CN116656868A - 一种菜豆特异性标记引物、特异性its序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种菜豆特异性标记引物、特异性ITS序列及其应用，属于分子生物学检测技术领域。本发明的菜豆特异性标记引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。使用本发明提供的菜豆特异性标记引物能够准确鉴定菜豆的根系归属，将菜豆根系与常见的农作物、杂草区分开来，并有效减少土壤中常见微生物对鉴定的干扰，提高菜豆根系鉴定的速率及准确度，对菜豆根系研究、菜豆根系DNA条形码构建、土壤残茬分析具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别涉及一种菜豆特异性标记引物、特异性ITS序列及其应用。
背景技术
根系研究是农业生产和植物互作等领域的重要研究方向，根系是植物的重要器官，对植物生长和发育具有重要作用。例如，作物根系的分布可以影响作物的产量及耐逆性；作物残茬可以直接影响土壤的生物、物理、化学性质，影响土壤健康状态。然而，根系隐匿于土壤中，表型鉴定工作耗时耗力且准确性较低，极大地制约着作物根系在实践中的应用。因此，提高根系表型鉴定效率是加速根系研究的迫切需求。
目前鉴别根系的方法有许多，主要是基于形态学、生理学等特征进行判断，如形态学鉴别、解剖学鉴别、生物化学鉴别等。然而，这些方法均存在局限性和误差，如：形态学鉴别需要对根系进行详细的形态学描述，很难区分一些根系形态相似的植物；解剖学鉴别需要对根系进行切片观察，工作量大，时间长；生物化学鉴别需要对根系进行化学成分的分析，操作复杂。因此，上述方法无法满足现代农业对快速、准确检测根系的需求。利用分子生物学技术，如PCR扩增、DNA条形码技术等，对根系的基因组DNA进行分析，可以快速、准确地鉴别根系的种类和性质。但此方法可能会由于特异性引物不够特异，从而受到污染和干扰，影响结果。菜豆作为常见蔬菜，在世界范围都广泛种植，对其根系的研究具有重要的意义。因此，亟需一种干扰小、结果准确的菜豆特异性引物。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种菜豆特异性标记引物、特异性ITS序列及其应用，使用本发明提供的菜豆特异性标记引物能够准确鉴定菜豆的根系归属，提高菜豆根系鉴定的速率，对菜豆根系研究、菜豆根系DNA条形码构建、土壤残茬分析具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种菜豆特异性标记引物，所述菜豆特异性标记引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供一种菜豆特异性ITS序列，所述菜豆特异性ITS序列是由上述技术方案中所述的菜豆特异性标记引物扩增获得。
优选地，所述菜豆特异性ITS序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述菜豆特异性ITS序列的大小为241bp。
本发明还提供一种使用上述技术方案中所述菜豆特异性标记引物的应用。
本发明还提供一种使用上述技术方案中所述特异性ITS序列的应用。
本发明还提供一种鉴定菜豆根系归属的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、以S1中所得的基因组DNA为模板，使用上述技术方案中所述的菜豆特异性标记引物进行PCR扩增；
S3、采用琼脂糖凝胶电泳法对S2中得到的PCR扩增产物进行检测。
优选地，所述S2中PCR扩增的反应体系包括2×Rapid Taq Master Mix、菜豆特异性标记引物、DNA模板、ddH2O。
优选地，所述S2中PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3s，35个循环；72℃延伸5min。
优选地，所述S3中的检测结果是检测是否成功扩增出上述技术方案中所述的菜豆特异性ITS序列。
有益技术效果：本发明提供了一种菜豆特异性标记引物、特异性ITS序列及其在鉴定菜豆根系归属中的应用，本发明的菜豆特异性标记引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。使用本发明提供的菜豆特异性标记引物能够准确鉴定菜豆的根系归属，将菜豆根系与常见的农作物、杂草区分开来，并有效减少土壤中常见微生物对鉴定的干扰，提高菜豆根系鉴定的速率及准确度，对菜豆根系研究、菜豆根系DNA条形码构建、土壤残茬分析具有重要意义。
附图说明
图1为各样品扩增产物的电泳图；
图2为植物、真菌、细菌、土壤总DNA的电泳图；
其中，图1和图2中均为：M：DL 2000DNA Marker，C：菜豆；H：黄瓜；X：西瓜；T：甜瓜；F：番茄；L：青椒；Q：茄子；B：大白菜；G：甘蓝；SD：水稻；YM：玉米；Y：分蘖洋葱；XM：小麦；Ag：芹菜；Ls：生菜；Af：葱；St：马铃薯；Br：油菜；Vv：葡萄；Fa：草莓；Cs：芫荽；Zo：姜；Cm：南瓜；Es：臭菜；At：韭菜；Gm：大豆；Rs：萝卜菜；Tm：蒲公英；Bj：芥菜；At：拟南芥；Vu：豇豆；Ds：胡萝卜；Bh：冬瓜；Ib：番薯；La：丝瓜；So：菠菜；Mc：薄荷；As：蒿；Ac：青蒿；Ea：飞蓬；Sj：鼠尾草；Cj：蓟，Ms：苜蓿；Ds：马唐；Tr：车轴草；Hm：萱草；Ec：稗草；Ps：朝天委陵菜；Aa：铁苋菜；Hs：葎草；Po：马齿苋；Sw：苣荬菜；Pa：车前草；Ei：牛筋草；Sv：狗尾草；Tp：附地菜；Sn：龙葵；Ca：藜；Tri：木霉菌；Asp：曲霉菌；Pen：青霉菌；Mor：被孢霉菌；Cha：毛壳菌；Muc：毛霉菌；Fol：番茄枯萎病菌；Foc：黄瓜枯萎病菌；Fon：西瓜枯萎病菌；Bac：芽孢杆菌；Fla：黄杆菌；Rhi：根瘤菌；Art：节杆菌；Act：放线菌；Ros：纤发菌；Str：链霉菌；Pse：假单胞菌；TD：大田土DNA；N：阴性对照。
具体实施方式
本发明提供了一种菜豆特异性标记引物，所述菜豆特异性标记引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示
在本发明中，所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.2的具体核苷酸序列如下所示：
SEQ ID No.1：CTTGATGCCTTGTGCATCCG；
SEQ ID No.2：TGGTTCACGGGATTCTGCAA。
在本发明中，所述菜豆特异性标记引物为根据常见农作物、田间杂草的ITS序列分析、比对后找出的差异区段及引物设计原则设计所得；本发明的菜豆特异性标记引物可将菜豆的根系与常见的农作物、杂草区分开来，同时不受土壤中常见微生物的干扰，有效提高菜豆根系鉴定的速率及准确度。
本发明还提供一种菜豆特异性ITS序列，所述菜豆特异性ITS序列是上述技术方案中所述的菜豆特异性标记引物扩增获得。
在本发明中，所述菜豆特异性ITS序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述菜豆特异性ITS序列的大小为241bp；所述SEQ ID No.3的具体核苷酸序列如下所示：
SEQ ID No.3：
CTTGATGCCTTGTGCATCCGGTCGCAAACCCGTGTCTCCCGACAAAAACTAACCCCGGCGTTTTACGCGCCAAGGAAAACGAAGCTGTTAGGTGAGGCAAACGGGGGACGTGTCCCGCGGGCGCCTTCACGATGACATGTTATGTAAAATGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCA。
本发明还提供一种上述技术方案中所述菜豆特异性标记引物的应用。
在本发明中，所述应用优选为鉴定菜豆根系归属的试剂盒、菜豆根系鉴定、菜豆根系DNA条形码构建、土壤残茬分析。本发明所述应用优选但不限于上述领域，所述应用的应用类型和方法没有特殊限定，采用菜豆特异性标记引物可接受的应用类型和方法即可。
本发明还提供一种上述技术方案中所述菜豆特异性ITS序列的应用。
在本发明中，所述应用优选为鉴定菜豆根系归属的试剂盒、菜豆根系鉴定、菜豆根系DNA条形码构建、土壤残茬分析。本发明所述应用优选但不限于上述领域，所述应用的应用类型和方法没有特殊限定，采用菜豆特异性ITS序列可接受的应用类型和方法即可。
本发明还提供一种鉴定菜豆根系归属的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、以S1中所得的基因组DNA为模板，使用上述技术方案中所述的菜豆特异性标记引物进行PCR扩增；
S3、采用琼脂糖凝胶电泳法对S2中得到的PCR扩增产物进行检测。
本发明先提取待测样品的基因组DNA。
在本发明中，所述提取待测样品的基因组DNA可采用植物基因组DNA提取试剂盒提取。
本发明以上述所得的基因组DNA为模板，使用上述技术方案中所述的菜豆特异性标记引物进行PCR扩增。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选包括2×Rapid Taq Master Mix、菜豆特异性标记引物、DNA模板、ddH2O。其中，2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL、菜豆特异性标记引物2μL(正向引物和反向引物各1μL)、DNA模板1μL、ddH2O补足至25μL。
在本发明中，所述PCR扩增的反应条件优选为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3s，35个循环；72℃延伸5min。
本发明采用琼脂糖凝胶电泳法对上述得到的PCR扩增产物进行检测。
在本发明中，所述琼脂糖凝胶电泳法是将样品于1％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，并用紫外成像仪进行检测；所述检测结果是检测是否成功扩增出上述技术方案中所述的菜豆特异性ITS序列。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明实施例及试验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
(1)菜豆特异性标记引物设计
将菜豆完整的ITS序列与36种其它常见农作物及21种常见田间杂草的ITS序列(菜豆及其它常见农作物及田间杂草的来源及信息见表1)使用MEGAX和BioEdit软件进行序列分析、校对和比对，选择出目标作物ITS区核酸序列与其他常见农作物和田间杂草中碱基有差异的区段，利用软件Primer Premier 5进行引物设计。参照选择引物的一般设计原则对引物的要求设计引物，即(1)引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；(2)引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；(3)引物3’端应避免出现发夹结构；(4)正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值调整至55～65℃最佳；(5)引物的GC含量应控制在40％～60％之间；(6)引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；(7)避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列，两条引物的3’端避免有3个碱基以上的互补序列；(8)选择PCR扩增产物长度为100～300bp，这样引物可以同时用于常规PCR和定量PCR。在尽量符合上述条件的基础上根据引物自身情况将序列做适当的调整。设计的引物在NCBI-BLAST比对进行初步的特异性验证，检查引物3’端是否在目标植物基因组的其它位置以及非目标植物基因组有匹配的情况，确定引物序列均来自于目标植物。最后选择BLAST比对后符合要求的引物。
所得菜豆特异性标记引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司。
表1菜豆及常见农作物、田间杂草的来源及信息
(2)DNA的提取：
样品来源：菜豆及36种其它常见农作物和21种常见田间杂草的来源见表1；9种土壤中常见的真菌及8种土壤中常见的细菌的来源见表2；大田土来源于东北农业大学玉米连作土；阴性对照为ddH2O；
表2 9种土壤中常见的真菌及8种土壤中常见的细菌的来源
①植物DNA的提取：
将采集好的菜豆、36种其它常见农作物和21种常见田间杂草的根系用液氮冷冻研磨，采用百泰克生物技术有限公司的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行植物基因组DNA的提取。取3μL DNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的植物基因组DNA。
②真菌基因组DNA的提取
采用常规方法培养上述来源的真菌，培养一周的真菌使用灭过菌的药匙从PDA培养基上慢慢地将菌丝剔下来，用液氮冷冻研磨，采用百泰克生物技术有限公司的真菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行真菌基因组DNA的提取。取3μL DNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的真菌基因组DNA。
③细菌基因组DNA的提取
采用常规方法培养上述细菌，用灭菌的牙签在固体LB培养基中挑出培养2d～3d的细菌放入LB液体培养基中，在恒温摇床中以180rpm转速、37℃的条件摇菌1d～2d，吸取摇好的菌液采用百泰克生物技术有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行细菌基因组DNA的提取。取3μL DNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的细菌基因组DNA。
④土壤总DNA的提取
土壤总DNA利用Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek,Inc.,GA,USA)提取。取3μL DNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的土壤总DNA。
植物、真菌、细菌、土壤总DNA的电泳图如图2所示。由图2可以看出，各类样品的DNA均已成功提取。
(3)菜豆特异性标记引物的验证：
以菜豆、36种常见农作物、21种田间常见杂草、9种土壤中常见的真菌、8种土壤中常见的细菌以及大田土DNA为模板，分别进行常规PCR扩增反应，对设计的引物进行特异性应用验证。
反应体系：
反应程序：
95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3s，35个循环；72℃延伸5min。
分别取3μL各样品的扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测。检测结果如图1所示。由图1可以看出，以分蘖洋葱基因组DNA为模板的泳道出现了特异性的扩增条带，而其余样品基因组DNA为模板的泳道未出现扩增条带，则表明本发明所得的特异引物具有很好的特异性，能够准确鉴定菜豆的根系归属，将菜豆根系与常见的农作物、杂草区分开来，并有效减少土壤中常见微生物对鉴定的干扰，提高菜豆根系鉴定的速率及准确度，对菜豆根系研究、菜豆根系DNA条形码构建、土壤残茬分析具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种菜豆特异性标记引物，其特征在于，所述菜豆特异性标记引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
2.一种菜豆特异性ITS序列，其特征在于，所述菜豆特异性ITS序列是由权利要求1所述的菜豆特异性标记引物扩增获得。
3.根据权利要求2所述的菜豆特异性ITS序列，其特征在于，所述菜豆特异性ITS序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求2所述的菜豆特异性ITS序列，其特征在于，所述菜豆特异性ITS序列的大小为241bp。
5.一种权利要求1所述菜豆特异性标记引物的应用。
6.一种权利要求2～4任一所述特异性ITS序列的应用。
7.一种鉴定菜豆根系归属的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、以S1中所得的基因组DNA为模板，使用权利要求1中所述的菜豆特异性标记引物进行PCR扩增；
S3、采用琼脂糖凝胶电泳法对S2中得到的PCR扩增产物进行检测。
8.根据权利要求7所述鉴定菜豆根系归属的方法，其特征在于，所述S2中PCR扩增的反应体系包括2×Rapid Taq Master Mix、菜豆特异性标记引物、DNA模板、ddH2O。
9.根据权利要求7所述鉴定菜豆根系归属的方法，其特征在于，所述S2中PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3s，35个循环；72℃延伸5min。
10.根据权利要求7所述鉴定菜豆根系归属的方法，其特征在于，所述S3中的检测结果是检测是否成功扩增出权利要求2～4任一所述的菜豆特异性ITS序列。
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