，且认为浓度高比浓度低好。本发明的催化转化反应中，丹酚酸B的浓度高低对转化反应效果没有影响。相反，实验证明含丹酚酸B水溶液中丹酚酸B的浓度并非越高越好，30mg/ml以上浓度转化率反而低，效果更差。因此，本发明在节约成本和生产周期方而，取得了预料不到的技术效果，具有创造性。在现有技术没有给出任何技术启示的情况下，本领域技术人员如果仅从理论上推断，是不可能得出在上述各条件参数下将丹酸B转化成丹酚酸A具有更好的转化效果的结论。

更为重要的是，本发明通过创造性的劳动，发现氯化锌作为催化剂能显著提高丹酚酸B转化丹酚酸A的转化率，转化率非常稳定的能达到接近60％，多数情况都可以超过60％，这在以往任何一项现有技术中都是不可能的，因此，取得了预料不到的技术效果。

由于丹酚酸A含量较低，经转化后丹酚酸A含量大提高，但还含大量杂质，因此，分别选择了弱极性和非极性大孔吸附树脂进行粗分离，再选择聚酰胺、溶剂萃取、硅胶分离，并对不同流份进行测定，去除杂质部分后，将丹酚酸A含量从10％左右提高到78％，至90％，至93％，至96％。

进一步，在显著提高转化率的同时，本发明通过适于实际产业应用的纯化步骤，尤其是通过一系列的分离、洗脱处理等步骤后，没有采用传统的减压干燥、真空干燥或冷冻干燥，而是采用微波真空干燥，从而彻底克服了以往干燥温度过高，干燥时间过长，以及冷冻干燥时间过长，成本极高且冷冻干燥所得的提取物过度蓬松，不易保存与使用以及对丹酚酸A的破坏大的缺陷。

综上所述，本发明提供了一种非常适合产业应用且生产成本较低的新的制备丹酚酸A的工艺方法。

附图说明

图1.丹酚酸B对照品高效液相色谱图；

图2.丹参提取液中丹酚酸B高效液相色谱图；

图3.丹酚酸A对照品高效液相色谱图；

图4.丹酚酸B催化转化液中丹酚酸A高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1

取丹参药材，粉碎成6目颗粒，每次加7倍量92℃水，温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.20(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B20mg，水溶液用10％氢氧化钠调pH至4.0，加入0.5％ZnCl₂作为催化剂，120℃温度加热转化4小时，转化液用20％磷酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶10，分别用3倍柱体积水、5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20％磷酸调pH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷∶叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱10倍柱体积，正戊烷∶叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱10倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50℃，回差温度4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW)130分钟，得丹酚酸A，测得含量为94.57％。

实施例2

取丹参药材，切成饮片，每次加8倍量85℃水温浸提取3次，同时以20转/分速度搅拌，每次温浸提取2.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.20(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B15mg，水溶液用10％氢氧化钾调pH至4.0，加入0.6％ZnCl₂作为催化剂，在120℃温度加热转化3.5小时，转化液用15％盐酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶45，树脂柱径高比为1∶8，分别用3.5倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶9，树脂柱径高比为1∶7，分别

用4倍柱体积水、10倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用15％盐酸调pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.8g的萃取液，加入2～3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的13倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度55℃，回差温度4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率50KW)120分钟，得丹酚酸A，测得含量为96.79％。

实施例3

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量85℃水温浸提取2次，同时以30转/分速度搅拌，每次温浸提取3.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.15(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B18mg，水溶液用10％碳酸钠调pH至4.2，加入0.6％ZnCl₂作为催化剂，在123℃温度加热转化4.5小时，转化液用15％硝酸调pH值至2.8，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A6mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶8，树脂柱径高比为1∶8，分别用4倍柱体积水、9倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用7倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％硝酸调pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收乙酸甲酯，制成每1ml含丹酚酸A0.7g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶7，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱9倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度45℃，回差温度5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率80KW)150分钟，得丹酚酸A，测得含量为96.13％。

实施例4

取丹参药材，切成饮片，每次加10倍量80℃水温浸提取3次，同时以15转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.12(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B20mg，水溶液用10％碳酸氢钠调pH至5.4，加入0.8％ZnCl₂作为催化剂，在128℃温度加热转化4.0小时，转化液用20％硫酸调pH值至2.6，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶15，分别用4倍柱体积水、7倍柱体积35％乙醇溶液洗脱除杂，再用6倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用20％硫酸调pH至2.8，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的9倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度70℃，回差温度2℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率25KW)100分钟，得丹酚酸A，测得含量为95.95％。

实施例5

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量85℃水温浸提取3次，同时以20转/分速度搅拌，每次温浸提取2.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.25(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B10mg，水溶液用20％柠檬酸钠调pH至5.5，加入0.4％ZnCl₂作为催化剂，在132℃温度加热转化3.5小时，转化液用20％醋酸调pH值至2.6，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶35，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、4.5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含8mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶12，树脂柱径高孔比为1∶18，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30％乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20％醋酸调pH至2.7，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度80℃，回差温度3℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率30KW)110分钟，得丹酚酸A，测得含量为96.77％。

实施例6

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量88℃水温浸提取3次，同时以22转/分速度搅拌，每次温浸提取3.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.23(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B13mg，水溶液用10％氢氧化钠调pH至5.6，加入0.5％ZnCl₂作为催化剂，在133℃温度加热转化4.5小时，转化液用10％盐酸调pH值至2.7，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶9，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积22％乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积43％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的43％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含10mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶15，树脂柱径高比为1∶20，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30％乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用10％盐酸调pH至2.8，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的12倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱6倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱7倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度55℃，回差温度3℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率50KW)140分钟，得丹酚酸A，测得含量为96.28％。

实施例7

取丹参药材，切成饮片，每次加9倍量90℃水温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.20(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B20mg，水溶液用10％碳酸钠调pH至5.0，加入1.0％ZnCl₂作为催化剂，在135℃温度加热转化4.5小时，转化液用15％硫酸调pH值至3.0，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶36，树脂柱径高比为1∶9，分别用3倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每1ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶10，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积45％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％硫酸调pH至2.7，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹粉酸A0.6g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50℃，回差温度3℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10KW)130分钟，得丹酚酸A，测得含量为96.47％。

实施例8

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量85℃水温浸提取3次，同时以22转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.22(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B25mg，水溶液用10％柠檬酸钠调pH至4.2，加入0.4％ZnCl₂作为催化剂，在133℃温度加热转化4.5小时，转化液用10％盐酸调pH值至2.8，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶45，树脂柱径高比为1∶10，分别用5倍柱体积水、6倍柱体积20％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每1ml含8mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶12，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、6倍柱体积45％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积55％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的55％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％盐酸调pH至2.9，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.6g的萃取液，加入2.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的12倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加9倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度85℃，回差温度5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW)120分钟，得丹酚酸A，测得含量为95.62％。

实验例1：丹参丹酚酸B的提取

1.1提取溶剂及提取方法的确认

称取丹参药材400g，按中国药典丹参项下方法测定丹酚酸B含量，平均分成4份，按下述试验方案进行试验：

实验1：取丹参药材100g，每次加8倍量水在80℃温浸提取1.5小时，共温浸提取三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表1。

实验2：取丹参药材100g，每次加8倍量水在80℃温浸提取1.5小时，同时以10～50转/分速度搅拌，共温浸搅拌提取三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表1。

实验3：取丹参药材100g，每次加8倍量水煎煮1.5小时，共煎煮三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表1。

实验4：取丹参药材100g，每次加8倍量50％乙醇回流提取1.5小时，共提取三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表1。

表1.提取溶剂及提取方法实验结果

上述实验结果显示，采用50％乙醇做提取溶剂对丹酚酸B提取率有影响，50％乙醇提取优于水提取，但与水温浸加搅拌提取差异不大，水提取过程中搅拌和不搅拌的两种提取方式对丹酚酸B的提取率有影响，煎煮提取可能是由于温度较高，对丹酚酸B提取有影响。

1.2正交试验法优选提取工艺

1.2.1水提取工艺的优化研究：根据以上的试验结果，水提取工艺以提取时间(A)、提取次数(B)、溶剂量(C)、提取温度(D)四项作为考察因素，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行正交试验设计(表2、表3)，考察指标为丹酚酸B的提取率。

表2.提取因素水平表

表3.提取工艺正交试验结果表

表4.方差分析结果表

F_0.05(2，2)＝19.00　　　　F_0.01(2，2)＝99.00

水提取方差分析结果表明，各试验因素对丹酚酸B的提取转移率均无显著性差异，故本发明丹酚酸B的水提取条件为加3～15倍量水、在45～95℃下温浸提取1～3次，同时以10～50转/分速度搅拌，每次提取1～4小时或者每次加3～15倍量煎煮提取，每次提取1～4小时，共提取1～3次。

1.2.2醇提取工艺的优化研究：根据以上的试验结果，醇提取工艺以提取时间(A)、提取次数(B)、溶剂量(C)、乙醇浓度(D)四项作为考察因素，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行正交试验设计(表5、表6)，考察指标为丹酚酸B的提取率。

表5.提取因素水平表

表6.提取工艺正交试验结果表

表7.方差分析结果表

F_0.05(2，2)＝19.00　　　　F_0.01(2，2)＝99.00

醇回流提取方差分析结果表明，各试验因素对丹酚酸B的提取转移率均无显著性差异，故本丹酚酸B的提取条件为加3～15倍量30％～60％乙醇回流提取1～3次，每次提取1～4小时。

1.3丹酚酸B原料制备

根据上述正交实验优化工艺，取丹参药材10kg，每次加8倍量水在80℃温浸提取1.5小时，同时以10～50转/分速度搅拌，共温浸搅拌提取3次，滤过，合并滤液，提取液减压浓缩至相对密度1.10～1.25(60℃)，加入乙醇使含醇量在60％，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，真空干燥、得丹酚酸提取物4.15kg，测得丹酚酸B含量为10.25％。

实验例2：丹酚酸B转化丹酚酸A工艺比较

实验1：取上述1.3制备获得的丹酚酸B原料约30g，配制成200ml溶液，加10％氢氧化钠溶液调pH值至4.5；

实验2：取上述1.3制备获得的丹酚酸B原料约30g，配制成200ml溶液，加10％氢氧化钠溶液调pH值至4.5，加1.0％ZnCl₂；

实验3：取含丹酚酸B(含量51.54％)原料约6g，加纯化水稀释至丹酚酸B浓度为15mg/ml溶液，加尿素，使之与丹酚酸B的摩尔比为0.5；

上述各实验组置于同一高压反应釜中，在120℃下反应4.0小时，冷却，计算丹酚酸A产率。

表8.丹酚酸B转化丹酚酸A实验结果

表8结果显示，丹酚酸B高纯度对转化没有影响，不需要纯化至50％以上进行转化，丹酚酸B转化为丹酚酸A过程中，调节pH值，加入1.0％ZnCl₂，可以大大提高丹酚酸A的产率。

实验例3：丹酚酸B转化丹酚酸A工艺优化

上述实验研究证明，丹酚酸B纯度不是影响丹酚酸B转化丹酚酸A的因素，但加入一定的催化剂影响丹酚酸B转化丹酚酸A，因此，我们对各实验组均加入1％ZnCl₂作为催化剂，对影响丹酚酸B转化为丹酚酸A的其他因素：丹酚酸B浓度(A)、pH(B)、温度(C)、时间(D)进行正交试验，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行试验设计(表9、表10)，考察指标为丹酚酸A的产率。

表9.转化因素水平表

表10.转化工艺正交试验结果表

表11.方差分析结果表

*F_0.05(2，2)＝19.00　　　　△F_0.01(2，2)＝99.00

方差分析结果显示，对本次正交试验按照直观分析优选出的最佳条件是A₃B₂C₂D₂，因素A(丹酚酸B浓度)对丹酚酸A产率有一定影响，从K值分析，浓度高于30mg/ml对提高丹酚酸B转化为丹酚酸A的效果没有影响，而且形成的杂质更多，因此，转化前丹酚酸B浓度宜选择1～30mg/ml；低浓度转化效果稍差，但差别不大；因素B(pH)、因素C(温度)对丹酚酸A产率有极显著性差异，提示丹酚酸B转化过程中应严格控制pH及温度，可以成功的实现丹酚酸B较高产率的向丹酚酸A转化。

实验例4：催化剂ZnCl₂用量对转化的影响

按上述丹酚酸B转化丹酚酸A工艺优化条件，取丹酚酸B原料，加纯化水200ml，制成丹酚酸B浓度为15mg/ml的溶液，调节pH为4.5，转化温度为120℃，转化时间为4小时，按与丹酚酸B摩尔百分比计，分别加入不同量的催化剂ZnCl₂，结果见表12。

表12.催化剂ZnCl₂用量对转化影响实验结果

催化剂ZnCl₂用量对转化影响实验结果表明，催化剂用量≥0.02％即可产生55.65％转化率，优选催化剂用量0.1％～3.0％，更优选0.5％～2.0％.催化剂用量＞3％后，转化率不再有明显提高。

实验例5：催化剂对丹酚酸B转化丹酚酸A的催化作用

按上述丹酚酸B转化丹酚酸A工艺优化条件，取丹酚酸B原料，加纯化水200ml，制成丹酚酸B浓度为15mg/ml的溶液，调节pH为4.5，转化温度为120℃，转化时间为4小时，分别加入不同品种和不同剂量的催化剂进行转化，结果见表13。

表13.不同催化剂对丹B转化丹A的影响

表13结果显示，以上4种催化剂均可以作为丹酚酸B转化反应中的催化剂，且各催化剂用量与丹酚酸B摩尔百分比为0.5％～3.0％，丹酚酸A产率≥40％。转化率超过60％，但综合评定，采用ZnCl₂最优。

实验例6：丹酚酸A的大孔吸附树脂纯化

取丹酚酸A转化溶液13份，置预处理好的各型号大孔树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，依次用水洗洗脱3个柱体积、20％乙醇洗脱5个柱体积、70％乙醇洗脱5个柱体积，收集70％乙醇含丹酚酸A洗脱液部分，进行丹酚酸A含量测定，洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表14。

表14.大孔树脂型号的确认

结果表明：以上13种大孔树脂对丹酚酸A的吸附效果良好，且用不同浓度的乙醇梯度洗脱可以很好的去除杂质，得到含量大于75％的丹酚酸A洗脱液，以HPD-100得干膏量最大，丹酚酸A含量高，树脂吸附量大。

实验例7：丹酚酸A的聚酰胺柱层析纯化

取大孔吸附树脂色谱纯化后的丹酚酸A溶液3份，置预处理好的各型号树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，依次用水洗洗脱3个柱体积、20％乙醇洗脱5个柱体积、70％乙醇洗脱5个柱体积，收集70％乙醇洗脱液进行丹酚酸A含量测定，部分洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表15。

表15.树脂型号的确认

结果表明：以上3种树脂中聚酰胺对丹酚酸A的吸附效果最好，且用不同浓度的乙醇梯度洗脱可以很好的去除杂质，得到含量约为90％的丹酚酸A洗脱液；以聚酰胺得干膏量最多，含量高吸附量大。

实验例8：丹酚酸A的萃取纯化

将聚酰胺纯化的70％乙醇洗脱液减压回收乙醇，调pH值2.0～4.0，再用正丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、乙醇提取5次，分离有机溶剂相，回收溶剂，干燥，得丹酚酸A提取物，测定丹酚酸A含量，结果见表16。

表16.萃取用有机溶剂的确认

表16结果表明：正丁醇由于极性大，丹酚酸A提取物量最多，但其丹酚酸含量没得到明显提高，乙醚由于极性偏小，水溶性杂质少，丹酚酸A含量高，但得到的丹酚酸A提取物量少，其他提取溶剂叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯得到的丹酚酸A提取物量较大，丹酚酸A含量均得到提高；以叔丁基甲基醚得提取物多、丹酚酸A含量高。

实验例9：丹酚酸A的硅胶柱层析纯化

取萃取纯化的丹酚酸A萃取液12份，每份含丹酚酸A10g，加入20g的硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的100g干硅胶柱上，分别以石油醚、正戊烷、正庚烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚组成的两相溶剂为洗脱剂，HPLC或薄层色谱检测，收集丹酚酸A洗脱液，洗脱液蒸干，得干膏，测定丹酚酸A含量，结果见表17。

表17.洗脱剂的确认

结果表明：丹酚酸A用正相硅胶柱色谱时，采用正戊烷-叔丁基甲基醚组成的两相溶剂为洗脱剂，梯度洗脱，可以很好的去除杂质，得到高纯度的丹酚酸A洗脱液。

实验例10：丹酚酸A干燥方法研究

取硅胶层析后的丹酚酸A洗脱液4份，每份含丹酚酸A100g，浓缩至无稠膏状，加10倍量水溶解后分别采用冷冻真空干燥、喷雾干燥、微波真空干燥得打丹酚酸A提取物，对该提取物进行检测，结果见表18。

表18.丹酚酸A原料检测结果

结果表明：采用冷冻真空干燥时间过长，成本过高，且有机溶剂残留严重；真空干燥时间略长，喷雾干燥时间短但瞬间温度较高；微波真空干燥干燥温度低，时间短，所得丹酚酸A各项指标良好。

经过进一步的实验确定，微波真空干燥适宜范围为温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。

实验例11：丹酚酸B、丹酚酸A检测分析方法研究

1.仪器与试药

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪，Empower2色谱工作站，2998二极管阵列检测器；Sartorius cp225D十万分之一电子天平。

色谱柱：YMC C₁₈色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

试剂：甲醇为色谱纯，水为Millipore制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。

丹酚酸B对照品(批号111562-201009)均购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用；丹酚酸A对照品为自制，经纯度标化含量为99.52％。

2.对照品溶液及供试品溶液的制备

2.1对照品溶液的制备：分别精密称取丹酚酸B、丹酚酸A对照品约10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；再分别精密吸取上述各1ml，置同一10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备精密称取实施例1样品(约相当于丹酚酸A10mg)以及上述“实验例1中1.3丹酚酸B原料制备”获得样品(约相当于丹酚酸B10mg)，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；检测波长：取混合对照品溶液，进行紫外扫描，结果在286nm波长处有最大吸收，故确定检测波长为286nm；柱温30℃；理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于10000。

0-10分钟时，甲醇的比例由30％升至40％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由70％降至60％；10-30分钟时，甲醇的比例由40％升至55％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由50％降至45％；30-60分钟时，甲醇的比例由55％升至80％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由45％降至20％。

在上述条件下，丹酚酸A、丹酚酸B对照品和丹参提取液、丹酚酸催化转化液的色谱峰保留时间见表19，HPLC图谱见图1、图2、图3、图4。

表19.各对照品的色谱峰保留时间结果

4、线性关系的考察

精密吸取上述混合对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释成以下浓度约为：0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml的系列标准溶液。精密吸取上述标准溶液各10μl注入液相色谱仪，按“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件计算峰面积，分别以峰面积积分值为纵坐标，各浓度对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果表明混合对照品溶液在如下范围内成良好的线性关系，见表20。

表20.混合对照品溶液线性关系结果

5.精密度试验

取混合对照品溶液，照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件测定，重复进样6次。结果表明该方法的精密度良好，见表21。

表21.精密度试验结果

6.稳定性试验

取供试品溶液，照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件测定，每隔一定时间进样一次，结果供试品溶液中各成分在24小时内峰面积无明显变化，表明供试品溶液的稳定性良好，见表22。

表22.稳定性试验结果

7.重复性试验

取本丹酚酸A原料，加甲醇制成供试品溶液6份，照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件测定。结果表明该方法重复性良好，见表23。

表23.重复性试验结果

8.回收率试验

采用加样回收试验，取已知含量的丹酚酸A原料10mg，精密称定，平行6份，分别按各组分含量-对照品(1∶1)的比例加入一定量的对照品溶液，按2.3项下方法制备供试品溶液，测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果表明该方法的准确度良好，见表24。

表24回收率试验结果

Claims (7)

1.一种丹参丹酚酸A制备方法，其特征在于以丹参为原料，制备方法如下：

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～5mm颗粒，每次加3～15倍量、45～95℃水温浸提取，同时以10～50转/分速度搅拌，或加3～15倍量水煎煮提取，共提取1～3次，每次提取1～4小时；提取液减压浓缩至相对密度在60℃测定为1.0～1.25，加入乙醇使含醇量在50％～85％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～5mm颗粒，每次加3～15倍量30％～60％乙醇回流提取，每次提取1～4小时，共提取1～3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

将上述丹参提取液加水稀释至每1mL含丹酚酸B1～30mg，水溶液用碱调pH至3.5～6.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.1～3％的氯化锌作为催化剂，在100～140℃温度加热转化1～6小时；

转化液用酸调pH值至2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1mL含丹酚酸A1～10mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶35～1∶70，树脂柱径高比为1∶4～1∶30，分别用1～8倍柱体积水、1～10倍柱体积10％～40％乙醇洗脱，除去杂质，再用2～10倍柱体积20％～60％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的20％～60％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1mL含1-10mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶25，分别用1～10倍柱体积水、5～20倍柱体积20％～60％乙醇溶液洗脱除杂，再用4～15倍柱体积40％～90％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的40％～90％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调酸pH至2.0～4.0，用水溶液1～8倍量的叔丁基甲基醚，分2～6次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1mL含丹酚酸A1g～10g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；

把搅拌样硅胶加到已装好的5～20倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶4～1∶25，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用4∶6的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱6～30倍柱体积，6∶4的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱6～30倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收后的丹酚酸A加5～20倍量水溶解，微波真空干燥，得丹酚酸A。

2.如权利要求1所述的一种丹参丹酚酸A制备方法，其特征在于以丹参为原料，制备方法如下：

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～3mm颗粒，每次加5～12倍量、60～90℃水温浸提取，同时以15～40转/分速度搅拌，或加5～12倍量水煎煮提取，共提取2～3次，每次提取2～4小时；提取液减压浓缩至相对密度在60℃测定为1.0～1.20，加入乙醇使含醇量在60％～80％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～3mm颗粒，每次加5～12倍量40％～55％乙醇回流提取，每次提取2～4小时，共提取2～3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

将上述丹参提取液加水稀释至每1mL含丹酚酸B5～20mg，水溶液用碱调pH至3.5～5.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.2～2％的氯化锌作为催化剂，在100～140℃温度加热转化2～6小时；

转化液调pH值至2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1mL含丹酚酸A2～6mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40～1∶60，树脂柱径高比为1∶4～1∶20，分别用1～5倍柱体积水、3～8倍柱体积15％～30％乙醇洗脱，除去杂质，再用2～6倍柱体积30％～50％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的30％～50％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1mL含3-7mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶7～1∶15，树脂柱径高比为1∶6～1∶15，分别用2～6倍柱体积水、8～18倍柱体积30％～50％乙醇溶液洗脱除杂，再用6～12倍柱体积50％～70％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的50％～70％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调pH至2.0～4.0，用水溶液2-5倍量的叔丁基甲基醚，分2～5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1mL含丹酚酸A3g～8g的萃取液，加入1～2倍量硅胶，搅拌，挥干；

把搅拌样硅胶加到已装好的7～15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶7～1∶15，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用4∶6的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱12～25倍柱体积，6∶4的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱12～25倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收后的丹酚酸A加8～15倍量水溶解，微波真空干燥，得丹酚酸A。

3.如权利要求2所述的一种丹参丹酚酸A制备方法，其特征在于以丹参为原料，制备方法如下：

取丹参药材，切成饮片，每次加8倍量、85℃水保温浸提取，同时以25转/分速度搅拌，共提取3次，每次提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度在60℃测定为1.0～1.20，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

提取液加水稀释至每1mL含丹酚酸B10mg，水溶液用碱调pH至3.5～4.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.5％的氯化锌作为催化剂，在110～140℃温度加热转化4小时；

转化液调pH值至2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1mL含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶8，分别用2倍柱体积水、5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1mL含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调酸pH至2.5～3.0，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1mL含丹酚酸A5g的萃取液，加入1.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用4∶6的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱20倍柱体积，6∶4的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱20倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收后的丹酚酸A加10倍量水溶解，微波真空干燥，得丹酚酸A。

4.根据权利要求1～3任一项所述的一种丹酚酸A制备方法，其特征在于微波真空干燥温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07MPa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。

5.根据权利要求4所述的一种丹酚酸A制备方法，其特征在于微波真空干燥温度：50-85℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07MPa以上，微波功率10－80KW，干燥100-150分钟。

6.根据权利要求5所述的一种丹酚酸A制备方法，其特征在于微波真空干燥温度：55-80℃，回差温度2-3℃，真空度-0.07MPa以上，微波功率25-60KW，干燥120－140分钟。

7.根据权利要求1～3任一项所述的丹酚酸A制备方法，其中所述的丹酚酸B、丹酚酸A采用高效液相色谱法检测，检测条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

检测波长286nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；

理论塔板数按丹酚酸A计应不低于10000；

对照品溶液的制备  精密称取丹酚酸A对照品10mg、丹酚酸B对照品10mg到100mL容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；

供试品溶液的制备：精密量称取10mg相当于丹酚酸A及10丹酚酸B样品到100mL容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度，即得；

洗脱 以甲醇为流动相A，以0.1-0.5％磷酸为流动相B，按下述条件进行梯度洗脱，运行60分钟；

0-10分钟时，甲醇的比例由30％升至40％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由70％降至60％；

10-30分钟时，甲醇的比例由40％升至55％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由50％降至45％；

30-60分钟时，甲醇的比例由55％升至80％，0.1-0.5％磷酸水溶液的比例由45％降至20％；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算丹酚酸B、丹酚酸A含量。