CN106702029A

CN106702029A - 一种同步检测5种西瓜病毒的多重rt‑pcr方法及其应用

Info

Publication number: CN106702029A
Application number: CN201710155415.XA
Authority: CN
Inventors: 李莉; 冯耿; 王锡锋; 刘文文
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2037-03-16
Also published as: CN106702029B

Abstract

本发明属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，公开了一种同步检测5种西瓜病毒的多重PCR方法，该PCR体系中含有5对特异性引物(SEQ ID NO1～10)，在一个PCR体系中同步对5种病毒进行扩增，得到了1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的特异性条带，建立并优化了能同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV的多重RT‑PCR反应体系。检测结果表明优化后的多重RT‑PCR反应体系能对田间样品进行快速、高效地、准确的检测。对监测西瓜上CiLCV等5种常见病毒病在田间的发生情况以及病害流行预测具有十分重要的意义。

Description

一种同步检测5种西瓜病毒的多重RT-PCR方法及其应用

技术领域

本发明属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，特别是涉及一种反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的体系及其应用，利用该体系可通过一次PCR检测5种侵染西瓜的RNA病毒，达到准确、快速、高效检测的目的。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)是葫芦科西瓜属植物，为夏季水果，果肉鲜甜多汁，能降温去暑；种子含油，可作消遣食品；果皮可药用，有清热、利尿、降血压的功效。自1978年以来，世界西瓜生产持续发展，种植面积、总产量和单产均有大幅提高。据联合国粮食与农业组织统计数据库(FAOSTAT)2013年的数据，全世界共有117个国家种植西瓜，西瓜的种植总面积和产量分别为348.921万公顷和10927.87万吨,位列水果的第7位和第1位；我国是最大的西瓜生产国，2013年种植面积和产量分别为183.98万公顷和7318.88万吨，占全世界52.73％和66.97％。

随着西瓜种植面积的不断扩大，种植区气候和耕作制度的变化，西瓜病毒病的发生呈现逐年上升趋势，重病田发病率约为30～50％,甚至高达85％，严重影响了西瓜的产量、品质以及农民的种植积极性。目前在我国能够引起西瓜病毒病害的主要病原有：马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)，烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus,TMV)，马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的甜瓜蚜传黄化病毒(Melonaphid-borne yellows virus,MABYV)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)的南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)以及丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)的西瓜潜隐病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)。在自然条件下，西瓜植株受到2种或2种以上病毒复合侵染的情况非常普遍，往往会导致病害症状复杂，难以识别病原种类，给病害早期诊断、监测预警和田间有效防控带来极大的困难。2015和2016年在河南开封西瓜田发生了严重的病毒病害，经小RNA深度测序和PCR鉴定发现存在CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV 5种病毒单一或两种以上病毒不同组合的复合侵染型，最多5种病毒可以同时侵染一株西瓜苗。但由于小RNA深度测序成本昂贵，且需要较高的生物信息学分析技能，难以大规模应用于生产实践。因此生产上急需一种快速、准确、简单、易操作的方法同时鉴别多种病毒病原。

随着分子生物学技术的长足发展，基于核酸操作的多项技术在病毒病害的检测中发挥了巨大的作用，如多聚酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、基因芯片、核酸等温扩增等技术可同时检测多个靶标病原物，具有快速、准确、样品消耗少等特点。多重PCR(multiplex PCR)技术因其快速、灵敏、准确等优点已被广泛应用于病毒、细菌、真菌等病原物的检测和鉴定，为病害的早期诊断发挥着巨大的作用。多重PCR是指在同一个PCR反应体系中同时加入两种或两种以上的靶标病原物的核苷酸模板和特异性引物对，通过一次扩增反应获得大小不同的两种或两种以上的目的基因片段，从而同时区别两种或两种以上靶标病原物。基于此原理，本发明建立了CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5种病毒的一步法RT-PCR检测体系，该体系可以准确、高效、快速的鉴定田间自然发病的西瓜标样，为西瓜病害的早期诊断和鉴定提供手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于同步检测五种侵染西瓜的病毒病原的方法。该方法能够准确、高效、灵敏的同时检测多种西瓜病毒病原。

一种同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种西瓜病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物对：

扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，

SEQ ID NO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；

扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，

SEQ ID NO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；

扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，

SEQ ID NO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；

扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；

扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；

SEQ ID NO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′。

所述PCR体系中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV引物的摩尔比为3：4：4：3：3。

所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA 2μL、10mmol/L dNTPs 3μL、rTaq 5U、25mmol/L的MgCl₂1.5μL以及10μmol/L的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上下游引物分别为0.3μL、0.4μL、0.4μL、0.3μL、0.3μL。

所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3分钟；按照以下条件进行40个循环：94℃变性30秒、55℃复性45秒、72℃延伸90秒；循环结束再72℃延伸10分钟。

上述方法在同步检测农作物五种西瓜病毒病原CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV中的应用。

所述农作物为西瓜。

一种检测试剂盒，含有上述五对引物。

本发明提供的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒的特异性引物对，通过RT-PCR分别可以获得1464bp，1023bp，810bp，600bp和327bp的单一的特异性条带。通过对PCR反应体系和条件的优化，建立了同步检测上述五种病毒的多重RT-PCR体系，突破了同步检测侵染西瓜的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等五种病毒的技术瓶颈，也可以为其他病毒病原的鉴定提供借鉴。具体发明内容涉及到：1)病毒RNA的提取；2)特异性引物对的设计和特异性分析；3)五种病毒的单重PCR鉴定体系；4)多重PCR检测体系的建立与优化；5)多重PCR体系灵敏度的测定；6)多重PCR体系在田间样品检测中的应用。本发明的多重PCR的最佳体系和条件经优化确定为：10mmol/L dNTPs 3μL、rTaq 5U、25mmol/L MgCl₂1.5μL，以及55℃的退火温度。多重PCR扩增的最佳反应条件为：94℃预变性3分钟；按照94℃变性30秒、55℃复性45秒、72℃延伸90秒循环40次；最后72℃延伸10分钟。

所述五种病毒的特异性引物对可作为组合同步检测西瓜上的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒，PCR检测均能获得单一的特异性条带，可以用于鉴定五种西瓜病毒病原。

该检测方法可制作成试剂盒，用于检测五种病毒病原。

相比于现有技术，本发明具有以下优点：

1.本发明首次提出在西瓜上同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒病原，其中CiLCV为本实验报道的我国新纪录种，国内尚未见其检测方法的报道(Xin et al.，Virus research，2017，232：106-112)；

2.本发明设计的检测引物对具有特异性和兼容性，可以同时扩增同一植株中的五种病毒；

3.本发明优化了PCR扩增的反应体系和条件，在保证检测结果准确的前提下，极大地缩短了检测时间，提高了检测效率；

4.本发明反应体系灵敏性好，该多重PCR体系的检测底线是10^-2cDNA，可用于西瓜上五种病毒病害的早期监测预警。

5.本发明是在同一个PCR体系中经过一次扩增反应完成，既节约了病毒RNA和PCR扩增体系种的各种试剂，最大程度的降低了检测成本，节约了人力和时间。

附图说明

图1.五种病毒特异性引物的特异性示意图.1a为引物对CiLCV-F(SEQ ID NO.1)/CiLCV-R(SEQ ID NO.2)的Primer-Blast检索结果；1b为引物对CGMMV-F(SEQ ID NO.3)/CGMMV-R(SEQ ID NO.4)的Primer-Blast检索结果；1c为引物对ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)的Primer-Blast检索结果；1d为引物对MABYV-F(SEQ ID NO.7)/MABYV-R(SEQ ID NO.8)的Primer-Blast检索结果；1e为引物对WMV-F(SEQ ID NO.9)/WMV-R(SEQ ID NO.10)的Primer-Blast检索结果。

图2.五种病毒特异性引物的特异性检测

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000 DNA Marker)，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和 250bp；泳道1为以CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV、WMV、TMV和CMV等7种病毒的混合RNA为模板，本发明设计的五对病毒引物的RT-PCR扩增结果；泳道2为以CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5种病毒的混合RNA为模板，本发明设计的五对病毒引物的RT-PCR扩增结果；泳道3为健康植株；泳道4～10分别为CiLCV、ZYMV、CGMMV、MABYV、WMV、TMV和CMV等7种病毒的阳性对照。

图3.五种病毒特异性引物的单重PCR扩增结果

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker)，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和 250bp；泳道2为健康植株的扩增结果(阴性对照)，未扩增到如何条带；泳道2～6分别为西瓜标样中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV的特异性条带。

图4.五种病毒特异性引物的兼容性PCR扩增结果

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1为以五种病毒复合侵染的西瓜植株的总RNA为模板，用五种病毒的特异性引物同时扩增的结果；泳道2为健康植株；泳道3～7分别为CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒特异性引物的扩增结果。

图5.多重PCR体系的优化

A:退火温度的优化，泳道1～4分别为51℃、53℃、55℃和57℃；B:dNTPs用量的优化，泳道1～5分别为2μL、3μL、4μL、5μL和6μL；C:rTaq用量的优化，泳道1～5分别为2.5U、3.75U、5U、6.25U和7.5U；图中M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp。

图6.多重PCR体系的灵敏度测定

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1～5的cDNA浓度分别为10^-1～10^-4。

图7.应用多重PCR体系检测田间西瓜标样

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1～10分别为田间西瓜植株标样。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面所用试剂均为市售。

实施例1.西瓜叶组织总RNA的提取

采用美国Invitrogen公司的TRIzol试剂提取健康及被CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5种病毒复合侵染的西瓜植株的总RNA。操作步骤如下：1)取新鲜或冰冻的西瓜叶片加液氮充分研磨后，迅速转移100mg干粉组织至1.5ml经DEPC水处理的无菌离心管中；2)加入1mL TRIzol试剂、充分摇匀，室温静置5分钟；3)加入0.2mL氯仿，剧烈摇动15秒，室温静置3分钟；12000g/4℃下离心15分钟；4)取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，冰浴10分钟；12000g/4℃下离心15分钟，去上清；5)沉淀中加入1mL预冷的75％乙醇(无菌DEPC水配制)洗涤，7500g/4℃下离心5分钟，重复洗涤沉淀3次；6)干燥沉淀，加50μL DEPC水溶解，此即为西瓜的总RNA溶液。7)将总RNA溶液稀释50倍，用紫外分光光度计测定260nm和280nm的OD值，计算RNA样品的纯度和含量，按260nm处1OD约为单链RNA 40μg/mL计算RNA含量，合格样品直接使用或-70℃保存、备用。

实施例2.五种病毒特异性引物的设计

根据NCBI公布的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5种病毒的核苷酸序列，采用Vector NTI软件分别设计每种病毒的特异性引物对，每对引物退火温度相似(51.9℃～59.9℃)，具有一定的保守性，扩增产物不形成二级机构，GC含量在40％-60％之间；五对引物之间碱基不互补，引物由上海生物工程有限公司合成(5种病毒的特异性引物情况见表1)。

表1.CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒的特异性引物

实施例3.五种病毒引物的特异性分析

利用实施例2中所设计的5对引物分别可以通过RT-PCR检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5种病毒。与CiLCV同属于丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)的其余5种病毒分别是甜菜潜隐病毒2号(Beet cryptic virus 2，BCV2)、甜菜潜隐病毒3号(Beetcryptic virus 3，BCV3)、无花果隐病毒(Fig cryptic virus，FCV)、辣椒隐病毒1号(Pepper cryptic virus 1，PCV1)和辣椒隐病毒2号(Pepper cryptic virus 2，PCV2)，均未见侵染西瓜的报道。同样与MABYV同属于马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的另外16种病毒，也皆未见有侵染西瓜的报道。而ZYMV和WMV同属马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，在本体系中采用二者的引物并未扩增出对方的条带，说明二者的引物均具有唯一性。但与CGMMV同属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的TMV能够侵染西瓜，且为西瓜上常见病毒，下面本发明采用RT-PCR和数据库检索的方法证明其引物具有特异性。

为了确保本发明所设计引物的特异性，采用NCBI的在线比对软件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对实施例2中所设计引物的特异性进行了检索。检索设置扩增长度为100～2000bp，最大扩增产物长度为2000bp，检索NR(All non-redundant GenBank CDS translations+RefSeq Proteins+PDB+SwissProt+PIR+PRF)数据库的所有物种。结果显示：以CiLCV-F(SEQ ID NO.1)/CiLCV-R(SEQ ID NO.2)引物对进行Primer-Blast，仅检索到一条长度为1464bp的可能产物，属于本发明涉及的CiLCV，未检索到其它物种(如图1中1-a)；以CGMMV-F(SEQ ID NO.3)/CGMMV-R(SEQ IDNO.4)为引物对进行Primer-Blast，共检索获得长度为1023bp的可能产物55条，均属于CGMMV，未检索到其它物种(如图1中1-b)；以ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)为引物对进行Primer-Blast检索，共获得68条长度为810bp的可能产物，均属于ZYMV，未检索到其它物种(如图1中1-c)；以MABYV-F(SEQ ID NO.7)/MABYV-R(SEQ ID NO.8)进行Primer-Blast检索，共获得1条长度为600bp的可能产物，属于MABYV，除此之外未检索到其它物种(如图1中1-d)；以WMV-F(SEQ ID NO.9)/WMV-R(SEQ ID NO.10)为引物对进行Primer-Blast检索，共获得73条长度为327bp的可能产物，均属于WMV，除此之外未检索到其它物种(如图1中1-e)。

本发明还设计了与CGMMV同属的TMV以及西瓜常见病毒CMV的特异性引物，通过RT-PCR验证了引物的特异性。TMV上下游引物分别为TWV-F：5′-ATGGCTCTAGTTGTTAAAGG-3′和TWV-R：5′-TCGGCACTGACCGATCATTA-3′；CMV上游引物CMV-F序列为：5′-TTGATTCTACCGTGTGGGTG-3′，下游引物CMV-R序列为：5′-GTCCGTAACTACGTTTAGTGACTTC-3′。利用本发明所设计的5对病毒引物，分别以CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV、WMV 5种病毒RNA及加上TMV和CMV的7种病毒的RNA为模板，同时进行RT-PCR，扩增结果表明：利用本发明所设计的5种病毒引物不能扩增出TMV和CMV的目的条带，仅能扩增出CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV5种病毒的特异性条带(图2)。实验设置健康植株为阴性对照，7对引物单独扩增7种病毒为阳性对照。因此，本发明所设计的引物具有特异性，检测结果准确可信。

实施例4.五种西瓜病毒的单重RT-PCR体系

cDNA的合成：反应总体积为20μL，其中西瓜总RNA 0.5μg～1μg，10μmol/L通用引物Oligo(dT)18 2μL，DEPC处理的ddH₂O 8μL，混匀后90℃变性2～3min，置冰上2min；再依次加入5×MMLV Buffer 4μL，10mmol/L dNTPs 2μL，M-MLV反转录酶(Takara,Dalian,China)1μL以及RRI(Takara,Dalian,China)0.5μL。混匀后，37℃孵育1hr，70℃10min。即可合成cDNA。

PCR反应体系：反应总体积为25μL，其中cDNA 2μL，10×PCR Buffer(15mmol/L Mg² ⁺)2.5μL，10mmol/L dNTPs 2μL，10μmol/L的上下游引物各0.3μL，rTaq(Takara,Dalian,China)1.5U，加ddH₂O补齐25μL。扩增条件为94℃预变性3min，94℃30s、55℃45s和72℃90s共40个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，电压每厘米2伏，电泳1.5～2小时，紫外下观察照像。电泳结果显示：用CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV各自的特异性引物分别扩增获得了1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的单一条带(图3泳道2～6)。

将电泳条带回收、纯化、连接到pEASY-T5载体(北京全式金生物技术有限公司)，采用冻融法转化Trans-T1的感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，选取3个PCR阳性单克隆，经北京六合华大基因科技有限公司测序，采用Vector NTI软件比对，结果表明获得的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒序列与原参考序列相应片段的一致性分别为99.3％、98.1％、99.2％、98.9％、98.5％，均在98％以上，证明了扩增结果的正确性。

实施例5.五种病毒的多重RT-PCR体系的建立

多重PCR反应是在一个PCR反应体系中同时检测多种病毒，因此多重PCR反应体系中的RNA和引物均为多种病毒RNA和特异性引物对的混合物，其他设计如反转录酶、RNA聚合酶、dNTPs等的浓度相同。本发明中所用核苷酸模板为CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒同时侵染的西瓜植株的总RNA；引物为五种病毒特异性引物对的混合物，引物对的最佳比例为CiLCV：CGMMV：ZYMV：MABYV：WMV＝3：4：4：3：3，结果表明5对引物分别扩增到1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的单一条带，具有良好的兼容性(图4，泳道1)。

PCR反应体系的优化：本发明对不同的退火温度、dNTPs和rTaq浓度等做了优化。退火温度设置有51、53、55和57℃4个梯度；在25μL的总反应体积中，dNTPs用量设置有2、3、4、5和6μL的5个梯度，rTaq用量设置有2.5、3.75、5、6.25和7.5U的5个梯度，优化结果表明：最佳退火温度为55℃，10mM的dNTPs 3μL和rTaq 5U(如图5)。

最佳的多重RT-PCR体系为：cDNA合成反应总体积为20μL，其中西瓜总RNA 1μg，10μmol/L通用引物Oligo(dT)18 2μL,DEPC处理的ddH₂O 8μL，混匀后90℃变性1min，立刻置冰上2min；再依次加入10mmol/L dNTPs 2μL,5×MMLV Buffer 4μL，M-MLV反转录酶(Takara,Dalian,China)1μL以及RRI(Takara,Dalian,China)0.5μL。混匀后，37℃孵育1hr,70℃10min。取上述合成体系中的cDNA 2μL,10×PCR Buffer(15mmol/L Mg²⁺)2.5μL,10mmol/LdNTPs 3μL,rTaq(Takara,Dalian,China)5U，及CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上下游引物各0.3、0.4、0.4、0.3、0.3μL，加ddH₂O补齐25μL。

最佳反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、55℃退火45秒、72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，电压每厘米2伏，电泳1.5～2小时，紫外下观察照像。电泳结果显示：用BCiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV各自的特异性引物分别扩增获得了1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的单一条带(图3泳道3～6)。

实施例6.多重PCR体系的灵敏度测定

将按照实施例4获得的cDNA浓度分别稀释10，100，1000，10000倍(即10^-1-10^-4)，其他PCR扩增条件不变，结果表明当cDNA稀释10倍和100倍时均能很好的检测出CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒；当稀释1000倍时，虽然CGMMV变得清晰，但是CiLCV已经完全检测不到，ZYMV开始模糊；而当稀释到10000倍时，CiLCV和ZYMV已经完全检测不到，CGMMV也开始变得模糊。而MABYV和WMV在这四个浓度梯度下皆能检测得到(如图6)，因此，该多重PCR体系的检测底线是10^-2cDNA。

实施例7五种病毒多重RT-PCR体系的应用

我们应用本发明中所建立的多重RT-PCR体系对2015和2016年采集自河南开封的10个西瓜标样进行检测，结果表明：其中2个样品为CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种病毒的复合侵染型(图7，泳道3和6)，占检测样品的20％；2个样品为CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV四种病毒的复合侵染型(图7，泳道4和8)，占检测样品的20％；4个样品为ZYMV、MABYV和WMV三种病毒的复合侵染型(图7，泳道1、2、7和10)，占检测样品的40％；2个样品为WMV单独侵染(图7，泳道5和9)，占检测样品的20％。PCR产物的序列分析结果与参考序列相应片段的一致性均在98％以上，说明本发明建立的多重RT-PCR检测体系可用于田间标样的检测，且结果可靠。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种同步检测5种西瓜病毒的多重RT-PCR方法及其应用

<130> PP17036-ZWB

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列1

<400> 1

cattggtgga gcacaaaaca aa 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列2

<400> 2

ttgcgtctta gcctatctgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列1

<400> 3

gttgcgagga atgtgatgta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列2

<400> 4

aagactgtct gcgaacctcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列1

<400> 5

agcaaactgt ggcagacgct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列2

<400> 6

ctagtaaggt atgcatgttt 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列1

<400> 7

ttggaggtta tgcagatttt cg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列2

<400> 8

gccggtcatc agtatcaagt ct 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列1

<400> 9

tcgaatacaa gcccaatcaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列2

<400> 10

acggactttc agagtttctc 20

Claims

1.一种同步检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种西瓜病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物：

扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，

SEQ ID NO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；

扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，

SEQ ID NO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；

扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，

SEQ ID NO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；

扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；

扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；

SEQ ID NO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′。

2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR体系中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV引物的摩尔比分别为3：4：4：3：3。

3.根据权利要求2所述的方法，所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA 2μL、10mmol/L dNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mmol/L的MgCl₂ 1.5μL以及10μmol/L的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上下游引物分别为0.3μL、0.4μL、0.4μL、0.3μL、0.3μL。

4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、55℃退火45秒和72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。

5.根据权利要求1－4任一所述的方法在同步检测农作物中五种西瓜病毒病原CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述农作物为西瓜。

7.一种检测试剂盒，含有检测CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五种西瓜病毒的引物物，其分别为：

扩增CiLCV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，

SEQ ID NO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；

扩增CGMMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，

SEQ ID NO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；

扩增ZYMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，

SEQ ID NO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；

扩增MABYV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；

扩增WMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；

SEQ ID NO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′。