CN106831365A - 一种羟基甲氧基取代联苯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羟基甲氧基取代联苯类化合物及其制备方法和应用，所述的联苯类化合物分子式为C13H12O4，该化合物命名为 [1,1’‑biphenyl]‑3‑methoxy‑4,4’,5‑triol，具有下述结构式：所述制备方法是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离步骤。所述的应用为联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。经抗轮状病毒活性实验，选用病毒唑作为对照，[1,1’‑biphenyl]‑3‑methoxy‑4,4’,5‑triol对轮状病毒的 CC50和 EC50值分别为 185.5 和 12.6 μmol/L，其具有较好的抗轮状病毒活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗轮状病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。

Description

一种羟基甲氧基取代联苯类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种羟基甲氧基取代联苯类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
藤黄科(Garcinia L.)植物全球约 450 种，产亚洲、非洲南部及波利尼西亚西部，我国有 21 种，分布于广东、广西、云南等南部省区。藤黄科植物还是天然呫吨酮（xanthones）类成分的主要资源之一，富含异戊烯基取代的呫吨酮（xanthones），这类成分结构新颖多样，且具有广泛的药理活性，尤以藤黄酸(gambogic acid)最具代表性，具有广谱强效的抗肿瘤活性，是近年来抗肿瘤天然产物的研究热点之一，我国学者正在开发其注射液为抗肿瘤一类新药。除呫吨酮（xanthone）类外，苯甲酮类(benzophenones)、双黄酮类(bioflavonoids)和联苯类(biphenyls)等化合物也是本科植物的特征性成分，也具有多种生物活性。为了更有效地利用我国藤黄科植物资源，从中寻找具有开发前景的活性成分，我们选择对藤黄科植物开展较系统的活性成分研究工作。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种联苯类化合物；第二目的在于提供所述联苯类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的联苯类化合物是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C13H12O4，命名为[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，具有下述结构式：
。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的联苯类化合物的制备方法，是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将藤黄科乔木枝条、叶或果实粗粉碎到 20~40 目，用有机溶剂超声提取2~4 次，每次 40~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏 a 中加入重量比 1~2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取 3~5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5~2.5 倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的100~200目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200~300目，用量为浸膏 b 重量6~8 倍量；用体积比为 1:0~0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 4:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-8、C-18、ODS或MCI装柱；用体积含量为 20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量 45~75% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70% 的甲醇为流动相，流速10~14 mL/min，21.2´ 250 mm，5 mm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 45~60 mL，收集 15~35min的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的联苯类化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
本发明联苯类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和其他波谱技术测定方法确定为联苯类化合物，并表征其具体结构为：
化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，为橙黄色胶状物；紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max（log e）：568 (1.79), 270 (3.43), 206 (3.80)nm；红外光谱（溴化钾压片）n max 3 409, 1 612, 1 508, 1 464, 1 440, 1 317, 1 251, 1 204, 1 177, 1 104,962, 821, 663, 590, 540, 525 cm–1； HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰 m/z232.0731 [M]+（计算值为232.0736），结合13C和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见图3）给出其分子式为 C13H12O4。1H NMR（CD3OD，500 MHz）和13C NMR（CD3OD，125 MHz）数据，见图3。
HRESIMS显示其准分子离子峰为 232.0731 [M]+，结合13C NMR谱确定分子式为C13H12O4。红外吸收光谱在 3409 cm-1表明羟基的存在。13C NMR（表 1）和 DEPT谱显示 13 个碳信号,其中包括 1 个甲氧基、 6 个次甲基、 6 个芳香碳。1H-NMR 数据显示有两个间位芳香质子信号 [δ H 6.64 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2) 和 6.65 (1H, d, J =1.9 Hz, H-6)] 和一个对二取代的苯环质子信号 [δ H 7.35 (2H, d, J =8.5 Hz, H-2’, H-6’) 和6.80 (2H, d, J =8.5 Hz, H-3’, H-5’)],表明它是一个联苯结构。在 HMBC中，根据甲氧基的氢在 δ H 3.87 (J =10.8, 5.6 Hz) 和 C-3（δ C 149.9）相关，可证实甲氧基取代在C-3。在HMBC中，H-2 和 H-6 与 C-1’ 相关，H-2’ 和 H-6’ 与C-1相关，也证实了联苯结构。根据碳信号为季碳的 C-4, C-5, C-4’ 和它的分子式，三个羟基分别位于 C-4、C-5 和 C-4’。因此，化合物 1 的结构如图 1 所示,并将其命名为 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。经抗轮状病毒活性实验，选用病毒唑作为对照，[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol对轮状病毒的 CC50和 EC50值分别为185.5 和 12.6 μmol/L，其具有较好的抗轮状病毒活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗轮状病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
附图说明
图 1 为化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol的核磁共振碳谱（13CNMR）。
图 2 为化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol的核磁共振氢谱（1HNMR）。
图3 为化合物的1H和13C NMR数据归属（溶剂为CD3OD）(125 and 500 MHz)。
图4为化合物的抗轮状病毒活性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的联苯类化合物是以干燥的藤黄科乔木的枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C13H12O4，命名为[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，具有下述结构式：
。
本发明所述的联苯类化合物的制备方法，其特征在于是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将藤黄科乔木枝条、叶或果实粗粉碎到 20~40 目，用有机溶剂超声提取2~4 次，每次 30~60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏 a；
B、有机溶剂萃取：浸膏 a 中加入重量比 1~2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取 3~5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏 b；
C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重 0.8~1.2 倍的 100~200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200~300 目，用量为浸膏 b 重量 6~8 倍量；用体积比为 1:0~0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC 监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 9:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C-18 装柱；用体积含量为 20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量 45~75% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以 50~70% 的甲醇为流动相，流速10~14 mL/min，21.2´ 250 mm，5 mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 45~60 mL，收集 15~35 min的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol；
A步骤所述的有机溶剂为 70~100% 的丙酮、乙醇或甲醇；
B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯；
C步骤所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；
C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1；
本发明所述的联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用；
本发明所述的藤黄科植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
实施例1
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实 5.8 kg，粗粉碎至 40 目，用 70% 的丙酮超声提取 4 次，每次 60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成 368 g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 500g 水，用与水等体积的氯仿萃取 5 次，合并萃取相，减压浓缩成 247 g 浸膏 b；用 200 目硅胶 1600g 装柱，在浸膏 b 中加入600g 的丙酮溶解，然后加入 100 目硅胶 250g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1 的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比 9:1 的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液 c 为 63 g；用反相材料 C-18 装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以60%的甲醇为流动相，流速10mL/min，21.2´250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50mL，收集18min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例2
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实3 kg，粗粉碎至20目，用100% 的乙醇超声提取2次，每次60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/3；静置，滤除沉淀物，浓缩成276 g浸膏a；在浸膏a中加入460 g的水，用与水等体积的氯仿萃取 3次，合并萃取相，减压浓缩成158 g浸膏b；用100~200目硅胶1200 g装柱，在浸膏b中加入320g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶160 g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的正己烷-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为73 g；用反相材料C-8装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以68% 的甲醇为流动相，流速14 mL/min，21.2´250 mm，5 mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45 mL，收集27 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例3
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实6 kg，粗粉碎至30目，用80%的甲醇超声提取4次，每次30 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成532 g浸膏a；在浸膏a中加入700g的水，用与水等体积的乙醚萃取4次，合并萃取相，减压浓缩成392g浸膏b；用180目硅胶 2900g 装柱，在浸膏b中加入600g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶 400 g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为45 g；用反相材料ODS装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以55%的甲醇为流动相，流速12 mL/min，21.2 ´ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50 mL，收集23 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例4
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实5.3 kg，粗粉碎至40目，用90% 的乙醇超声提取3次，每次45 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成473 g浸膏a；在浸膏a中加入780 g的水，用与水等体积的石油醚萃取4次，合并萃取相，减压浓缩成265g 浸膏b；用160目硅胶1450 g装柱，在浸膏b中加入390 g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶265g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为52 g；用反相材料MCI装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70 % 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以70% 的甲醇为流动相，流速10 mL/min，21.2 ´ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，收集17 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例5
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实10 kg，粗粉碎至20目，用70%的甲醇超声提取4次，每次35 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成879g浸膏a；在浸膏a中加入1700g的水，用与水等体积的苯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成445g浸膏b；用200目硅胶3330 g装柱，在浸膏b中加入900 g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶580g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液c为105 g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以50%的甲醇为流动相，流速12 mL/min，21.2 ´250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，收集36 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例6
取干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实8.1 kg，粗粉碎至20目，用100%的丙酮超声提取4次，每次30 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成638g浸膏a；在浸膏a中加入1200g的水，用与水等体积的苯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成362g浸膏b；用200目硅胶2400 g装柱，在浸膏b中加入500 g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶400g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液c为87 g；用反相材料ODS装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以62%的甲醇为流动相，流速12 mL/min，21.2 ´250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，收集27 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例7
取实施例1制备的化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，为橙黄色胶状物；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构：
（1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max（log e）：568 (1.79), 270 (3.43), 206 (3.80) nm；
（2）红外光谱（溴化钾压片）3409, 1612, 1508, 1464, 1440, 1317, 1251, 1204,1177, 1104, 962, 821, 663, 590, 540, 525 cm–1；
（3）HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 232.0731 [M]+（计算值为232.0736），结合13C 和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见图3）给出其分子式为C13H12O4。1H NMR（CD3OD，500 MHz）和13C NMR（CD3OD，125 MHz）数据，见图3。
HRESIMS显示其准分子离子峰为232.0731 [M]+，结合13C NMR谱确定分子式为C13H12O4。红外吸收光谱在3409 cm-1 表明羟基的存在。13C NMR（图1）和 DEPT谱显示13个碳信号,其中包括1个甲氧基、6个次甲基、6个芳香碳。1H-NMR 数据显示有两个间位芳香质子信号[δ H 6.64 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2) 和 6.65 (1H, d, J =1.9 Hz, H-6)] 和一个对二取代的苯环质子信号[δ H 7.35 (2H, d, J =8.5 Hz, H-2’, H-6’) 和 6.80 (2H, d,J =8.5 Hz, H-3’, H-5’)],表明它是一个联苯结构。在 HMBC中，根据甲氧基的氢在 δ H3.87 (J =10.8, 5.6 Hz) 和 C-3（δ C 149.9）相关，可证实甲氧基取代在C-3。在HMBC中，H-2 和 H-6 与 C-1’ 相关，H-2’ 和 H-6’ 与C-1相关，也证实了联苯结构。根据碳信号为季碳的C-4, C-5, C-4’和它的分子式，三个羟基分别位于C-4、C-5和C-4’。因此，化合物1的结构如图1所示,并将其命名为 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例8
取实施例2制备的化合物，为橙黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C13H12O4。确认实施例2制备的化合物为所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
化合物的1H和13C NMR数据归属见图3所示。
实施例9
取实施例3制备的化合物，为橙黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C13H12O4。确认实施例3制备的化合物为所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例10
取实施例4制备的化合物，为橙黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C13H12O4。确认实施例4制备的化合物为所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
实施例11
取实施例1~6所制备的任一联苯类化合物进行细胞毒活性检测试验，试验情况如下：
细胞株：恒河猴肾细胞系(MA-104)
实验设计: MA-104细胞与不同浓度化合物温育72小时, 每株细胞的实验均重复一次,用两次实验的结果进行数据处理, 采用改良MTT 法评价化合物对细胞增殖的抑制程度,计算抑制率, 根据抑制率采用Logit方法计算IC50, 比较化合物的体外抗肿瘤活性。
EC50 即指半数有效浓度，是指引起50％ 试验动物产生某一特定反应，或是某反应指标被抑制一半时的浓度。
CC50 即指半数细胞毒性浓度，是指对半数细胞产生毒性作用所需浓度。在本实验中，指致50％ 细胞死亡所需的药物浓度。
化合物细胞毒性测定
化合物用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶解，于微波消毒 10 min，用 MEM配成 l mg/mL 的母液备用，MEM 溶液稀释成所需浓度。96 孔细胞培养板，加 l × 105 /mL 浓度的 MA-104 细胞悬液，100 ul/孔，37℃、5% CO2 孵箱培养 24h，在生长良好的单层细胞上分别加入浓度分别为 l mg/mL、0.2 mg/mL、40 ug/mL、8 ug/mL、1.25 ug/mL 的化合物;100 ul/孔，每个浓度设 3 个复孔，同时设正常细胞对照。置于 37℃，5% CO2 孵箱继续培养 24h 后，MTT 法检测细胞存活率。
化合物对病毒感染预防作用
以浓度为 104/mL，每孔 l00ul 接种细胞于 96 孔板中，培养 24 小时，见细胞长成单层并生长状况良好，用浓度分别为 100 ug/mL、75 ug/mL、50 ug/mL、25 ug/mL、l ug/mL 的化合物在 37℃ 孵箱预先作用细胞 1.5 h，PBS 洗涤后以100TCID 50/mL 的轮状病毒每孔100ul 吸附 1h 后弃去，加 MEM 培养基 100 ul/孔 维持，置 37℃、5% CO2 孵箱，每日观察细胞病变情况。48h 后以 MTT 法检测病毒抑制率。
细胞存活率测定
采用 MTT 法，在培养 48h 的细胞中加入 5mg/mL 甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT) 20 ul，继续培养 3-4 h，弃上清，加入 DMSO 每孔 100 ul，振荡使孔内结晶完全溶解后立即在 490 nm 波长下测定吸光度 A 值：
细胞存活率=药物组平均 A 值/细胞对照组 A 值× 100%
病毒抑制率=[实验组平均 A 值一病毒对照组平均A值]/[细胞对照组平均A 值一病毒对照组平均 A 值] × 100%
治疗指数(TI)=半数毒性浓度(CC50)/半数抑制浓度(IC50)。
实验结果
实验结果表明：经抗轮状病毒活性实验，选用病毒唑作为对照，[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol对轮状病毒的 CC50和 EC50值分别为 185.5 和 12.6 μmol/L，其具有较好的抗轮状病毒活性（如图4所示）。

Claims (7)

1.一种羟基甲氧基取代联苯类化合物，其特征是：所述的联苯类化合物是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离得到的，该化合物分子式为 C13H12O4，命名为[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，具有下述结构式：
。
2. 一种权利要求 1 所述的联苯类化合物的制备方法，其特征在于是以干燥的藤黄科乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将藤黄科乔木枝条、叶或果实粗粉碎到 20~40 目，用有机溶剂超声提取2~4 次，每次 30~60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏 a ；
B、有机溶剂萃取：浸膏 a 中加入重量比 1~2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取 3~5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏 b ；
C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5~2.5 倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重0.8~1.2 倍的 100~200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200~300 目，用量为浸膏b重量 6~8 倍量；用体积比为 1:0~0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 4:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C-8、C-18、ODS或MCI 装柱；用体积含量为 20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量 50~80% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以 50~70% 的甲醇为流动相，流速10~14 mL/min，21.2´ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样 45~60 mL，收集 15~35 min的色谱峰，多次累加后蒸干；即得所述的联苯类化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。
3.根据权利要求 2 所述的联苯类化合物的制备方法，其特征是：A步骤所述的有机溶剂为 80~100% 的丙酮、乙醇或甲醇。
4. 根据权利要求 2 所述的联苯类化合物的制备方法，其特征是：B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯。
5.根据权利要求 2 所述的联苯类化合物的制备方法，其特征是：C步骤所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯。
6.根据权利要求 2 所述的联苯类化合物的制备方法，其特征是：C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1。
7.一种权利要求 1 所述的联苯类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
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