CN104293924B - 一种快速鉴定平头炭疽病菌的分子检测方法以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对戊唑醇和腈菌唑具有天然不敏感性的辣椒平头炭疽病菌(C.truncatum)的快速检测和鉴定及其在田间病害防治中的科学用药的应用。具体公开了一种快速检测和鉴定辣椒平头炭疽病菌(C.truncatum)的分子检测方法及专用引物。该特异性引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的DNA分子组成。本发明提供的检测和鉴定辣椒平头炭疽病菌(C.truncatum)的分子检测方法，具有快速、稳定、准确的特点，可以用于高通量地检测和鉴定田间是否存在平头炭疽病菌(C.truncatum)，这对炭疽病的科学有效防治具有重要的指导意义。

Description

一种快速鉴定平头炭疽病菌的分子检测方法以及应用
技术领域
本发明涉及炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)分子检测、鉴定以及在平头炭疽导致的炭疽病防治中药剂选择的应用，具体公开一种快速鉴定对戊唑醇和腈菌唑具有天然不敏感性的平头炭疽病菌C.truncatum的方法和专用引物，属于分子生物学技术领域。
背景技术
炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)是一种重要的病原菌，可以侵染超过460种植物，同时也可以引起人体的疾病，该病原菌引起的植物病害-炭疽病在世界各地均有广泛报道，每年给农业生产带来严重的损失。我国是世界上辣椒重要的生产国家，由该病原菌引起的辣椒炭疽病，是我国辣椒上的重要病害，每年给我国辣椒生产造成严重损失，减产可达30-40％(http://faostat.fao.org，http://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/，QingL et al.，2005)。
该病害的防治目前包括农业措施，抗病育种以及化学防治，其中化学防治仍然是最主要和最有效的防治手段，在众多防治药剂中，唑类药剂是使用最广泛的药剂，其在农业和医学上均被大量使用。在我国炭疽病防治中，唑类药剂也是登记药剂品种最多的一类杀菌剂，该类药剂的作用靶标是甾醇生物合成途径中的cyp51蛋白，它们在真菌病害的防治中表现处优异的防治效果，较少有田间抗性报道。戊唑醇和腈菌唑也是其中最常用的药剂之一。引起炭疽病的病原菌有炭疽属内的多个种(Colletotrichum spp.)，其中，平头炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)是我国很多地区炭疽病菌中的优势种，但本研究通过前期进行的药剂敏感性测定研究发现，戊唑醇和腈菌唑对C.truncatum菌丝生长的抑制率很差，而对其它几种常见炭疽病菌的抑菌活性很高，即平头炭疽病菌(C.truncatum)对戊唑醇和腈菌唑具有天然不敏感性，如果田间引起炭疽病的优势种群是平头炭疽病菌，则生产中病害的防治就需要选用其它药剂，而不能盲目使用戊唑醇和腈菌唑进行病害防治，因此该病原菌的快速鉴定和分子诊断显得尤为重要。
目前该病原菌的鉴定主要通过形态学和多基因测序联合建树进行鉴定，由于需要对菌株选用多个基因进行测序，因此导致鉴定周期较长，实用性较差。如果当需要鉴定的菌株数量较大时，导致鉴定成本较高，工作量也很大，试验周期较长，影响病原诊断的速度。
因此发明一种快速准确的检测方法就显得尤为重要，即可以节省鉴定成本，缩短鉴定周期，明显提高检测效率，有利于为田间病害的科学有效防治提供更快速准确的指导。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定C.truncatum的分子检测方法及其特异性引物。
本发明提供的分子检测和鉴定C.truncatum的方法包括如下步骤：
以待测炭疽病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异引物对CCCYP51F，CCCYP51R进行PCR扩增，若PCR扩增产物为1721bp的条带，则所述待测菌株为C.truncatum。
上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为59℃。
上述鉴定专用引物对属于本发明的保护范围。
上述应用中，经鉴定为C.truncatum的菌株对戊唑醇和腈菌唑具有天然抗性。
本发明所提供的检测和鉴定炭疽病菌(C.truncatum)的方法，有助于快速、准确地检测和鉴定田间炭疽病菌中是否存在C.truncatum以及其是否是优势种群，为田间合理、科学用药提供技术支持，便于及时调整病害防治策略，以更有效的防治该病害。
附图说明
图1为特异引物对CCCYP51F，CCCYP51R对引起我国辣椒炭疽病的主要几种炭疽病菌进行PCR扩增的结果。每个种选了三株菌株，点样孔2-4为C.truncatum，1700bp处目的条带单一；5-16分别为C.gloeosporioides，C.fructicola，C.scoveillie，C.fioriniae。无条带扩增出。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的炭疽菌株均来自全国多个地区，菌株种类为：C.truncatum，C.gloeosporioides，C.fructicola，C.scoveillie，C.fioriniae，数量均为50株。
上述菌株采自中国多个辣椒种植区。通过发病症状及现有的形态学初步鉴定为炭疽病菌。
上述各个菌株均经过菌落生长测定法进行敏感性测定。
实施例1、炭疽病菌对戊唑醇和腈菌唑的敏感性测定
炭疽菌株均来自全国多个地区，菌株种类为：C.truncatum，C.gloeosporioides，C.fructicola，C.scoveillie，C.fioriniae数量均为50株。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g，琼脂粉13g，葡萄糖18g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。
1、实验步骤如下：
1)将戊唑醇和腈菌唑用甲醇配成105μg/ml的母液。对于辣椒炭疽病菌对戊唑醇的敏感性测定，将戊唑醇逐级稀释成100μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL，2.5×103μg/mL，5×103μg/mL，10×103μg/mL，20×103μg/mL的浓度梯度；对于辣椒炭疽病菌对腈菌唑的敏感性测定，将供试药剂腈菌唑逐级稀释成2.5×103ug/mL，5×103μg/mL，104μg/mL，2×104μg/mL，4×104μg/mL，8×104μg/mL，105μg/mL的浓度梯度。
2)辣椒炭疽病菌对戊唑醇和腈菌唑的敏感性测定方法：用移液枪吸取药液60μl加入已灭菌的冷却至45℃的60ml PDA培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的培养皿中，设只加60μl甲醇的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复；
3)辣椒炭疽病菌在PDA平板上培养5天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照培养基中，置于28℃培养箱中黑暗培养，4d后测量菌落直径。
4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各复配比例对供试菌株的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，分别求出供试辣椒炭疽菌株的毒力回归曲线方程Y＝a+bX，以及相关系数r和有效抑制中浓度EC50值，并计算每一种炭疽病菌的平均EC50值和标准差。
2、结果
表1炭疽属不同种的辣椒炭疽菌株对戊唑醇和腈菌唑的敏感性
通过辣椒炭疽病菌对戊唑醇和腈菌唑的敏感性检测，结果表明这两种生产中常用杀菌剂对平头炭疽C.truncatum菌株的的平均EC50分别大于40和100μg/mL，而这两种杀菌剂对其它四种炭疽菌株的平均EC50显著低于平头炭疽，结果见表1。
实施例2、炭疽病菌C.truncatum的分子鉴定
1、菌株：每种炭疽选用三株菌株，C.truncatum菌株为HBLF11，CQ6，SDWC2-17；C.gloeosporioides为SDLY2-1，GDQY13-85，SC8；C.fructicola为GXGL7，GDQY13-96，YNML2，C.scoveillie为SXCZ3，SXSZ，FJ33，C.fioriniae为SHFX，JL23，QH8
2、方法：
1)菌株培养：使用PDA培养基(马铃薯去皮200g，葡萄糖18g，琼脂粉13g，蒸馏水定容至1L。121℃，20min，湿热灭菌后备用)于28℃培养辣椒炭疽病菌。将预培养的炭疽病菌接种在铺有玻璃纸的PDA培养基上，28℃黑暗培养5d后收集菌丝，液氮冰冻后于-80℃保存，用于提取基因组DNA。
2)分别提取不同种类的辣椒炭疽病菌的基因组DNA：
取适量经液氮冰冻的菌丝，研钵研磨至粉末状，置于1.5mL离心管中；
加入650μL2％ CTAB溶液，在振荡器上振荡1min；后于65℃水浴30min；
加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(v/v/v，25∶24∶1)颠倒混匀，12000rpm离心20min；
取上清液于新管中，加入氯仿∶异戊醇(v/v/，24∶1)进行再次抽提；
离心后取上清液加入0.6倍体积的异丙醇4℃下静置2h沉淀基因组；
12000rpm离心20min，沉淀用300μL75％冷乙醇洗涤两遍；
真空干燥后，溶于50μL的TE缓冲液中(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/LEDTA)于-20℃保存备用。
3)平头炭疽病菌C.truncatum cyp51基因的PCR扩增
用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对CCCYP51F(5’-AAGCTTATGGGTCTCCTGCAGGAG-3’)和CCCYP51R(5’-GGTACCCTAGGGGTTGCGCTTCTC-3’)扩增炭疽病菌C.truncatumcyp51基因的全长。
PCR反应体系如下：
25μl的PCR体系：
PCR反应条件如下：
4)测序
将PCR产物进行测序。以基因组DNA为模板时，平头炭疽病菌C.truncatum的cyp51基因全长共1721bp，序列如SEQ ID NO：3所示，其中包含140bp的内含子序列，cDNA编码526个氨基酸。序列如SEQ ID NO：4所示。

Claims (8)

1.一种快速鉴定平头炭疽病菌的分子检测方法，包括如下步骤：
以待测辣椒炭疽病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对CCCYP51F和CCCYP51R进行PCR扩增，若能成功扩增出1721bp的条带，则所待鉴定的辣椒炭疽病菌为C.truncatum。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，退火温度为59℃。
3.一种快速检测和鉴定辣椒炭疽病菌中是否存在C.truncatum的引物对，由SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示DNA分子组成。
4.权利要求1或2所述的方法在检测和鉴定辣椒平头炭疽病菌(C.truncatum)对杀菌剂不敏感性中的应用；所述不敏感性为抗戊唑醇和腈菌唑。
5.权利要求3所述的引物对在检测和鉴定辣椒平头炭疽病菌(C.truncatum)对杀菌剂不敏感性中的应用；所述不敏感性为抗戊唑醇和腈菌唑。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：辣椒平头炭疽病菌(C.truncatum)具有天然对戊唑醇和腈菌唑的不敏感性。
7.SEQ ID NO：3所示基因。
8.SEQ ID NO：4所示蛋白。
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