CN107815506A - 大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法 - Google Patents

大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107815506A
CN107815506A CN201711236362.0A CN201711236362A CN107815506A CN 107815506 A CN107815506 A CN 107815506A CN 201711236362 A CN201711236362 A CN 201711236362A CN 107815506 A CN107815506 A CN 107815506A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lamp
primer
colletotrichum truncatum
detection
isothermal amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711236362.0A
Other languages
English (en)
Inventor
杜宜新
石妞妞
阮宏椿
陈文乐
甘林
陈福如
杨秀娟
代玉立
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of FAAS
Original Assignee
Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of FAAS filed Critical Institute of Plant Protection of FAAS
Priority to CN201711236362.0A priority Critical patent/CN107815506A/zh
Publication of CN107815506A publication Critical patent/CN107815506A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种大豆炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法，专用于大豆炭疽病菌的特异性检测，属于农作物病害检测和生物技术领域，设计了一种大豆炭疽病菌LAMP检测引物，包括外引物F3和B3，以及内引物FIP和BIP，序列见SEQ ID NO.1‑4。基于该引物建立的大豆炭疽病菌检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所发明的LAMP检测引物及其检测方法能在生产实践中实现大豆炭疽病植株的快速、灵敏、准确检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为大豆炭疽病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。

Description

大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及一种大豆炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法，专用于大豆炭疽病菌的快速分子检测，同时可实现田间大豆炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。
背景技术
中国是大豆原产地，大豆既是重要的粮食作物，又是重要的油料作物，还是重要的饲料作物，在我国农业生产以及社会经济生活中都占有相当重要的地位，是人们食用植物蛋白质的主要来源之一。20世纪30年代，我国是世界上最大的大豆生产国，平均年产量超过1000万t，占世界大豆总产量的90%。然而近年来我国大豆产量徘徊不前，需求量却急剧增加，我国已经成为大豆、豆粕和豆油全面进口国，年进口量达到3000万t。
大豆炭疽病是世界上各大豆产区的重要病害之一，由平头炭疽菌[Colletotrichum truncatum（Schwein.）Andr. et Moore]引起，在我国东北、华北、华东、西北和华南各大豆产区均普遍发生，一般南方重于北方，冷凉地区发病较轻，热带和亚热带地区发病较重。其病原菌主要为害豆荚、豆秆和幼苗，造成幼苗死亡、莲秆枯死以及豆荚干枯不结粒。大豆炭疽病在全国各大豆生产区均有发生，尤其以菜用大豆发生严重，病荚率一般达到30%以上。大豆炭疽病菌在田间主要通过风雨传播，雨水飞溅是近距离传播的主要因子，而带菌种子调运是进行远距离传播的主要因子，而病害初发期是病害防治的最佳时期。因此，建立一种简便、快速、灵敏的检测方法用于大豆炭疽病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑，同时防治病害从病区向非病区传播具有重要意义。
近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，PCR（polymerasechain reaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现109-1010倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比不同的PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。目前LAMP检测已成功应用于人畜病原物、食品安全、环境安全及多种植物病原物检测的报道，但目前有关大豆炭疽病菌LAMP检测的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中对大豆炭疽病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题，本发明提供了一种大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
1.大豆炭疽病菌环介导等温扩增(LAMP)检测引物的设计
根据大豆炭疽病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对大豆炭疽病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物组合，包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），其核苷酸序列分别为：
F3：5’-ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3’；
B3：5’-TGGGGGTTTTACGGCTAGA-3’；
FIP: 5’-CGCCACTACCTTTAAGGGCCT-TTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3’；
BIP: 5’-GACCCTCTCGGAGCCTCCTT-GTCCCTCCGAATCCCAATG-3’。
2. 建立大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，包括以下步骤：
(1)从待检测样品中提取DNA；
用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测大豆植株组织是否存在大豆炭疽病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取大豆植株组织基因组DNA。
(2) 以提取待测样品DNA为模板进行LAMP扩增检测：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L的F3和B3，1.6mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mMMgSO4，1.6mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25 uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
(3)LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。
本发明的有益效果在于：
（1）特异性强、准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点，选取了6个特定区域设计了对大豆炭疽病菌具有特异扩增作用的4条LAMP引物。已经对不同地理来源的大豆炭疽病菌、大豆疫霉病菌、大豆赤霉病菌、携带大豆炭疽病菌的植物组织和健康的大豆组织进行了检测验证，只有大豆炭疽病菌和携带该病菌的大豆组织呈现阳性，说明本发明所设计的引物组合及检测方法用于检测大豆炭疽病菌准确可靠，能有效区分发生在大豆上症状特征相似的病害；
（2）灵敏度高：LAMP对大豆炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达100fg，具有很高的灵敏度；
（3）适用性广、实用性好：本发明的大豆炭疽病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的大豆组织进行检测，可实现大豆炭疽病的早期检测，即在病害显症前进行检测，防止病害的爆发流行。
（4）操作简便快速：LAMP是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，结果肉眼可视化，一般整个检测过程可在1.5小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明对大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)检测的特异性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道2为阳性对照、泳道3-5为大豆炭疽病菌，泳道6-11分别为：大豆赤霉病菌、大豆疫霉病菌、玉米小斑病菌、番茄灰霉病菌、蘑菇褐腐病菌、阴性对照；其中可视化显色结果中2-5显示绿色荧光，其他不显示。
图2为本发明环介导等温扩增(LAMP)检测方法对大豆炭疽病菌的灵敏性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道2-11的模板DNA浓度分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、阴性对照、阳性对照；其中可视化显色结果中2-8、11显示绿色荧光，其他不显示。
图3为本发明环介导等温扩增(LAMP)检测方法对大豆发病组织实用性检测结果，上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道2-7分别为大豆炭疽病菌、大豆炭疽病自然发病的大豆组织、人工接种大豆炭疽病菌发病的大豆组织、健康大豆组织、阳性对照、阴性对照；其中可视化显色结果中2-4、6显示绿色荧光，其他不显示。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物设计
根据大豆炭疽病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对大豆炭疽病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物组合，包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），其核苷酸序列分别为：
F3：5’-ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3’；
B3：5’-TGGGGGTTTTACGGCTAGA-3’；
FIP: 5’-CGCCACTACCTTTAAGGGCCT-TTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3’；
BIP: 5’-GACCCTCTCGGAGCCTCCTT-GTCCCTCCGAATCCCAATG-3’。
实施例2大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立
1.待测样品DNA的提取：
①用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA，具体步骤如下：
(1)取0.1 g菌丝粉于1.5 mL 离心管中，加入900 μL2wt.%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60 min，室温条件下，12000r/min离心15 min；
(2)取上清液700 μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000 r/min离心10 min ；
(3)取上清液500 μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000 r/min离心10min；
(4)取上清液350 μL，加入1/10 体积3 mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000 r/min离心5 min ；
(5)弃去上清液，加入700 μL 体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10 sec，4℃条件下，8000 r/min离心10 sec，晾干，加入50 μL TE缓冲液，-20℃保存备用。
②用于检测大豆植株组织是否存在大豆炭疽病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取大豆植株组织基因组DNA，具体步骤如下：
a.称取待检测的植物组织0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5 mL 离心管中，12000r/min 离心6 min，取上清液5 μl；
c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0 μL 作为PCR模板进行扩增；
2.以提取待测样品DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100 ng，12.5uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25 uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
3. LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。
实施例3大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)检测特异性测定
1.采用CTAB 法提取3株大豆炭疽病菌、大豆赤霉病菌、大豆疫霉病菌、玉米小斑病菌、番茄灰霉病菌、蘑菇褐腐病菌的基因组DNA。
2. 以提取供试菌的DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100 ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25 uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
3. LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。
4.特异性验证结果
如图1所示，3株大豆炭疽病菌显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性梯形条带，而供试其它作物病原菌和阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性梯形条带，表明本发明的LAMP引物组合可以将大豆炭疽病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于大豆病菌的特异性检测和鉴定。
实施例4大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)检测灵敏性测定
1.采用CTAB 法提取大豆炭疽病菌的基因组DNA；
2.将提取的大豆炭疽病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mMMgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
4. LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。
5.检测结果
如图2所示，显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达100fg。
实施例5发病大豆植株中大豆炭疽病菌的环介导等温扩增(LAMP)检测
1. .采用CTAB 法提取大豆炭疽病菌基因组DNA；采用NaOH 快速裂解法提取大豆植株组织基因组DNA。
2. 以提取供试样品的DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mMMgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
3. LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在大豆炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在大豆炭疽病菌。
4. 检测结果
如图3所示，大豆炭疽病菌、大豆炭疽病自然发病的大豆组织、人工接种大豆炭疽病菌发病的大豆组织、阳性对照显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，而健康大豆组织、阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性的梯形带，表明本发明LAMP引物组合和检测方法还可用于田间大豆炭疽病发病植株的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcctgttc gagcgtca 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgggggtttt acggctaga 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgccactacc tttaagggcc ttttcaaccc tcaagctctg c 41
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaccctctcg gagcctcctt gtccctccga atcccaatg 39

Claims (4)

1.一种大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物，其特征在于：所述的LAMP引物组合由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，各引物的核苷酸序列为：
F3：5’-ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3’；
B3：5’-TGGGGGTTTTACGGCTAGA-3’；
FIP: 5’-CGCCACTACCTTTAAGGGCCT-TTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3’；
BIP: 5’-GACCCTCTCGGAGCCTCCTT-GTCCCTCCGAATCCCAATG-3’。
2. 一种大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的大豆炭疽病菌LAMP引物进行LAMP反应，LAMP反应体系为25uL，反应体系包括0.2mmol/L的F3和B3，1.6mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100ng，12.5uL的LAMP反应混合液，用无菌的超纯水补足25 uL；LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min；LAMP反应混合液含40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100。
3.根据权利要求2所述的一种大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性，或采用琼脂糖凝胶电泳法判断检测结果，取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。
4.大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物在大豆炭疽病的早期诊断和病菌监测和鉴定中的应用。
CN201711236362.0A 2017-11-30 2017-11-30 大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法 Pending CN107815506A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711236362.0A CN107815506A (zh) 2017-11-30 2017-11-30 大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711236362.0A CN107815506A (zh) 2017-11-30 2017-11-30 大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107815506A true CN107815506A (zh) 2018-03-20

Family

ID=61606667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711236362.0A Pending CN107815506A (zh) 2017-11-30 2017-11-30 大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107815506A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110093449A (zh) * 2019-06-06 2019-08-06 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种检测橡胶灵芝菌的lamp引物组合物及其检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593502A (zh) * 2015-01-21 2015-05-06 南京农业大学 一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用
CN104611428A (zh) * 2015-01-21 2015-05-13 南京农业大学 一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用
CN105063226A (zh) * 2015-09-08 2015-11-18 福建省农业科学院植物保护研究所 菜用大豆炭疽病菌特异性pcr检测引物及其检测方法
CN107574259A (zh) * 2017-10-26 2018-01-12 福建省农业科学院植物保护研究所 检测菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增引物及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593502A (zh) * 2015-01-21 2015-05-06 南京农业大学 一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用
CN104611428A (zh) * 2015-01-21 2015-05-13 南京农业大学 一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用
CN105063226A (zh) * 2015-09-08 2015-11-18 福建省农业科学院植物保护研究所 菜用大豆炭疽病菌特异性pcr检测引物及其检测方法
CN107574259A (zh) * 2017-10-26 2018-01-12 福建省农业科学院植物保护研究所 检测菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增引物及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何培新: "《高级微生物学》", 31 August 2017, 中国轻工业出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110093449A (zh) * 2019-06-06 2019-08-06 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种检测橡胶灵芝菌的lamp引物组合物及其检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106434993B (zh) 用于检测黄瓜枯萎病菌的lamp引物组合物及其应用
Hietala et al. The invasive ash dieback pathogen Hymenoscyphus pseudoalbidus exerts maximal infection pressure prior to the onset of host leaf senescence
CN107760795B (zh) 一种快速检测茶树炭疽病菌的lamp引物及检测方法
CN107815505A (zh) 一种香蕉炭疽病菌lamp检测引物组及其检测方法
CN107699634A (zh) 一种芦笋茎枯病菌lamp检测引物组及其检测方法
CN110951838A (zh) 基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用
CN104313128B (zh) 基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物
CN106755339B (zh) 黄瓜炭疽病菌lamp检测引物及其应用
CN106868182B (zh) 特异引物对及其在检测水稻对白叶枯病抗性中的应用
CN107723381A (zh) 香蕉冠腐病菌lamp检测引物及其检测方法
CN108546772A (zh) 玉米大斑病菌lamp检测引物及其快速检测方法和应用
CN104513861B (zh) 转基因大豆mon89788及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法
CN106636378B (zh) 用于检测番茄晚疫病菌的lamp引物组合物和应用
CN106381341A (zh) 一种芋疫霉菌巢式pcr检测引物及其应用
CN107815506A (zh) 大豆炭疽病菌的环介导等温扩增检测引物及检测方法
CN111850155A (zh) 特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用
CN107815504A (zh) 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法
CN112322768A (zh) 一种沙棘枝干枯萎病诊断及病原菌的快速rpa检测方法
CN106282386A (zh) 一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法
CN106399529B (zh) 一种香蕉黑星病菌分子检测引物及检测方法
CN104293957B (zh) 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
CN105755122A (zh) 一种甘薯蔓割病菌分子检测引物及快速检测方法
CN104328205B (zh) 谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立
CN107674924A (zh) 一种香蕉黑星病菌lamp检测引物及其应用
CN107723380A (zh) 一种甘薯蔓割病菌lamp检测引物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180320

RJ01 Rejection of invention patent application after publication