CN104004842B - 一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重pcr引物组及检测方法 - Google Patents

一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重pcr引物组及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及方法。本发明检测方法根据嗜水气单胞菌，维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌，分别设计和筛选出了三对特异性引物，通过多重PCR反应可以快速准确地检测水生动物败血症中的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌。本发明可以同时检测水生动物败血症的三种病原菌，检测所需时间短、灵敏度高、特异性好，与常规病原诊断方法相比更加快捷、经济，因此，可以用于水生动物败血症病的快速诊断和大规模的分子流行病学调查。

Description

一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及检测方法
技术领域
本发明涉及一种多重PCR检测方法，具体涉及一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及检测方法。
背景技术
细菌性败血症又叫淡水鱼类暴发性流行病，最早于1986年发现，1989年起开始在全国大范围流行，很多水产养殖动物都可感染，如鲫、鳊、鲤、鲢、鳙、草鱼，斑点叉尾鮰等。该病的发病率和死亡率均很高，是我国养鱼史上危害鱼的种类最多、流行地区最广、流行季节最长、造成的损失最严重的一种急性传染病。嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，AH)是引起水生动物细菌性败血症的主要致病菌，近年来维氏气单胞菌(Aeromonasveronii，AV)是也引起多种水生动物发生多器官败血症的常见致病菌，在斑点叉尾鮰中引起败血症的症状的主要病原菌为鮰爱德华氏菌（Edwardsiellaictaluri，EI）。
基于现有技术检测水产动物致病菌大多沿用传统的病样细菌分离培养及鉴定等方法，而该方法检测步骤繁琐，周期较长，灵敏度低。在应对突发的疾病发生事件时，不能满足诊断及时、结果准确、灵敏度和特异性高以及大量样品检测的要求。鉴于此，为了能够实现快速对水生动物中多种致病菌的诊断和监控，各国学者研究出了一些新的观点和方法，如酶联免疫分析法（EILISA）、荧光免疫分析法（FIA）和聚合酶链反应（PCR）。针对嗜水气单胞菌、鮰爱德华氏菌等单一致病菌的PCR检验方法已经建立起来法，在水产动物败血症基本上都是沿用普通PCR方法，通常一次只能检测一种致病菌，检测时间长且常常造成漏检或误检。然而，水生动物养殖过程中，需要对鱼类突发败血症病的致病菌进行快速检测和分子流行病学调查，其样本量大、时间紧，采用单一致病菌的PCR检测技术和一般方法不能满足要求，因此，建立简便、快速、准确、可靠的检测方法同时适用于这三种主要病原菌的检测方法尤为重要。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种可以同时检测水生动物败血症致病菌的多重PCR检测方法。
本发明的目的在于提供一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组，其核苷酸序列分别如下所示：
嗜水气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AH-F1：5’-CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’（SEQIDNO:1），或者为该序列的核酸互补序列；
AH-R1：5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’（SEQIDNO:2），或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AV-F2：5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’（SEQIDNO:3），或者为该序列的核酸互补序列；
AV-R2：5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’（SEQIDNO:4），或者为该序列的核酸互补序列；
鮰爱德华氏菌引物组的核酸序列如下：
EI-F3：5’-CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’（SEQIDNO:5），或者为该序列的核酸互补序列；
EI-R3：5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’（SEQIDNO:6），或者为该序列的核酸互补序列。
一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
1）DNA模板的制备；
2）多重PCR扩增体系如下：
2×mix23~27μL
10μmol/LAH-F11~3μL
10μmol/LAH-R11~3μL
10μmol/LAV-F21~3μL
10μmol/LAV-R21~3μL
10μmol/LEI-F31~3μL
10μmol/LEI-R31~3μL
DNA模板1~2μL
ddH2O加至50μL；
3）多重PCR扩增条件为：94~96℃预变性3~6min，94~95℃变性45~55s，55~60℃退火25~35s，72℃延伸50~60s，进行28~35个循环后，然后再72℃温度延伸7~10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存；
4）PCR产物检测：将PCR扩增产物进行电泳、凝胶成像观察，若有1091bp的条带说明样品中有嗜水气单胞菌，若有262bp的条带说明样品中维氏气单胞菌，若有450bp的条带说明样品中有鮰爱德华氏菌，若这种大小的条带都不存在，说明样品中嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌这三种菌为阴性。
进一步的，步骤1）所述的DNA模板制备的具体操作为：将待测水产动物的组织匀浆液750~850g离心4~6min，取上清，9000~11000g离心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE缓冲液，95~100℃处理8~12min；9000~11000g离心8~12min，收集上清液即待测DNA模板。
进一步的，步骤2）所述的多重PCR扩增体系为：
2×mix25μL
10μmol/LAH-F11μL
10μmol/LAH-R11μL
10μmol/LAV-F23μL
10μmol/LAV-R23μL
10μmol/LEI-F32μL
10μmol/LEI-R32μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL。
进一步的，上述2×mix含有TaqDNAPolymerase,2×TaqPCRBuffer,3mMMgCl2和400μMdNTP。
进一步的，步骤3）所述的多重PCR扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性50s，59℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后再72℃温度延伸10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。
本发明的有益效果是：
本发明可以同时检测水生动物败血症的三种病原菌，检测所需时间短、灵敏度高、特异性好，与常规病原诊断方法相比更加快捷、经济，可以用于水生动物败血症病的快速诊断和大规模的分子流行病学调查。
附图说明
图1为嗜水气单胞菌特异性检测结果；Ah：嗜水气单胞菌，1：霍乱弧菌F2，2：溶藻弧菌Ecgy0608，3：海豚链球菌ATCC29177，4：无乳链球菌XQ-1，5：弗氏柠檬酸杆菌HD1003，6：迟缓爱德华氏菌1101，7：鰤鱼诺卡氏菌O12L1，8：舒氏气单胞菌WL-1，9：温和气单胞菌Pt141，10：柱状黄杆菌G4；
图2为维氏气单胞菌特异性检测结果，Av：维氏气单胞菌，1：霍乱弧菌F2，2：溶藻弧菌Ecgy0608，3：海豚链球菌ATCC29177，4：无乳链球菌XQ-1，5：弗氏柠檬酸杆菌HD1003，6：迟缓爱德华氏菌1101，7：鰤鱼诺卡氏菌O12L1，8：舒氏气单胞菌WL-1，9：温和气单胞菌Pt141，10：柱状黄杆菌G4；
图3为鮰爱德华氏菌特异性检测结果，Ei：鮰爱德华氏菌，1：霍乱弧菌F2，2：溶藻弧菌Ecgy0608，3：海豚链球菌ATCC29177，4：无乳链球菌XQ-1，5：弗氏柠檬酸杆菌HD1003，6：迟缓爱德华氏菌1101，7：鰤鱼诺卡氏菌O12L1，8：舒氏气单胞菌WL-1，9：温和气单胞菌Pt141，10：柱状黄杆菌G4；
图4为多重PCR特异性检测结果；
图5为嗜水气单胞菌敏感性检测结果；1～6样品中的菌浓度分别为2×106cfu/mL、2×105cfu/mL、2×104cfu/mL、2×103cfu/mL、2×102cfu/mL、2×101cfu/mL；
图6为维氏气单胞菌敏感性检测结果；1～6样品中的菌浓度分别为3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL、3×101cfu/mL；
图7为鮰爱德华氏菌敏感性检测结果；1～6样品中的菌浓度分别为2×106cfu/mL、2×105cfu/mL、2×104cfu/mL、2×103cfu/mL、2×102cfu/mL、2×101cfu/mL。
具体实施方式
一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
1）DNA模板的制备；
2）多重PCR扩增体系如下：
2×mix23~27μL
10μmol/LAH-F11~3μL
10μmol/LAH-R11~3μL
10μmol/LAV-F21~3μL
10μmol/LAV-R21~3μL
10μmol/LEI-F31~3μL
10μmol/LEI-R31~3μL
DNA模板1~2μL
ddH2O加至50μL；
其中，嗜水气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AH-F1：5’-CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’（SEQIDNO:1），或者为该序列的核酸互补序列；
AH-R1：5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’（SEQIDNO:2），或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AV-F2：5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’（SEQIDNO:3），或者为该序列的核酸互补序列；
AV-R2：5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’（SEQIDNO:4），或者为该序列的核酸互补序列；
鮰爱德华氏菌引物组的核酸序列如下：
EI-F3：5’-CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’（SEQIDNO:5），或者为该序列的核酸互补序列；
EI-R3：5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’（SEQIDNO:6），或者为该序列的核酸互补序列。
3）多重PCR扩增条件为：94~96℃预变性3~6min，94~95℃变性45~55s，55~60℃退火25~35s，72℃延伸50~60s，进行28~35个循环后，然后再72℃温度延伸7~10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存；
4）PCR产物检测：将PCR扩增产物进行电泳、凝胶成像观察，若有1091bp的条带说明样品中有嗜水气单胞菌，若有262bp的条带说明样品中维氏气单胞菌，若有450bp的条带说明样品中有鮰爱德华氏菌，若这种大小的条带都不存在，说明样品中嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌这三种菌为阴性。
优选的，步骤1）所述的DNA模板制备的具体操作为：将待测水产动物的组织匀浆液750~850g离心4~6min，取上清，9000~11000g离心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE缓冲液，95~100℃处理8~12min；9000~11000g离心8~12min，收集上清液即待测DNA模板。
优选的，步骤2）所述的2×mix含有TaqDNAPolymerase,2×TaqPCRBuffer,3mMMgCl2和400μMdNTP。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1：
（1）多重PCR引物组
本发明前期通过引物设计原则并结合实际情况，分别设计出大量检测嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华氏菌的引物，然后通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异的引物序列，最终选取检测这三种病原菌的PCR引物分别如下所示：
其中，嗜水气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AH-F1：5’-CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’（SEQIDNO:1）
AH-R1：5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’（SEQIDNO:2）
维氏气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AV-F2：5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’（SEQIDNO:3）
AV-R2：5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’（SEQIDNO:4）
鮰爱德华氏菌引物组的核酸序列如下：
EI-F3：5’-CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’（SEQIDNO:5）
EI-R3：5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’（SEQIDNO:6）
（2）单基因PCR反应体系和反应条件的建立
首先通过单基因特异性PCR，初步探索每对引物组扩增对应基因片段的反应体系和反应条件。
分别提取的三种病原菌（嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌）的基因组DNA作为各自引物组的扩增模板，通过多次实验发现，各对引物组分别在以下的反应体系和条件下可以很好地扩增出对应的基因片段。
1）嗜水气单胞菌单基因特异性PCR反应体系和条件
PCR反应体系：
2×mix25μL
10μmol/LAH-F11μL
10μmol/LAH-R11μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后72℃终延伸10min。
2）维氏气单胞菌单基因特异性PCR反应体系和条件
反应体系：
2×mix25μL
10μmol/LAV-F21μL
10μmol/LAV-R21μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后72℃终延伸10min。
3）鮰爱德华菌单基因特异性PCR反应体系和条件
反应体系：
2×mix25μL
10μmol/LEI-F3：1μL
10μmol/LEI-R3：1μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后72℃终延伸10min。
通过上述单基因PCR特异性试验，三种细菌的基因组DNA均能较好地扩增出相应的目的片段。
（3）多重PCR反应体系和反应条件的初探试验
在单基因特异性PCR反应的基础上，将三种细菌的DNA模板混合，运用3对特异性引物，建立多重PCR检测方法，研究其最佳反应条件。
为了解3对引物组同时扩增其目的基因时，引物内部间的相互影响，预先将引物的最终浓度都定为0.2μM，按如下反应体系及反应条件同时进行扩增。
1）多重PCR初探试验反应体系
2×mix5μL
10μmol/L的6种引物各1μL
3种DNA模板各1μL
ddH2O加至50μL；
2）多重PCR初探试验反应条件
95℃预变性4min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后72℃终延伸10min。
多重PCR检测结果结果表明3个目的片段均能同时被扩增，无非特异性条带产生；其中引物组AH-F1和AH-R1、EI-F3和EI-R3的扩增的效果较好，而AV-F2和AV-R2引物组的扩增效果相对稍差。
接下来对的多重PCR反应体系和条件作进一步的优化。
（4）多重PCR反应体系和反应条件的优化
1）引物浓度的优化
根据上述初探试验的结果，在反应体系中，保持引物AH-F1和AH-R1浓度不变，分别调整另外2对引物浓度，将其加入量逐渐调高为：0.3μM，0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，进行多重PCR扩增。
多重PCR的检测结果表明：当引物EI-F3和EI-R3浓度均为0.4μM时，其扩增效果最好；而AV-F2和AV-R2引物组的扩增效果稍差，需要对AV-F2和AV-R2引物组浓度进行优化。
固定引物AH-F1和AH-R1、EI-F3和EI-R3浓度分别为0.2μM和0.4μM不变，逐次提高引物AV-F2和AV-R2的浓度，对多重PCR的AV-F2和AV-R2引物浓度进行优化。
多重PCR的检测结果表明：当引物AV-F2和AV-R2的浓度调高至0.6μM时，其扩增效果明显提高。
总合以上实验结果，多重PCR检测体系中3对引物的最佳浓度为：AH-F1和AH-R1为0.2μM，AV-F2和AV-R2为0.6μM，EI-F3和EI-R3为0.4μM。
2）退火温度的优化
由于3对引物设计时，其适合退火温度为55～60℃，因此，运用优化后的引物浓度，在温度梯度PCR仪中设置温度梯度，进行多重PCR扩增。结果表明当多重PCR的退火温度为55～60℃，3对引物的扩增效果均较好，优其是59℃的退火温度效果最佳，综合考虑，将其最适退火温度设定为59℃。
（5）建立一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法
1）DNA模板的制备：取水产动物的组织匀浆液置于1.5mL的离心管中，800g离心5min，除去组织碎片取上清置于1.5mL灭菌离心管中；10000g离心10min，除去上清液，加入100μL0.1M的TE缓冲液，100℃沸水浴10min；10000g离心10min，上清液即待检测DNA模板；
2）建立多重PCR扩增体系，如下所示：
2×mix25μL
10μmol/LAH-F11μL
10μmol/LAH-R11μL
10μmol/LAV-F23μL
10μmol/LAV-R23μL
10μmol/LEI-F32μL
10μmol/LEI-R32μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL；
扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性50s，59℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后再72℃温度延伸10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。
3）PCR产物检测：被检测样品的PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色；电泳结果在紫外分析仪下观察PCR扩增产生DNA片段大小。
若有1091bp的条带说明样品中有嗜水气单胞菌，若有262bp的条带说明样品中维氏气单胞菌，若有450bp的条带说明样品中有鮰爱德华氏菌，若这三种大小的条带都不存在，说明样品中嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌为这三种菌为阴性。
下面对本发明建立的同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法作进一步的效果检测。
一、特异性试验
（1）单基因PCR法检测特异性
将提取的三种病原菌的基因组DNA作为单项PCR的扩增模板，同时设计多种细菌的DNA对照组，特异PCR扩增时的DNA对照组为霍乱弧菌F2，溶藻弧菌Ecgy0608，海豚链球菌ATCC29177，无乳链球菌XQ-1，弗氏柠檬酸杆菌HD1003，迟缓爱德华氏菌1101，鰤鱼诺卡氏菌O12L1，舒氏气单胞菌WL-1，温和气单胞菌Pt141，柱状黄杆菌G4这10种常见水生动物病原菌。
以设计的特异性引物进行PCR扩增，其反应体系及PCR扩增条件如下：
1）嗜水气单胞菌特异PCR
反应体系：
2×mix25μL
10μmol/LAH-F11μL
10μmol/LAH-R11μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃变性50s，59℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后再72℃温度延伸10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。
对上述PCR产物进行检测，检测结果如图1所示，从图中可以看出本发明的嗜水气单胞菌PCR引物只对嗜水气单胞菌具有扩增现象，对其他常见水生动物病原菌不具有扩增现象。
2）维氏气单胞菌特异PCR
反应体系：
2×mix25μL
10μmol/LAV-F21μL
10μmol/LAV-R21μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃变性50s，59℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后再72℃温度延伸10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。
对上述PCR产物进行检测，检测结果如图2所示，从图中可以看出本发明的维氏气单胞菌PCR引物只对维氏气单胞菌具有扩增现象，对其他常见水生动物病原菌不具有扩增现象。
3）鮰爱德华菌特异PCR
反应体系：
2×mix25μL
10μmol/LEI-F31μL
10μmol/LEI-R31μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃变性50s，59℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后再72℃温度延伸10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。
对上述PCR产物进行检测，检测结果如图3所示，从图中可以看出本发明的鮰爱德华菌PCR引物只对鮰爱德华菌具有扩增现象，对其他常见水生动物病原菌不具有扩增现象。
上述结果说明本发明的引物对嗜水气单胞菌XS9141、鮰爱德华菌HSN-1、维氏气单胞菌IB340三种细菌的基因组DNA均能扩增出相应的目的片段，而对照组无扩增产物出现，说明本发构建的这种可同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法具有很好的特异性。
（2）多重PCR法检测特异性
分别准备以下样品：
样品1含有嗜水气单胞菌XS9141、鮰爱德华菌HSN-1、维氏气单胞菌IB340；温和气单胞菌Pt141、舒氏气单胞菌WL-1、迟缓爱德华氏菌1101。；
样品2含有嗜水气单胞菌XS9141，维氏气单胞菌IB340；
样品3含有嗜水气单胞菌XS9141，鮰爱德华菌HSN-1；
样品4含有维氏气单胞菌IB340，鮰爱德华菌HSN-1；
样品5含有嗜水气单胞菌XS9141；
样品6含有维氏气单胞菌IB340；
样品7含有鮰爱德华菌HSN-1；
样品8含有温和气单胞菌Pt141、舒氏气单胞菌WL-1、霍乱弧菌F2、溶藻弧菌Ecgy0608、迟缓爱德华氏菌1101。
分别提取上述各样品中病原菌的DNA作为多重PCR模板，以实施例1中（5）建立的多重PCR检测方法对各样品进行多重PCR检测。
检测结果如图4所示，从图中可以看出本发明的多重PCR检测方法可以同时对嗜水气单胞菌、鮰爱德华菌、维氏气单胞菌进行特异性检出；不受其他水生动物常见病原菌的干扰，本发明建立的多重PCR检测方法特异性强。
二、敏感性试验
取28℃培养20h的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华氏菌菌液，参照国标法（GB/T4789.2-2003）进行细菌计数，三种菌的浓度分别为嗜水气单胞菌：2×108cfu/mL、维氏气单胞菌：3×108cfu/mL、鮰爱德华氏菌3×108cfu/mL。上述的菌液离心收集菌体，然后提取基因组DNA，对基因组DNA进行系列梯度稀释，分别稀释为101、102、103、104、105、106和107倍，以实施例1中（5）建立的多重PCR检测方法进行多重PCR检测。
检测结果如图5～7所示，本发明的检测方法对稀释106倍的菌液合仍能检出，可见本发明的多重PCR检测对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华氏菌三种病原菌的检测限分别可达200cfu/mL、300cfu/mL、300cfu/mL。
三、重复性试验
对嗜水气单胞菌、鮰爱德华菌、维氏气单胞菌阳性模板，分13批次进行本发明的多重PCR扩增，观察多重PCR检测方法的稳定性。结果显示阳性模板均能扩增出特异性目的条带，表明该多重PCR检测方法稳定，重复性良好，有较好的临床应用价值。
四、临床运用
（1）材料与方法
样本的采集：使用采集袋，采集了湖北某养殖场的斑点叉尾鮰、草鱼样品50份，编号，待检。
（2）方法
1）传统常规检测方法：对组织病料进行病原菌的分离纯化，培养，进行常规生理生化鉴定，和用16SrRNA通用引物进行PCR鉴定。
2）本发明多重PCR检测：见实施例1中（5）所述。
（3）结果
50份待检样本中，采用本发明的多重PCR方法同时检出嗜水气单胞菌和鮰爱德华氏菌的样品有2份；同时检出嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的样品有1份；单一检出嗜水气单胞菌、鮰爱德华氏菌和维氏气单胞菌的样品分别有31份、2份和14份，该结果与传统常规检测法（细菌分离鉴定）的结果完全吻合。
<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120>一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及检测方法
<130>
<160>6
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工引物
<400>1
cagcgtccaatacctggtgtta22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工引物
<400>2
gcgggtacgacgcaccttgc20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工引物
<400>3
agccaagcaggatctggtgaag22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工引物
<400>4
cttgttgaactcggggctcgct22
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工引物
<400>5
ccaattacgtgaggatacggcg22
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工引物
<400>6
ccccggcggttatacagacg20

Claims (6)

1.一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组，其核苷酸序列分别如下所示：
嗜水气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AH-F1：5’-CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’（SEQIDNO:1），或者为该序列的核酸互补序列；
AH-R1：5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’（SEQIDNO:2），或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌引物组的核酸序列如下：
AV-F2：5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’（SEQIDNO:3），或者为该序列的核酸互补序列；
AV-R2：5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’（SEQIDNO:4），或者为该序列的核酸互补序列；
鮰爱德华氏菌引物组的核酸序列如下：
EI-F3：5’-CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’（SEQIDNO:5），或者为该序列的核酸互补序列；
EI-R3：5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’（SEQIDNO:6），或者为该序列的核酸互补序列。
2.一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）DNA模板的制备；
2）多重PCR扩增体系如下：
2×mix23~27μL
10μmol/LAH-F11~3μL
10μmol/LAH-R11~3μL
10μmol/LAV-F21~3μL
10μmol/LAV-R21~3μL
10μmol/LEI-F31~3μL
10μmol/LEI-R31~3μL
DNA模板1~2μL
ddH2O加至50μL；
上述引物AH-Fl、AH-Rl、AV-F2、AV-R2、EI-F3和EI-R3的碱基序列如权利要求1所述；
3）多重PCR扩增条件为：94~96℃预变性3~6min，94~95℃变性45~55s，55~60℃退火25~35s，72℃延伸50~60s，进行28~35个循环后，然后再72℃温度延伸7~10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存；
4）PCR产物检测：将PCR扩增产物进行电泳、凝胶成像观察，若有1091bp的条带说明样品中有嗜水气单胞菌，若有262bp的条带说明样品中维氏气单胞菌，若有450bp的条带说明样品中有鮰爱德华氏菌，若这种大小的条带都不存在，说明样品中嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌这三种菌为阴性；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，其特征在于：步骤1）所述的DNA模板制备的具体操作为：将待测水产动物的组织匀浆液750~850g离心4~6min，取上清，9000~11000g离心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE缓冲液，95~100℃处理8~12min；9000~11000g离心8~12min，收集上清液即待测DNA模板。
4.根据权利要求2所述的一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，其特征在于：步骤2）所述的多重PCR扩增体系为：
2×mix25μL
10μmol/LAH-F11μL
10μmol/LAH-R11μL
10μmol/LAV-F23μL
10μmol/LAV-R23μL
10μmol/LEI-F32μL
10μmol/LEI-R32μL
DNA模板1μL
ddH2O加至50μL。
5.根据权利要求2或4所述的一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述的2×mix含有TaqDNAPolymerase,2×TaqPCRBuffer,3mMMgCl2和400μMdNTP。
6.根据权利要求2所述的一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，其特征在于：步骤3）所述的多重PCR扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性50s，59℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环后，然后再72℃温度延伸10min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。
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