CN105063226B - 菜用大豆中平头炭疽菌的特异性pcr检测引物及其检测方法 - Google Patents

菜用大豆中平头炭疽菌的特异性pcr检测引物及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一对用于检测菜用大豆炭疽病菌的PCR引物及其检测方法，所述引物包括上游引物CTF1：5'‑CC CTGAAAAGGACGTCTCC‑3'和下游引物CTR1：5'‑GCTAGAGTCCCTCCGAA TCC‑3'，在所述引物基础上建立菜用大豆炭疽病菌PCR检测方法，可在菜用大豆炭疽病菌纯DNA和带菜用大豆炭疽病菌的发病豆荚组织中特异性地扩增出片段大小为426bp的扩增产物。本发明的检测引物和检测方法可用于田间菜用大豆炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，克服了传统检测、鉴定方法步骤繁琐、周期长等问题，本发明所提供的引物及方法对菜用大豆炭疽病菌进行检测具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点。

Description

菜用大豆中平头炭疽菌的特异性PCR检测引物及其检测方法
技术领域
本发明涉及菜用大豆炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，专用于菜用大豆炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间菜用大豆炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
背景技术
菜用大豆又称为毛豆，因味道鲜美、营养丰富而深受广大消费者的喜爱，正逐渐成为具有较高经济价值的蔬菜之一，给城郊农户带来较大的经济效益，也是我国南方部分省市春季主要栽培的出品创汇的农产品之一，产品大量用于保鲜和速冻加工。然而在菜用大豆种植过程中尤其在结荚至收获上市期间，由平头炭疽菌[Colletotrichum truncatum(Schwein.) Andrus & W.D.Moore] 侵染引起的炭疽病在豆荚上严重发生，感病品种一般田块株发病率为50%左右，豆荚发病率为30%左右，重病田块株发病率达90%以上，豆荚发病率达50%以上，极大地影响了豆荚的商品性及其经济价值，是菜用大豆生产上的一种重要病害，并且其发生危害有日益严重的趋势。菜用大豆炭疽病菌具有潜伏侵染的特性，在发病初期症状一般不明显，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立菜用大豆炭疽病菌快速检测体系，在发病早期对植株是否携带炭疽病菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。
随着分子生物学技术的发展，应用聚合酶反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增技术对植物病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有研究人员利用真菌核糖体转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）基因为病原菌检测靶标，开发出了灰霉菌、疫霉菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。真菌核糖体转录间隔区ITS序列以中性的方式进化，速度与物种形成的进程相仿，ITS在种内相当保守，而在种间表现出一定的变异，是区分种或种下阶元的理想分子标记。炭疽病菌传统的分类鉴定和检测主要基于形态学特征及致病性测定和生理生化特征等，这种鉴定方法耗时较长、程序繁琐、灵敏度低，而且还要求鉴定者具有良好的经验和专业背景知识，难以满足病害防控中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而基于PCR方法的分子鉴定只要求工作者有简单的分子操作技能。目前，尚未见有关菜用大豆炭疽病菌（C.truncatum）分子检测鉴定方法。本发明通过对炭疽菌属（Colletotrichum）的ITS序列进行比对分析，设计出1对可用于特异性检测菜用大豆炭疽病菌的引物，为菜用大豆炭疽病菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中对菜用大豆炭疽病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，提供了一种菜用大豆炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物和检测方法检测菜用大豆炭疽病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1. 通过测定菜用大豆炭疽病菌（Colletotrichum truncatum）和其它炭疽病菌（Colletotrichum spp）的核糖体转录间隔区（ITS）基因，对炭疽菌属不同种间ITS基因序列进行比对分析，设计出对菜用大豆炭疽病菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：
上游引物CTF1：5'- CCCTGAAAAGGACGTCTCC -3'，
下游引物CTR1：5'- GCTAGAGTCCCTCCGAATCC -3'；
对菜用大豆炭疽病菌特异性扩增出426bp的产物。
2. 菜用大豆炭疽病菌特异分子检测方法的建立
（1）提取待测样品基因组DNA。
用于检测豆荚中存在菜用大豆炭疽病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向1.0 mg豆荚组织中加入0.5 mol/L NaOH 30 µL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）495µL混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。
（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用CTF1/CTR1这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的CTF1/CTR1引物各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
（3）取步骤（2）的PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约426bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在菜用大豆炭疽病菌，否则所述的检测样品中未存在菜用大豆炭疽病菌。
本发明的显著优点
本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：
1.特异性强、准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribed spacer, ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计了对菜用大豆炭疽病菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的菜用大豆炭疽病菌和携带菜用大豆炭疽病菌的豆荚组织进行了测试验证，只有菜用大豆炭疽病菌和携带该病菌的豆荚中能特异性地扩增出一条426bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。
2.灵敏度高：病原菌传统的检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与ITS基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR扩增后，对菜用大豆炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到1fg，比常规PCR检测提高了10000倍；
3.实用性好：菜用大豆炭疽病菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的菜用大豆炭疽病菌的检测方法一般是在豆荚出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长，给快速而精确地检测病原物增加了难度，传统的方法由于不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常给农业生产的防治延误时机。本发明可对豆荚中是否携带菜用大豆炭疽病菌进行检测，如果能特异性地扩增出426bp的电泳条带，说明植物组织中存在菜用大豆炭疽病菌，因此本发明可用于菜用大豆炭疽病显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性；
4.操作简便、快速：应用本发明方法，对待测样品基因组DNA进行提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间，一般整个检测过程可在6小时内完成。
附图说明
图1为本发明所要检测的菜用大豆炭疽病菌的特异PCR扩增图，图中：泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1-5为菜用大豆炭疽病菌，泳道6-13分别为桃炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、毁灭炭疽菌、菜豆炭疽病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉菌和番茄早疫病菌，泳道14为阴性对照。
图2为本发明菜用大豆炭疽病菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对菜用大豆炭疽病菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对菜用大豆炭疽病菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1为100 ng，泳道2为10 ng，泳道3为1 ng，泳道4为100 pg，泳道5为10 pg，泳道6为1 pg，泳道7为100 fg，泳道8为10 fg，泳道9为1 fg，泳道10为 100 ag，泳道11为10 ag，泳道12-14为阴性对照。
图3为本发明发病组织的检测结果图，图中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道1-5为自然发病的豆荚，泳道6-7为健康豆荚，泳道8为阴性对照，泳道9为阳性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
实施例 1：PCR检测引物序列的设计及引物对菜用大豆炭疽病菌的特异性扩增
1.引物的设计与合成
本发明的关键性技术是菜用大豆炭疽病菌高效特异性PCR检测引物的设计及其检测方法的建立。为了获得菜用大豆炭疽病菌的特异PCR检测引物序列，以来源于我国福建、海南、浙江和广东等不同省份的16株菜用大豆炭疽病菌和多个炭疽属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r.min-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r.min-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.min-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol.L-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r.min-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 70%冰乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至25 ng/µL待用。以真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'对供试菜用大豆炭疽病菌（C. truncatum）的ITS基因进行扩增，PCR反应体系50 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10µmol/L的ITS1/ ITS4引物各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、55℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序得到的菜用大豆炭疽病菌（C. truncatum）的ITS序列与GenBank中Colletotrichum属18个不同种的ITS基因序列进行同源性比较分析，根据菜用大豆炭疽病菌与其它种间的差异位点（在BioEdit中比对），用Primer Primer5软件设计了菜用大豆炭疽病菌C. truncatum的特异性引物，引物序列为：上游引物CTF1：5'- CCCTGAAAAGGACGTCTCC -3'，下游引物CTR1：5'- GCTAGAGTCCCTCCGAATCC -3'，引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。
2.引物特异性PCR验证
在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立了菜用大豆炭疽病菌检测方法，以供试的菜用大豆炭疽病菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对菜用大豆炭疽病菌特异性引物（上游引物CTF1：5'- CCCTGAAAAGGACGTCTCC -3'，下游引物CTR1：5'- GCTAGAGTCCCTCCG AATCC -3'）的特异性进行验证。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的CTF1/CTR1引物各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火45S、72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。取5 µL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对菜用大豆炭疽病菌特异性引物的特异性进行验证。
3.引物特异性验证结果
PCR扩增结果表明，引物CTF1/CTR1只能特异性地从供试的16个菜用大豆炭疽病菌DNA中扩增出大小约为426bp的条带（图1），而其它炭疽菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将菜用大豆炭疽病菌与其它炭疽菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于菜用大豆炭疽病菌快速可靠的检测和鉴定。
实施例2：引物对菜用大豆炭疽病菌基因组DNA的灵敏度检测
1.常规PCR扩增
用无菌超纯水对菜用大豆炭疽病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物CTF1/CTR1对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对菜用大豆炭疽病菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10µmol/L的CTF1/CTR1引物各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。
巢式PCR扩增
用无菌超纯水对菜用大豆炭疽病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。以真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3'为外引物，本发明所述的特异引物CTF1/CTR1为内引物对菜用大豆炭疽病菌不同系列浓度的基因组DNA进行巢式PCR扩增，评估本发明所述引物CTF1/CTR1通过巢式PCR对菜用大豆炭疽病菌基因组DNA检测的灵敏性，第一轮PCR扩增：以ITS通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'作为第一轮反应引物对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ITS1/ITS4引物各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、55℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。第二轮PCR扩增：待第一轮PCR扩增结果后，取1.0 μl 第一轮PCR产物为模板与引物CTF1/CTR1组合进行巢式PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的CTF1/CTR1引物各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10min。
常规PCR和巢式PCR灵敏度比较结果表明，当以本发明所述引物CTF1/CTR1进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到10pg DNA 25μl-1反应体系（图2中的a）。进一步以ITS基因通用引物ITS1/ITS4进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以CTF1/CTR1作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出套式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的的样品（1pg、100fg、10fg、1pg/25μl反应体系）产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到1fg DNA 25μl-1反应体系，比常规PCR要提高10000倍左右。
实施例3：发病豆荚中菜用大豆炭疽病菌的检测
发病豆荚中菜用大豆炭疽病菌DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向1.0 mg发病豆荚组织中加入0.5 mol/L NaOH 30 µL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）495µL混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。PCR扩增检测：利用本发明所述引物CTF1/CTR1进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的CTF1/CTR1引物各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。结果检测：取PCR扩增产物5.0µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约426bp的产物，即可判断发病豆荚组织中带有菜用大豆炭疽病菌。检测结果（图3）表明，菜用大豆炭疽病发病症状典型的豆荚组织中均可检测出菜用大豆炭疽病菌，而健康豆荚组织及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于菜用大豆豆荚中炭疽病菌的快速分子检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 菜用大豆中平头 炭疽菌的 特异性PCR检测引物及其检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctgaaaag gacgtctcc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctagagtcc ctccgaatcc 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgtaggga acctgcgg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (3)

1.菜用大豆平头炭疽菌Colletotrichum truncatum特异性PCR检测引物，其特征在于：引物序列为：
上游引物CTF1：5'- CCCTGAAAAGGACGTCTCC -3'，
下游引物CTR1：5'- GCTAGAGTCCCTCCGAATCC -3'；
对菜用大豆平头炭疽菌Colletotrichum truncatum特异性扩增出426bp的产物。
2.一种利用权利要求1所述引物检测菜用大豆中平头炭疽菌Colletotrichumtruncatum的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用CTF1/CTR1这一对引物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L引物CTF1/CTR1各1.0µL，2.0×10-5～200 ng DNA 模板，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
（3）取5.0 µL步骤（2）的PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳40 min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出426bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在平头炭疽菌Colletotrichum truncatum。
3.如权利要求1所述的引物在田间菜用大豆中平头炭疽菌Colletotrichum truncatum的早期诊断和该病菌的监测和鉴定上的应用。
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