CN104975109A - 葡萄炭疽病菌lamp检测引物组及其检测方法 - Google Patents

葡萄炭疽病菌lamp检测引物组及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组及其检测方法，属于果树病害检测、鉴定及防治技术领域,设计了一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，序列如SEQ ID NO.1-4所示，经恒温扩增和加入荧光显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到亮绿色荧光或出现梯形条带。本发明的LAMP检测引物组及其检测方法可用于葡萄植株和果实中葡萄炭疽病菌的检测，同时可用于田间葡萄炭疽病的早期诊断和病原菌的监测与鉴定，为葡萄炭疽病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组及其检测方法
技术领域
    本发明涉及一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组及其检测方法，专用于葡萄炭疽病菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间葡萄炭疽病的早期诊断和病原菌的监测与鉴定，属于果树病害检测、鉴定及防治技术领域。
背景技术
葡萄炭疽病(Elsinoe ampelina)是引起果实腐烂的重要真菌病害之一，其病原是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）。美国于1891年最先报道葡萄炭疽病害，之后在世界很多地区均发现该病害。葡萄感染病原菌后，不仅造成产量严重减少，而且品质也受到严重影响。早期研究认为葡萄炭疽病是由胶孢炭疽菌感染引起的，随后在美国、日本和澳大利亚等的研究发现尖孢炭疽菌也可侵染葡萄引起葡萄炭疽病。
目前对葡萄炭疽病菌的检测大多仍沿用传统的分离培养及鉴定方法，然而，传统检测法耗时、耗力、效率低，且要求操作者具备专业的病原菌分离技术和丰富的形态学鉴定知识与经验。葡萄炭疽病菌从感染到发病有一个相当长的潜伏期，容易因低效的检测方法而错过早期诊断和防治的最佳时机。因此，探索一套快速、准确、灵敏、特异的葡萄炭疽病菌检测技术，做好葡萄炭疽病的早期诊断，对防止该病害传播具有极其重要的意义。
PCR技术能够较快速、准确地检测出病原，但需要特定的仪器设备且检测成本较高，不适宜基层检验检疫部门田间大规模应用，致使田间病情无法得到及时、准确的检测和有效的控制。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是由Notomi等于2000年开发的一种高效的核酸恒温扩增方法。LAMP反应在等温条件下，短时间内实现产物的大量扩增，具有很高的特异性和灵敏度，且操作步骤简便，检测结果可由肉眼判断，因此更适合于基层检验检疫部门开展工作，具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，葡萄炭疽病菌LAMP检测国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，本发明的第一个目的是提供一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，本发明的第二个目的是提供葡萄炭疽病菌LAMP检测方法。本发明的检测方法经一次恒温扩增，就可以达到快速检测葡萄炭疽病菌的目的，检测结果可靠、灵敏度高、特异性强且易于操作，可用于田间葡萄炭疽病的早期诊断和病原菌的监测与鉴定，为葡萄炭疽病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。
为了实现上述第一个目的，本发明采用以下技术方案：
葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组设计
从GenBank中下载葡萄炭疽病菌ITS序列（登录号：AB218993.1），根据葡萄炭疽病菌ITS序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物组，包括1对外引物(TJ-F3 和 TJ-B3) 和 1对内引物 (TJ-FIP 和 TJ-BIP)，引物序列分别为：
TJ-F3：5′-ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3′
TJ-B3：5′-TCCGAGGTCAACCTTTGGAA-3′
TJ-FIP：5′-GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3′
TJ-BIP：5′-CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC-3′
为了实现上述第二个目的，本发明采用以下技术方案：
葡萄炭疽病菌LAMP检测方法，该方法包括以下步骤：
（1）按常规方法提取葡萄炭疽病菌基因组DNA；
（2）葡萄炭疽病菌LAMP检测反应体系，所述的LAMP反应体系25 μL：包括引物组5μM TJ-F3、5μM TJ-B3、40μM TJ-FIP和40μM TJ-BIP各1μL，12.5.0μL反应混合液，1μL荧光显色剂，1μL（8U）BstDNA 聚合酶，50ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 μL。混匀，进行恒温扩增，后灭活。
（3）所述恒温扩增温度范围为61℃~65℃，反应时间60 ~70min，82℃灭活10min；
（4）LAMP反应结果检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应前于反应液中加入1μL荧光显色剂，所述荧光显色剂为1.25mM钙黄绿素和12.5mM氯化锰混合液，观察到亮绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，无扩增条带则判断为阴性。
所述的反应混合液中含有12 mmol/L MgSO4、2mmol/L dNTPs、1.6mol/L Betaine、2% TWeen-20、5 μL 10×Thermopol Buffer。
有益效果：本发明方法适用于发病植株或果实中葡萄炭疽病菌的高灵敏度快速分子检测和鉴定，对葡萄炭疽病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：
1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物组，已对中国福建、江西和北京等地的葡萄炭疽病菌进行了测试验证，因此充分保证检测结果的可靠性；
2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物组是针对葡萄炭疽病菌ITS序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，因此大大提高了检测特异性。
3、灵敏度高： LAMP对葡萄炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到500fg。
4、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物组，可用于带葡萄炭疽病菌的植株和果实的高灵敏度快速检测和鉴定，具有很强的实用性；
5、操作简单：应用本发明方法，可在数小时内完成对带葡萄炭疽病菌的植株和果实的检测，检测结果准确可靠。LAMP检测在等温条件下进行，只需一个恒温水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备、操作步骤和昂贵的分子试剂，检测结果肉眼可直接观察。
附图说明
图1为本发明葡萄炭疽病菌LAMP特异性检测结果图。其中：M为DL 2000 DNA marker，1为阳性对照，2为阴性对照，3-7为葡萄炭疽病菌， 8-11为其他真菌和卵菌。
图2为本发明葡萄炭疽病菌LAMP灵敏度检测结果图。其中：M为DL 2000 DNA marker， 1–8分别为50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg, 5pg, 500 fg, 50 fg和 5fg。
图3为本发明发病果实检测结果图。其中：M为DL 2000 DNA marker，1为阳性对照，2为阴性对照，3-5为发病果实，6-8为健康果实。
具体实施方式
本发明的技术内容包括葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，LAMP引物及其序列分别为：
TJ-F3：5′-ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3′
TJ-B3：5′-TCCGAGGTCAACCTTTGGAA-3′
TJ-FIP：5′-GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3′
TJ-BIP：5′-CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC-3′
利用LAMP引物组检测葡萄炭疽病菌显色结果可观察到亮绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带。
实施例1：LAMP引物对葡萄炭疽病菌的特异性扩增
1．葡萄炭疽病菌的LAMP特异检测
①LAMP反应体系25 μL：包括引物组5μM TJ-F3、5μM TJ-B3、40μM TJ-FIP和40μM TJ-BIP各1μL，12.5μL反应混合液，1μL荧光显色剂，1μL（8U）BstDNA 聚合酶，50ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 μL。
LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。
②在LAMP反应前于反应液中加入1μL荧光显色剂，所述荧光显色剂为1.25mM钙黄绿素和12.5mM氯化锰混合液，观察到亮绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，无扩增条带则判断为阴性。
所述的反应混合液中含有12 mmol/L MgSO4、2mmol/L dNTPs、1.6mol/L Betaine、2% TWeen-20、5 μL 10×Thermopol Buffer。
2．检测结果
除来自我国福建、江西和北京等地的21株葡萄炭疽病菌可观察到亮绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带外，其他检测了19种真菌和12种卵菌显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明此引物具有很强的特异性。见图1，1、3~7反应液为亮绿色荧光；2、8~11反应液为橙色。
实施例2：LAMP引物对葡萄炭疽病菌的灵敏性检测
1．葡萄炭疽病菌的LAMP灵敏性检测
采用10倍浓度系列稀释法将提取的葡萄炭疽病菌DNA稀释成50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg,5 pg, 500 fg, 50 fg和5 fg共8个不同浓度梯度。
①LAMP反应体系25 μL：包括引物组5μM TJ-F3、5μM TJ-B3、40μM TJ-FIP和40μM TJ-BIP各1μL，12.5μL反应混合液，1μL荧光显色剂，1μL（8U）BstDNA 聚合酶，50ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 μL。
LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。
②在LAMP反应前于反应液中加入1μL显色剂，所述荧光显色剂为1.25mM钙黄绿素和12.5mM氯化锰混合液，观察到亮绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，无扩增条带则判断为阴性。
所述的反应混合液中含有12 mmol/L MgSO4、2mmol/L dNTPs、1.6mol/L Betaine、2% TWeen-20、5 μL 10×Thermopol Buffer。
2．检测结果
葡萄炭疽病菌LAMP灵敏性检测，显色结果可观察到亮绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带，检测灵敏度可达500fg，见图2，1~6反应液为亮绿色荧光；7~8反应液为橙色。
实施例3：发病果实中葡萄炭疽病菌的检测。
1．样品采集：样品采自福建、江西等葡萄生产基地。
 2．DNA提取及检测
发病果实采用CTAB法提取葡萄炭疽病菌DNA。
按下述方法进行LAMP检测：
①LAMP反应体系25 μL：包括引物组5μM F3、5μM B3、40μM FIP和40μM BIP各1μL，12.5μL反应混合液，1μL荧光显色剂，1μL（8U）BstDNA 聚合酶，50ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 μL。
LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。
②在LAMP反应前于反应液中加入1μL荧光显色剂，所述荧光显色剂为1.25mM钙黄绿素和12.5mM氯化锰混合液，观察到亮绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，无扩增条带则判断为阴性。
所述的反应混合液中含有12 mmol/L MgSO4、2mmol/L dNTPs、1.6mol/L Betaine、2% TWeen-20、5 μL 10×Thermopol Buffer。
3．检测结果
显色结果观察到亮绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形条带，判断发病果实感染葡萄炭疽病菌。见图3，1、3~5反应液为亮绿色荧光；2、6~8反应液为橙色。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  福建省农业科学院果树研究所
 
<120>  葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组及其检测方法
 
<130>  4
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
atgcctgttc gagcgtca                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
tccgaggtca acctttggaa                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
gccactacct ttgagggcct actttcaacc ctcaagctct gc                        42
 
 
<210>  4
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
cggagcctcc tttgcgtagt aagggtttta cggcaagagt cc                        42
 
 

Claims (5)

1.一种葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组，其特征在于：所述LAMP检测引物组分别为：
TJ-F3：5′-ATGCCTGTTCGAGCGTCA-3′；
TJ-B3：5′-TCCGAGGTCAACCTTTGGAA-3′；
TJ-FIP：5′-GCCACTACCTTTGAGGGCCTACTTTCAACCCTCAAGCTCTGC-3′；
TJ-BIP：5′-CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC-3′。
2.一种葡萄炭疽病菌LAMP检测方法，其特征在于：利用所述的LAMP检测引物组进行LAMP检测，LAMP反应体系为25 μL：包括引物组5μM TJ-F3、5μM TJ-B3、40μM TJ-FIP和40μM TJ-BIP各1μL，12.5μL反应混合液，1μL荧光显色剂，1μL（8U）BstDNA 聚合酶，50ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 μL。
3.根据权利要求2所述的葡萄炭疽病菌LAMP检测方法，其特征在于：在LAMP反应前于反应液中加入1μL荧光显色剂，所述荧光显色剂为1.25mM钙黄绿素和12.5mM氯化锰混合液，显色结果观察到亮绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μL扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，无扩增条带则判断为阴性。
4.根据权利要求2所述的葡萄炭疽病菌LAMP检测方法，其特征在于：所述的反应混合液中含有12 mmol/L MgSO4、2mmol/L dNTPs、1.6mol/L Betaine、2% TWeen-20、5 μL 10×Thermopol Buffer。
5.一种如权利要求1所述的葡萄炭疽病菌LAMP检测引物组在葡萄炭疽病的早期诊断和病原菌的监测与鉴定上的应用。
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