KR100566451B1 - 안질환 치료에서 초자체액의 액화를 위한 안과용 제제의 제조에 있어서의 히알루로니다제의 용도 - Google Patents

Abstract

효소에 의한 방법이 포유류의 안질환을 치료하기 위해 제공된다. 혈관신생의 방지 및 망막에 독성인 물질을 초자체로부터 신속히 제거하는 방법은 안구에 독성 손상을 일으키지 않으면서 치료되는 안구의 초자체액을 액화시키기에 유효한 양의 히알루로니다제를 투여함으로써 성취될 수 있다. 초자체액의 액화는 초자체실로부터의 액체 교환 속도를 증가시킨다. 이와 같이 교환 속도를 증가시켜 안과학적 및 망막상 손상을 야기하는 물질 및 상태를 제거한다.

히알루로니다제, 초자체액, 안질환

Description

안질환 치료에서 초자체액의 액화를 위한 안과용 제제의 제조에 있어서의 히알루로니다제의 용도 {Use of Hyaluronidase in the Manufacture of an Ophthalmic Preparation for Liquefying Vitreous Humor in the Treatment of Eye Disorders}

본 발명은 일반적으로 사람 또는 기타 포유류 안구에 치료를 목적으로 투여하기 위한 효소 제제에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 1종 이상의 효소를 사용하여 포유류 안구의 망막 및(또는) 초자체에 관계된 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

사람의 안구의 해부학적 구조

사람에 있어서, 안구의 해부학적 구조는 수정체 뒷편의 안구 공동의 대략 4/5를 차지하는 "초자체"를 포함한다. 초자체는 초자체액으로 불리우는 젤라틴 물질로 형성된다. 전형적으로, 일반적인 사람의 안구의 초자체액은 대략 99%의 물과 1%의 거대분자가 포함된다(콜라겐, 히알루론산, 가용성 당단백질, 당 및 기타 저분자량의 대사산물).

망막은 본질적으로 안구 내부의 후방 표면상에 형성된 신경 조직의 층이다. 망막은 맥락막층이라 공지된 세포층으로 둘러싸여 있다. 망막은 시각 메커니즘에 참여하는 시각 부분과 시각 메커니즘에 참여하지 않는 비-시각 부분으로 나뉘어질 수 있다. 망막의 시각 부분은 시각의 유효 기관인 간상체 및 추상체를 포함한다. 다수의 동맥 및 정맥이 망막의 중심부를 통과하고 외부로 넓혀 망막에 혈액을 순환시킨다.

초자체의 후부는 망막과 직접적으로 접촉한다. 원섬유성 가닥의 네트워크는 망막으로부터 확장되고 초자체로 스며들거나 삽입되어 초자체를 망막에 부착시킨다.

초자체 출혈의 원인, 치료 및 임상 후유증

당뇨병성 망막증, 외상 및 기타 안질환은 때때로 망막 혈관의 파열 또는 누출로 인해 안구 초자체로의 출혈이 발생한다(즉 "초자체 출혈"). 그러한 초자체 출혈은 전형적으로 초자체의 흐림 또는 혼탁화로서 발현된다.

초자체 출혈은 때때로 망막의 파열 또는 분리에 의한 것이지만 항상 그런것은 아니다. 망막의 파열 또는 분리에 의한 초자체 출혈의 경우, 그러한 망막의 파열 또는 분리를 즉시 진단하고 수술로 치료하는 것이 중요하다. 망막의 파열 또는 분리를 즉각적으로 진단하고 치료하는데 실패하는 경우, 파열 또는 분리된 부분의 망막의 광 수용 세포가 괴사할 수 있다. 그러한 망막의 광 수용 세포의 괴사는 시력을 잃게할 수도 있다. 또한, 망막의 분리를 장기간 동안 치료하지 않고 방치할 경우 추가로 초자체 출혈하고(하거나) 출혈 위치에서 섬유조직이 형성될 수 있다. 그러한 섬유 조직의 형성은 초자체와 망막간의 목적하지 않는 영구 섬유 부착물을 형성할 수 있다.

망막 파열 또는 분리의 치료에 사용되는 전형적인 수술 방법은 수술의가 초 자체액을 통해 보면서, 망막의 손상 부분을 조망하도록 하는 것이 필요하다(즉, "초자체를 통한 망막의 조망"). 초자체 출혈이 발생한 경우, 초자체내에 존재하는 출혈은 초자체를 혼탁하게 하여 수술의가 초자체를 통해 망막을 보는 것을 방해한다. 그러한 초자체 출혈에 의한 혼탁화는 초자체를 통한 망막의 조망이 허용되기에 충분히 명료해지는데 6 내지 12시간 또는 그 이상이 걸릴 수 있다. 그러나, 망막의 파열 또는 분리의 진단 또는 치료의 지연에 의해 야기되는 잠재적인 합병증의 관점에서, 혈액이 자연적으로 제거되기를 기다리는 것은 일반적으로 바람직하지않다.

또한, 초자체 출혈이 망막의 파열 또는 분리에 의한 것이 아닌 경우, 혼탁해진 초자체는 의사가 일반적인 망막의 안저검사를 수행하는 것을 방해하기 때문에 망막의 파열 또는 분리가 발생하지 않았음을 확인하는 것은 종종 어려운 일이다. 또한, 초자체내의 출혈은 침범된 안구를 통한 환자의 시각을 현저하게 손상하거나 완전히 혼탁하게 할 수 있고, 이것은 출혈이 충분히 또는 완전히 제거되는 시점까지 지속된다.

따라서, 초자체내의 출혈의 존재는

a) 출혈 및(또는) 임의의 수반되는 망막의 파열 또는 분리 위치 및 원인을 시각적으로 조사하고 진단하는 것을 무력화하고,

b) 침범된 안구의 시각의 전체적 또는 부분적 손상, 및

c) 출혈 위치를 치료하고(하거나) 임의로 수반되는 망막 파열 또는 분리를 치료하기 위해 전형적으로 사용되는 치료 형태인, 초자체를 통한 수술의 수행을 손 상하고 방해하는 것을 포함하는 다중의 임상적 문제점을 야기한다.

초자체 출혈이 초자체를 충분히 혼탁하게 하는 경우, 의사는 초자체 절제술로 알려진 방법을 수행할 기회가 있으며, 이 방법은 초자체의 전부(또는 일부)를 안구의 내부에서 제거하고, 깨끗한 액체로 대체한다. 이러한 초자체 절제술의 수행은 수술의가 필요한 망막의 검사 및(또는) 출혈 및 임의의 수반되는 망막 파열 또는 분리의 수술 치료를 수행하도록 하기 위한 것이다. 그러한 초자체 절제술 방법은 고도의 기술이 요구되며, 여러 현저한 결점, 위험성 및 합병증이 연관되어 관련되어 있다. 이러한 결점, 위험성 및 합병증 중에서 초자체를 제거하는 것은 망막의 추가 분리 또는 파열을 야기하고(하거나) 그러한 초자체의 제거가 이미 약화된 망막 혈관으로부터 추가의 출혈을 야기할 가능성이 있다.

히알루로니다제 및 기타 효소의 선행 안과적 적용

초자체 절제술의 수행 중 추가의 망막 분리 또는 파열의 발생 가능성을 최소화하기 위해서, 하게만(Hageman)등의 미국 특허 제5,292,509호에서는 초자체를 제거하기에 앞서, 프로테아제가 없는 특정 글리코사미노글리카나제 효소를 초자체에 주사하고, 초자체를 탈커플링하거나 망막으로부터 "들어내는"것을 제안하고 있다. 그러한 초자체의 들어내기 또는 탈커플링은 초자체가 제거될 때 발생하는 추가의 망막 파열 또는 분리 가능성을 최소화하는 것을 의미한다. 이러한 초자체 들어내기에 사용될 수 있는, 특정 프로테아제가 없는 글리코사미노글리카나제의 예로는 콘드로이티나제 ABC, 콘드로이티나제 AC, 콘드로이티나제 B, 콘드로이틴 4-술페이트, 콘드로이틴 6-술페이트, 히알루로니나제 및 B-글루쿠로니다제가 포함된다.

히알루로니다제 효소가 미국 특허 제5,292,509호에 기재된 초자체 절제술 보조용으로의 사용을 포함하며 다양한 안약의 사용에 유용한 것으로 공지되었을지라도, 이전에 발표된 연구에서는 히알루로니다제가 1 IU 초과량, 즉 15, 30, 50 및 150 IU의 히알루로니다제 투여량으로 초자체내에 투여될 경우 망막 및(또는) 기타 안구의 해부학상 구조에 독성을 나타내는 것으로 알려져 왔다. 문헌 [The Safety of Intravitreal Hyaluronidase; Gottlieb, J.L., Antoszyk, A.N., Hatchell, D.L. 및 Soloupis, P., Invest Ophthalmol Vis Sci 31:11, 2345-52(1990)]을 참조한다.

일부 히알루로니다제 제제의 안독성은 다른 조사자들에 의해 확인되어 왔으며, 이들은 그러한 히알루로니다제 제제가 동물 독성 모델에 있어서 안구의 실험적으로 유도된 혈관신생을 야기하는 독성 자극제로서 사용됨을 제안하였다. 문헌 [An Experimental Model of Preretinal NeoVascularization in the Rabbit; Antoszyk, A.N., Gottlieb, J.L., Casey, R.C., Hatchell, D.L. 및 Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis Sci 32:1, 46-51(1991)]을 참조한다.

유감스럽게도, 히알루로니다제의 보고된 치료학적 활성 및 독성이 모든 히알루로니다제 제제에 일반적으로 적용되는지, 또는 그러한 효능 및(또는) 독성이 단지 특정한 부형제 물질을 포함하는 히알루로니다제 제제 또는 특정 원천으로부터 유도된 히알루로니다제 효소에 적용되는 지에 대해서 알려져 있지 않다. 이는 선행 기술에서 사용된 다양한 히알루로니다제 제제의 순도 및 특성(예를 들면, 분자량 분포)가 히알루로니다제 및 용매 및(또는) 히알루로니다제와 배합되는 기타 제형물 성분의 원천에 따라서 다양할 수 있는 사실의 측면에서 중요한 고려사항이다.

안과 투여용으로 이전에 사용된 히알루로니다제 제제의 순도 및 특성

용어 "히알루로니다제"는 히알루론산과 같은 특정한 뮤코폴리사카리드를 탈중합하는 엔도-B-글루쿠로니다제 효소 군을 의미한다. 마이어(Myer) 등의 문헌[The Enzymes; Vol. 4, 2d, Ed., pp447, Academic Press, Inc., New York(1960)]을 참조한다.

히알루로니다제는 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트 산 A 및 C의 엔도-N-아세틸 헥소사민 결합을 가수분해하여 우선 테트라사카리드 잔기를 형성한다.

중요한 증거는 상이한 원천에서 유도된 히알루로니다제 효소가 효소 분자량 분포 및 특정 효소 활성에 있어서 상이함을 나타낸다. 분자량 분포 및 특정 효소 활성에 있어서 그러한 다양성은 히알루로니다제 효소가 소의 고환, 양의 고환, 스트렙토마이시즈와 같은 특정 박테리아 및 거머리와 같은 특정한 무척추 동물을 포함하는 다양한 원천으로부터 단리될 수도 있다는 관점에서 주목할 만한 고려 사항이다.

위다제(wydase)

히알루로니다제 제제는 초자체를 안구에서 제거하는 초자체 절제술 중 초자체의 액화 증진 및 녹내장의 치료를 포함하는 다양한 임상적 및 실험적 사용을 위해 포유류 안구에 투여되어 온 것으로 보고되고 있다.

일부 히알루로니다제 제제가 안구에 주사되거나 국부적으로 투여되는 경우 목적하는 치료학적 효과를 나타내는 것으로 보고되었을지라도, 히알루로니다제 및(또는) 티메로살 예방제의 잠재 독성은 안구내 주사에 의한 제제의 일반적인 임상적 투여의 안정성에 관한 관심을 일으키고 있다.

따라서, 당분야에서는 최적의 치료 효과를 나타내기에 충분한 투여량으로 안구에 투여될 수 있지만, 눈에 독성을 야기하지 않는 신규 히알루로니다제 제제 및 제법을 개선할 필요성이 존재한다.

추가로, 초자체로부터 자연적인 출혈 제거의 완만함에 관련된 상기 언급문제의 관점에서, 당분야에서는 초자체를 제거(즉, 전체적 또는 부분적 초자체 절제술)할 필요없이 망막을 포함한 안구의 후면의 초자체를 통한 조망을 가능하게 하는 안구의 초자체로부터 출혈 제거를 가속하는 신규 방법 및 과정에 대한 설명 및 개선의 필요성이 존재한다.

추가로, 망막의 혈관형성에 의한 손상 또는 병의 경과에 의해 야기되거나 혈액망막관문에 손상을 주는 포유류의 다양한 안질환의 예방 및 치료의 필요성이 있다.

발명의 요약

효소에 의한 방법이 표유류의 안질환을 치료하기 위해 제공된다. 혈관신생의 방지 및 망막에 독성을 나타내는 물질을 초자체로부터 신속히 제거하는 방법은 안구에 독성 손상을 주지않으면서 치료되는 안구의 초자체액을 액화시키기에 유효한 양의 히알루로니다제를 투여함으로써 성취된다. 초자체액의 액화는 초자체실로부터의 액체의 교환 속도를 증가시킨다. 이와 같이 교환 속도를 증가시켜 안과학적 및 망막상 손상을 야기하는 물질 및 상태를 제거한다.

표유류의 안질환을 예방하기 위해 초자체액의 액화를 유도하는 방법은 포유류의 초자체액을 초자체액의 액화에 유효한 양의 히알루로니다제와 접촉시키는 단 계를 포함하며, 그에 의해서 포유류 안구에 독성 손상을 주지않고 질환을 예방한다.

바람직하게는, 본 방법은 증식성 당뇨병성 망막증, 연령-관련된 황반 변성, 약시, 색소성 망막염, 황반 구멍, 또는 황반 침출액, 또는 유양포 황반 부종을 치료할 목적으로 수행한다. 히알루로니다제 효소는 액체 용액일 수 있고, 효소를 초자체액과 접촉시키는 단계는 상기 액체 용액을 초자체액에 주사하는 것을 포함한다. 히알루로니다제는 티메로살의 부재하에 초자체와 접촉한다.

한 실시양태에서, 히알루로니다제는 5 내지 200 IU의 투여량으로 초자체액과 접촉된다. 또다른 실시양태에서 히알루로니다제는 1 IU의 투여량으로 초자체액과 접촉된다. 히알루로니다제는 다수회 투여량으로 투여될 수 있고, 1회 초자체내 주사는 100:1 미만의 주사 용적을 가질 수 있다.

또다른 실시양태에서, 히알루로니다제는 10% SDS PAGE 전기영동에 의해서 측정할 때 약 100000을 초과하는 분자량을 갖는 히알루론산 용해 활성이 없다. 또한, 히알루로니다제는 10% SDS PAGE 전기영동에 의해서 측정할 때 대략 60000 내지 100000의 분자량을 갖는 젤라틴 분해 활성이 없다. 또한, 히알루로니다제는 10% SDS PAGE 전기영동에 의해서 측정할 때 대략 45000을 초과하는 분자량을 갖는 카제인 분해 활성이 없다. 또한, 히알루로니다제는 4 내지 20% SDS PAGE 전기영동에 의해서 측정할 때 대략 100000을 초과하는 분자량을 갖는 히알루로니다제 물질이 없다. 추가로, 히알루로니다제는 4 내지 20% SDS PAGE 전기영동에 의해서 측정할 때 대략 50000 내지 60000의 분자량을 갖는 히알루로니다제 물질이 없다. 또한, 히알루로니다제는 4 내지 20% SDS PAGE 전기영동에 의해서 측정할 때 대략 20000 미만의 분자량을 갖는 히알루로니다제 물질이 없다.

또다른 실시양태에서, 히알루로니다제는 티메로살이 없고, 8000 IU 이하의 히알루로니다제, 5.0 내지 130.0 mg의 락토스 및 0.01 내지 100.0 mmol의 포스페이트를 포함하는 조성을 갖는 주사 용액으로 제조된다. 이에 더하여 또다른 실시양태에서, 히알루로니다제는 티메로살이 없고, 6500 IU의 히알루로니다제, 5.0 mg의 락토스 및 0.02 mmol의 포스페이트를 포함하는 조성을 갖는 주사 용액으로 제조된다. 또다른 실시양태에서, 히알루로니다제는 티메로살이 없고, 500 내지 1000 IU의 히알루로니다제, 5.0 내지 10.0 mg의 락토스 및 0.01 내지 10.0 mmol의 포스페이트를 포함하는 조성을 갖는 주사 용액으로 제조된다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 포유류의 안질환의 치료 방법은 포유류 안구에 독성 손상을 일으키지 않으면서 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 히알루로니다제를 포유류 안구의 초자체액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 포유류 안구의 망막을 볼 수 있도록 초자체액에는 출혈이 없다. 또한, 접촉 단계는 초자체를 절제하지 않고 실행된다.

도1은 1) 31000 내지 200000의 분자량 표준, 2) 양의 히알루로니다제 ACS, 3) 소의 히알루로니다제 VI-S형, 4) 양의 히알루로니다제 V형, 5) 소의 히알루로니다제 IV-S형, 및 6) 소의 히알루로니다제 I-S형을 나타내는 6개의 레인을 갖는 전기영동 겔을 나타내고 있다.

도2는 VI-S, IV-S 및 I-S형의 소의 히알루로니다제 및 V형의 양의 히알루로니다제와 비교하여, 자이모그래피(zymography)로 측정된 본 발명의 히알루로니다제 ACS의 히알루론산 용해, 젤라틴 분해 및 카제인 분해 활성을 요약한 표이다.

도3은 하기 실시예 1에 따라서, 토끼에게 BSS, BSS+티메로살, 히알루론산 ACS 및 히알루로니다제 위다제

의 1회 투여량을 초자체내로 주사한 것의 독성 효과를 요약한 표이다.

도4는 하기 실시예 2에 따라서, 토끼에게 1회 투여량의 히알루로니다제 ACS를 초자체내에 주사한 것의 효능을 요약한 표이다.

도5는 하기 실시예 2에 따라서, 토끼에게 다수회 투여량의 히알루로니다제 ACS를 초자체내에 주사한 것의 안정성 및 효능을 요약한 표이다.

도6은 하기 실시예 9에 따라서, 당뇨병성 망막증에 걸린 사람 환자에게 1회 투여량의 히알루로니다제 ACS를 주사한 것의 출혈-제거 효능을 요약한 표이다.

하기 자세한 설명 및 첨부된 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 특정 실시양태를 기술하고 설명할 목적으로 제공되며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.

효소에 의해 안구의 초자체로부터 출혈 제거를 가속화하는 방법

본 발명에 따라서, 출원인들은 효소가 특정 형태의 출혈이 있는 초자체액과 접촉할 때 초자체액으로부터 출혈을 제거하는 속도를 가속화함을 밝혔다.

이 점에 있어서, 출원인들은 안구의 초자체로부터 출혈의 제거를 가속화하는 방법을 고안해냈으며, 상기 방법은 일반적으로 안구의 망막 또는 조직에 손상을 주지 않으면서 초자체로부터 혈액을 제거하는 것을 가속화하기에 충분한 양으로 히알루로니다제를 초자체액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 안구의 망막 또는 조직에 손상을 주지 않으면서 티메로살의 부재하에 1 IU를 초과하는, 바람직하게는 15 IU를 초과하는, 유리하게는 75 IU를 초과하는 투여량으로 초자체내에 투여될 수 있게하는 분자량 분포를 갖는 히알루로니다제로부터 선택된다. 본 발명의 출혈 제거 방법은 어떠한 초자체 절제술 또는 기타 수술 처리 또는 초자체액의 제거없이 수행될 수 있으며, 따라서 그러한 초자체 절제술 방법과 관련된 잠재적 위험성 및 합병증을 피할 수 있다.

이러한 출혈-제거 효소의 투여에 바람직한 경로는 안구내 주사에 의해 직접적으로 초자체에 투여하는 것이다. 그러나, 별법으로 본 발명의 출혈-제거 효소는 임의의 다른 적합한 투여 경로(예를 들면, 국소적으로)로 투여될 수 있으며, 이는 효소가 초자체에 충분히 분포되어 목적하는 출혈-제거 효과를 일으키게 한다.

바람직한 주사 용액은 안구에 독성 손상을 주지 않으면서 1 IU를 초과하는, 바람직하게는 15 IU를 초과하는, 유리하게는 75 IU를 초과하는 투여량으로 초자체내에 투여될 수 있게하는 분자량 분포를 갖는 히알루로니다제와 함께 용액을 실질적으로 등장 상태 및 안구에 주사하기에 적합한 pH가 되도록 하는 불활성 원료를 포함할 수 있다. 이러한 바람직한 히알루로니다제 제제에는 바람직하게는 티메로살이 없다. 그러한 주사 용액은 초기에 건조 상태로 동결 건조되고, 사용하기 전에 재생시킬 수 있다.

바람직한 안과 투여용 히알루로니다제 제제

본 발명에 따른 티메로살이 없는 주사가능한 히알루로니다제 제제용 일반적 조성을 하기 표1에 나타냈다.

일반적 조성

원료	양
히알루로니다제 ACS	8000 IU 이하
락토스 USP	5.0 mg 내지 130.0 mg
포스페이트 USP	0.01 내지 100 mmol

이러한 제제 성분들을 초기에 멸균수에 용해시키고, 멸균 여과후 건조 조성물로 동결 건조시킨다. 동결 건조된 조성물은 사용하기에 앞서 멸균된 등장 생리 식염수 또는 조정된(balanced) 염 용액과 같은 적합한 용매에서 재생시킬 수 있도록 포장된다. 그러한 조정된 염의 용액은 전형적으로 0.64%의 염화 나트륨, 0.075%의 염화 칼륨, 0.048%의 염화 칼슘 2수화물, 0.03%의 염화 마그네슘 6수화물, 0.39%의 아세트산 3수화물, 0.17%의 시트르산 나트륨 2수화물, pH 조절을 위한 수소화 나트륨/염산 및 주사를 위한 최종 용적에 도달하기에 필요한 양의 물(q.s.)을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "히알루로니다제 ACS"는 티메로살이 없으며, 100000을 초과하고, 50000 내지 60000 및 20000 미만의 분자량의 히알루로니다제 분획이 없는 초자체내로 주사하기에 바람직한 히알루로니다제 용액을 의미한다. 그러한 히알루로니다제 중 1종은 Calbiochem Biochemicals(P.O Box 12087, La Jolla, CA 92039-2087)로부터 시판 중이다(Biozyme, San Diego, CA사에 의해 제조됨). 출원인들은 이러한 히알루로니다제 ACS의 특정 분자량 분포가 다수의 안약 사용에 목적하는 치료상 효능을 보이는 반면, 다른 히알루로니다제 제제보다 낮은 안독성을 나타냄을 밝혔다.

도1은 SIGMA Chemical Company(P.O.Box 14508, St. Louis, Missouri 63178)로부터 얻을 수 있는 소의 VI-S, IV-S 및 I-S 형 및 양의 V 형 히알루로니다제의 분자량 분포와 비교하여 바람직한 히알루로니다제 ACS의 분자량 분포를 나타내는 전기영동 겔(4 내지 20% 구배 SDS-PAGE)을 나타낸다. 각 효소의 표준화된 양(즉, 히알루로니다제 활성의 동일량 단위)을 도1에 나타낸 전기영동 겔의 각 레인에 적재했다. 도1에 나타낸 전기영동 겔의 레인 1은 각각 200000, 116000, 97400, 66000, 45000 및 31000에 해당하는 분자량 표시를 갖고 있다. 도1에 나타낸 전기영동 겔의 레인 2-6은 각각 하기와 같은 시험된 히알루로니다제 제제를 포함하고 있다.

레인 레인에 존재하는 물질

2 히알루로니다제 ACS

3 VI-S 형의 소의 히알루로니다제

4 V 형의 양의 히알루로니다제

5 IV-S 형의 소의 히알루로니다제

6 I-S 형의 소의 히알루로니다제

레인 2는 히알루로니다제 ACS의 분자량 분포가 분자량 분획이 97400, 50000(대략) 및 45000(대략)인 것을 포함하지만, 100000을 초과, 50000 내지 60000 및 20000 미만의 분자량 분획이 없음을 명백하게 나타낸다.

도1의 전기영동 겔의 레인 3, 4, 5 및 6은 시험된 모든 VI-S, IV-S 및 I-S 형의 소의 고환 히알루로니다제 및 V 형의 양의 고환 히알루로니다제가 50000-60000 및 20000 미만의 분자량 분획을 포함한다는 점에서 본 발명의 히알루로니다제 ACS와 상이하다는 것을 나타낸다. 또한, 시험된 4종의 고환 히알루로니다제 중 3종은(즉, VI-S, IV-S 및 I-S 형) 100000을 초과하는 히알루로니다제 분자량 분획을 포함했다.

추가로, 상기 기술된 히알루로니다제 ACS, VI-S, V, IV-S 및 I-S 형의 히알루로니다제의 표준량(즉, 히알루로니다제 활성의 등가 단위)의 히알루론산, 젤라틴 및 카제인에 대한 상대 세포 용해 활성을 비교하기 위해 자이모그램(zymogram)을 측정하였다. 도2에 따라서, 이러한 자이모그램의 각각을 수행하는 특정 방법은 하기와 같다.

젤라틴 분해 활성에 대한 자이모그램

젤라틴- 1 mg/ml의 젤라틴; 10%의 폴리아크릴아미드; 완충액 = 50 mM의 트리스 염산, 5 mM의 염화 칼슘, 0.05%의 트리톤 X-100, pH 7.5에서 하룻밤 유지; 쿠마시(Coomassie) 블루로 염색; 10% 아세트산/50% 메탄올로 탈염색.

카제인 분해 활성에 대한 자이모그램

카제인- 4 mg/ml의 카제인; 15%의 폴리아크릴아미드; 완충액 = 50 mM의 트리스 염산, 5 mM의 염화 칼슘, 0.05%의 트리톤 X-100, pH 7.5에서 하룻밤 유지; 쿠마시 블루로 염색; 10% 아세트산/50% 메탄올로 탈염색.

히알루론산 세포 용해 활성에 대한 자이모그램

히알루론산- 2 mg/ml; 10%의 폴리아크릴아미드; 완충액 = 포스페이트 완충된 식염수, pH 7.4에서 하룻밤 유지; 3% 아세트산 중 0.5% 알시안(alcian) 블루로 염색; 10% 아세트산/50% 메탄올로 탈염색.

이러한 히알루론산, 젤라틴 및 카제인 자이모그램의 결과를 도2의 표에 요약하였다. 명백하게도, 본 발명의 바람직한 히알루로니다제 ACS는 10% SDS PAGE 전기영동에 의해 측정되는 대략 100000을 초과하는 히알루론산 세포 용해 분자량 분획이 없는 반면, 시험된 각 고환 히알루로니다제(즉, VI-S, V, IV-S 및 I-S 형)는 100000을 초과하는 히알루론산 세포 용해 분자량 분획을 함유한다.

유사하게, 본 발명의 히알루로니다제 ACS는 대략 60000-100000의 젤라틴 분해 분자량 분획이 없는 반면, 시험된 각 고환 히알루로니다제는 10% SDS PAGE 전기영동에 의해 측정되는 경우 대략 60000-100000의 젤라틴 분해 분자량 분획을 포함한다.

또한, 본 발명의 히알루로니다제 ACS는 대략 45000의 카제인 분해 분자량 분획이 없는 반면, 시험된 각 고환 히알루로니다제(즉, VI-S, V, IV-S 및 I-S 형)는 10% SDS PAGE 전기영동에 의해 측정되는 경우 대략 45000의 카제인 분해 분자량 분획을 포함한다.

본 발명의 바람직한 히알루로니다제 ACS의 특정 분자량 분포 및 특정 효소 활성 및(또는) 그의 제제에 티메로살이 함유되지 않은 것은 독성 효과를 야기하는 다른 히알루로니다제 제제의 투약 농도로 투여된 경우에도 안구에 비-독성인 히알 루로니다제 제제를 제공한다.

이후 나타낸 실시예에서 사용하기 위한, 바람직한 히알루로니다제 ACS는 하기 기술되어 있고 표1에 나타낸 방법 및 일반 화학식에 의해 티메로살이 없는 제제로 제조된다. 보다 구체적으로, 하기 실시예에서 사용된 히알루로니다제 ACS는 하기 표2에 나타낸 특정 조성에 따라서 제조된다.

제제 A

원료	양
히알루로니다제 ACS	7200 IU
락토스 USP	5.0 mg
포스페이트 USP	0.02 mmol

별법으로, 단위-투여량 사용을 위한 또다른 특정 제제를 표3에 나타낸다.

제제 B

원료	양
히알루로니다제 ACS	500-1000 IU
락토스 USP	5.0-10.0 mg
포스페이트 USP	0.01-10.0 mmol

또다른 별법의 특정 제제에서, 히알루로니다제 ACS는 동결건조된 형태로 제공되며, 그 성분을 표4에 나타낸다.

제제 C

원료	양
히알루로니다제 ACS	450 IU
락토스 USP	10.0 mg
단일염기성 인산 칼륨 USP	0.098 mg
이염기성 인산 칼륨 USP	10.0 mg
희석제 양(0.9% 염화 나트륨)	0.3 ml 또는 0.18 ml
주사 용적	0.5 ml 또는 0.03 ml

상기 희석제 양 및 주사 용적은 75 IU 투여량에 대한 것이다. 희석제 양은 투여량에 따라 변화될 수 있다.

또다른 별법의 특정 제제에서, 히알루로니다제 ACS는 액체 형태로 제공되며, 이를 표5에 나타낸다.

제제 C

원료	양
히알루로니다제 ACS	1500 IU
락토스 USP	1.25 mg
단일염기성 인산 칼륨 USP	0.305 mg
이염기성 인산 칼륨 USP	0.48 mg
주사 용적	0.05 ml
투여량	75 IU

동일한 주사 용적을 가지고 보다 낮은 투여량을 성취하기 위해 모든 원료를 비례하여 감소시킬 수 있다. 또한, 락토스의 양은 1/2 또는 1/4로 감소될 수 있다.

제제 D

원료	양
히알루로니다제 ACS	6500 IU
락토스 USP	5.0 mg
포스페이트 USP	0.02 mmol

하기 실시예에 기술한 바와 같이, 표2(상기)에 나타낸 히알루로니다제 ACS의 제제 A는 안구 또는 그와 관련된 해부학적 구조에 현저한 독성을 일으키지 않고 목적하는 치료상 효과를 가져오는 투약 농도로 안구의 후부에 직접적으로 주사될수 있지만, 본 발명의 효과를 초자체 출혈 제거 효과에만 한정할 필요는 없다. 별법 으로, 히알루로니다제 ACS의 제제 B 또는 C도 투여될 수 있다. 또다른 별법으로 본 발명의 방법에서는 표6에 나타낸 히알루로니다제 ACS의 제제 D의 사용을 제공한다.

토끼에 있어서 티메로살, 히알루로니다제 ACS 및 히알루로니다제(위다제

)의 안독성

<실시예 1>

체중이 1.5 kg 내지 2.5 kg인 뉴질랜드 크로스 버라이어티의 건강한 토끼 52마리(수컷 26, 암컷 26)를 확인을 위해 각각 표시를 하였고 각각 매달린 우리에 넣었다. 시판중인 토끼 먹이를 식사로 주고 수돗물은 자유롭게 공급하였다.

토끼를 각 4마리씩(수컷 2, 암컷 2) 13개 군으로 분할하였다. 안저 사진 촬영 및 형광 혈관 조영의 선처리를 위해 각 군에서 2마리씩(수컷 1, 암컷 1) 선택하였다.

안저 사진 촬영은 토끼를 속박하고, 코닥 골드 200 ASA 필름을 장착한 KOWA

RC-3 Fundus 카메라를 사용하여 안저와 함께 안신경, 망막궁을 촬영함으로써 수행되었다.

형광 혈관 조영은 1.5 ml의 2% 살균된 형광 용액을 귀 가장자리의 정맥에 주사하여 수행하였다. 대략 주사 30초 후 형광이 안신경, 망막 맥관 및 안저의 위치를 나타냈다.

다음날, 각 토끼에게 34 mg/kg의 케타민 염산염과 5 mg/kg의 크실라진 배합물을 정맥 투여함으로써 마취시켰다. 눈까풀은 검경을 사용하여 수축시키고 안구 는 요오드-포비돈으로 세척하여 소독했다.

조정된 염 용액(BSS), BSS + 티메로살, 히알루로니다제(위다제

) 또는 히알루로니다제 ACS의 실험 치료약은 0.5 인치 바늘이 장착된 30 gauge의 1 cc 투베르쿨린(tuberculin) 주사기를 사용하여 주사, 투여하였다. 본 실시예에서 사용된 히알루로니다제 ACS 용액은 티메로살이 없고, 상기 표2에 나타낸 특정 히알루로니다제 ACS 제제로 구성되었다.

각 동물군에 투여된 실험 치료약은 하기와 같다.

군# 치료약

1 BSS

2 BSS + 0.0075 mg 티메로살

3 BSS + 0.025 mg 티메로살

4 히알루로니다제(위다제) 1 IU

5 히알루로니다제(위다제) 15 IU

6 히알루로니다제(위다제) 30 IU

7 히알루로니다제(위다제) 50 IU

8 히알루로니다제(위다제) 150 IU

9 히알루로니다제 ACS 1 IU

10 히알루로니다제 ACS 15 IU

11 히알루로니다제 ACS 30 IU

12 히알루로니다제 ACS 50 IU

13 히알루로니다제 ACS 150 IU

주사 후 다음날(1 일), 안저 사진 촬영 및 형광 혈관 조영술을 수행한 동물을 예비-투약 검사에서와 동일한 방법을 사용하여 검사하였다.

주사 후 2일 차, 예비-투약 및 1일 차에서 안저 사진 촬영 및 형광 혈관 조영술을 수행한 13마리의 숫 토끼 및 사진 촬영에 선택되지 않은 13마리의 암컷 토끼를 나트륨 펜토바비탈 기재의 약물로 안락사시켰다. 안구를 수술로 제거하고 0.1 M 포스페이트 완충된 식염수를 사용하여 pH 7.37의 2.5% 글루타르알데히드의 고정 용액에 넣었다.

별법으로, 무작위로 선택된 토끼 한마리를 펜토바비탈을 주사하여 안락사시키지만, 글루타르알데히드 용액의 좌심실로의 심장내 주사에 의해 고정시켜 적출된 안구에서의 조직학 연구 결과상의 고정 방법의 효과를 결정하였다.

7일 차에, 앞서 사진 촬영 및 조영술을 시행한 13마리의 암 토끼를 상기 기술한 방법에 따라 동일하게 조사하였다.

남은 26마리의 토끼를 투약 후 약 7일 차에 상기 기술한 바와 같이 안락사시켰다. 안구는 2일 차에 고정한 방법과 동일하게 고정시켰다. 또한, 무작위로 선택된 토끼 한마리를 이전에 무작위로 선택된 토끼에 대하여 상기 기술된 바와 동일한 심장내 글루타르알데히드 고정 방법을 시행하였다.

본 실시예에서 처리된 토끼의 안구를 치료약과 관련된 독성의 증거에 대하여 일괄적 및 미세하게 검사하였다. 각 치료군에 있어서 독성 또는 비-독성의 조직학적 증거에 대한 요약을 도3에 나타내었다.

요약에서, BSS-처리한 표준 군은 투약후 2일 및 7일 차에서 독성이 없었다.

BSS + 티메로살(0.0075 mg)으로 처리한 군2의 토끼의 안구는 2일 차에는 독성이 없었지만, 7일 차에서는 혈액망막관문의 파손의 증거가 나타났다.

BSS + 티메로살(0.025 mg)으로 처리한 군3의 토끼의 안구는 투약 후 2일 및 7일 차에서 심각한 치료약 관련 독성 효과를 나타냈다.

1 IU의 투여량으로 위다제

를 사용하여 처리한 군4의 토끼는 2일 및 7일 차에서 독성이 없지만, 15 IU 내지 150 IU의 투여량으로 위다제

를 사용하여 처리한 군5-8의 토끼는 투약 후 2일 및 7일 차에 투여량에 관련된 독성 효과를 일반적으로 나타냈다.

1 IU 내지 150 IU의 투여량으로 히알루로니다제 ACS를 사용하여 처리한 군9-13의 토끼의 안구는 투약 후 2일 및 7일 차에서 독성 효과의 증거가 일반적으로 나타나지 않았다. 그럼에도 불구하고, 150 IU로 처리된 토끼에서 일부 형광의 누출이 관찰되었다.

따라서, 티메로살 및 티메로살을 함유하는 위다제

제제는 시험된 투여량에서 토끼의 안구에 독성 효과를 야기하지만, 히알루로니다제 ACS는 시험된 투여량에서 어떠한 독성 효과도 야기하지 않는 것으로 결론내려졌다.

7일 차에서 수행된 실험의 결과를 도3에 요약하였다. 도3에 나타난 바와 같이, BBS + 티메로살(0.0075 mg) 및 히알루로니다제(위다제) 의 1 IU 내지 150 IU 사이의 모든 투여량으로 처리한 토끼의 안구에서는 현저한 독성 효과가 7일 차에서 관찰되었다. 대조적으로, 1 내지 150 IU의 투여량으로 히알루로니다제 ACS를 사용하여 처리한 토끼의 안구에서는 어떠한 독성 효과도 관찰되지 않았다.

토끼의 안구에 있어서 초자체내로 주사된 히알루로니다제 ACS의 안정성 및 효능

<실시예 2>

본 실시예에서는 뉴질랜드 크로스 버라이어티의 건강한 토끼 12마리를 확인을 위해 표시하고 각각 매달린 우리에 넣었다. 시판중인 토끼 먹이를 식사로 주고 수돗물은 자유롭게 공급하였다.

토끼를 각각 3마리씩 무작위로 4개 군으로 분할하였다.

초기에, 각 토끼의 안구를 1-2 방울의 10% 트로픽아미드로 확장시킨 후, 20 디옵터의 렌즈를 사용하여 일괄적 검사, 간접 검안경 검사 및 안구 전방의 해부학적 구조의 슬릿 램프 조사를 수행하였다. 토끼 안구의 초기 검사에 따라서, 100:1 또는 10:1의 혈액을 토끼의 안구의 초자체내로 주사하였다.

2일 차에서, 각 치료약 군의 토끼에게 BSS 또는 히알루로니다제 ACS를 하기와 같은 치료 계획에 따라 오른쪽 안구에 1회 초자체내 주사하였다.

군# 치료약

좌측 안구 우측 안구

A 없음 BSS(30:1) x 1

B 없음 30:1 x 1 중 25 IU 히알루로니다제 ACS

C 없음 30:1 x 1 중 50 IU 히알루로니다제 ACS

D 없음 30:1 x 1 중 75 IU 히알루로니다제 ACS

본 실험에서 사용된 히알루로니다제 ACS 제제는 상기 기술된 제형물이고, 표2에 나타내었다.

3, 5, 7, 14 및 21일 차에서, 각막, 전안방 및 홍체를 평가하기 위해 슬릿-램프로 각 토끼의 안구를 다시 검사하였다. 추가로, 각 토끼의 안구를 10%의 트로픽아미드 용액으로 확장시키고 망막을 20 디옵터의 렌즈로 간접 검안경 검사하였다.

히알루로니다제 ACS의 관찰된 출혈-제거 효능을 도4에 요약하였다. 일반적으로 각 치료군 중 각 토끼의 좌측 안구(치료하지 않음)는 주사된 혈액의 양으로 인해 초자체가 혼탁해지고 일부 혈액 덩어리를 포함하였다. 또한, 군A의 BSS 치료된(표준) 토끼의 우측 안구는 초자체가 혼탁해지고 일부 혈액 덩어리를 포함한 반면에, 치료 군B-D 중 히알루로니다제-처리된 모든 토끼의 우측 안구는 초자체가 투명하고 초자체를 통한 망막의 시각화가 가능하였다. 또한, 치료 군B-D 중 히알루로니다제-처리된 모든 토끼의 우측 안구의 망막은 정상적이고 치료약과 관련된 독성이 없었다.

본 실험의 결과는 초자체내로 투여된 히알루로니다제 ACS는 25, 50 및 75 IU의 1회 투여량에서 유효하여 처리된 토끼의 안구로부터 혈액을 제거하는 속도를 가속화하고, 본 실험에서 투여된 1회 투여량의 히알루로니다제 ACS는 본 실험에서 처리된 토끼의 안구에 관찰가능한 독성 효과를 야기하지 않음을 나타냈다.

변화에 있어서, 실시예는 1회 투여량의 투여 대신에 2주 간의 간격에서 히알루로니다제 ACS를 4회의 일관적인 양으로 다수회 투여하는 것을 제외하고 상기와 같이 수행하였다. 각 투여 후의 관찰은 일관적으로 하고, 이를 도5에 요약하였다. 일반적으로, 각 치료군 중 각 토끼의 좌측 안구(치료되지 않음)는 주사된 혈액의 양으로 인하여 초자체액이 혼탁해지고 일부 혈액 덩어리를 포함하였다. 또한 군A의 BSS 치료된(표준) 토끼의 우측 안구는 초자체가 혼탁해지고 일부 혈액 덩어리를 포함한 반면에, 치료 군B-D(즉, 히알루로니다제 ACS로 처리된 토끼)의 모든 토끼의 우측 안구는 초자체가 투명하고 초자체를 통한 망막의 시각화가 가능하였다. 또한, 치료 군B-D 중 모든 토끼의 우측 안구의 망막은 정상적이고, 히알루로니다제 ACS의 다수회 투여 후에도 치료약과 관련된 독성이 없었다.

본 실험의 결과는 초자체내로 투여된 히알루로니다제 ACS는 25, 50 및 75 IU의 1회 투여량에서 유효하여 처리된 토끼의 안구로부터 혈액을 제거하는 속도를 가속화하고, 또한 2주 간격에서 4회의 일관적인 투여량으로 히알루로니다제 ACS를 투여한 후에도 그러한 투여량의 히알루로니다제 ACS는 본 실험에서 처리된 토끼의 안구에 관찰가능한 독성 효과를 야기하지 않음을 나타냈다.

사람의 안구에 있어서 초자체내 주사된 히알루로니다제 ACS의 안정성 및 효능

<실시예 3>

본 연구의 일차 목적은 양의 고환 조직에서 추출한 고도로 정제된 히알루로니다제를 포함하는 조정된 염 용액을 임의의 심각한 안구 부작용을 발생하지 않고 시각적으로 손상된 안구의 초자체에 주사할 수 있는지의 여부를 결정하는 것이었다.

물질 및 제조 방법

조정된 염 용액(BSS)를 플라시보 표준으로서 사용하고, 이를 Allergen Pharmaceutical(Irvine, CA)로부터 얻었다. BSS는 0.64%의 염화 나트륨, 0.075%의 염화 칼륨, 0.048%의 염화 칼슘 2수화물, 0.03%의 염화 마그네슘 6수화물, 0.39%의 아세트산 나트륨 3수화물, 0.17%의 시트르산 나트륨 2수화물, pH를 7,1-7.2로 조절하기 위한 충분한 수산화 나트륨/염산 및 주사를 위한 물(qs. 100%)을 포함하였다. 30 μl의 BSS 부분 또는 히알루로니다제 제제 D(표6)를 0.5 인치 길이의 29 gauge 바늘이 장착된 300 μl 마이크로주사기에 채웠다. 채워진 마이크로주사기는 환자의 안구의 초자체에 물질을 주사하기 위해 사용되었다.

초기에, 1명 이상의 시각적으로 손상된 안구를 가지는 8명의 사람 환자를 무작작위로 배정하여 BSS 중 50 μl의 50 IU의 히알루로니다제 ACS 또는 BSS 단독(3:1 비율)으로 초자체내 투여하였다. 50 IU의 투여량이 잘 허용됨을 확인하기 위한 1달의 추적 조사후, 6명의 시각적으로 손상된 환자의 두번째 군을 연구에 참가시키고 무작위로 보다 높은 히알루로니다제 ACS 투여량 군(100 IU) 또는 2:1 비율의 BSS 표준군에 배정하였다.

시험 물질의 안정성을 평가하기 위해 사용된 방법은 연구 전반에 걸쳐 다양한 기간으로 완료되고, 이러한 방법에는 간접 검안경 검사법, 안저 검사법, 형광 혈관 조영법, 망막전도 검사법, 외부 안구 검사법, 슬릿 램프 생체현미경법, 압평 안압측정법, 후도 측정법, 오토리플렉션법(autoreflection)이 포함된다.

동시에 플라시보 표준 군을 연구에 포함시켜, 히알루로니다제 ACS에 특히 연관된 부작용이 비히클(BSS)/주사 방법에 기인할 수 있는 것으로부터 구별될 수 있 게 하였다. 시험 물질이 망막에 직접 주사되고 중대한 특징의 부적절한 반응은 시력을 위협하기 때문에, 단지 시각적으로 손상된 안구만을 치료하였다. 환자들을 연구의 첫 단계에 대하여 601번, 두번째 단계는 701번으로 시작하는, 컴퓨터가 생성하는 무작위 계획을 사용하여 치료에 배정했다. 환자 뿐만 아니라 조사자들도 초자체내로 주사하는 것이 BSS 비히클인지 히알루로니다제 ACS/BSS 용액인지 알지 못했다.

각 환자들에 대하여 기준선을 세운 후, 환자에게 효소 또는 플라시보 표준을 주사하였다. 환자들을 안락의자에 앉은 상태로 두었다. 환자에게 아래를 보도록 요청한 후, 프로파라케인 염산염 안약 용액에 적신 살균된 면봉을 각막 위 대략 4-5 mm상의 공막상의 영역에 10초 동안 사용한 후(최고 위치/12:00 정점), 한 방울 또는 두 방울의 국소 마취제를 치료될 안구에 서서히 주사하였다. 시험 물질을 29 gauge의 바늘이 장착된 200 μl의 마이크로주사기를 통해 초자체내로 주사하고, 주사기는 두번째 마취제가 사용된 위치에서 바늘의 최대 길이 이하로 삽입되었다.

결과

비록 드물게 통계학적 의미를 갖을지라도, 슬릿 램프 생체현미경법의 데이타는 BSS 단독으로 치료한 것에 대비시켜 히알루로니다제 ACS/BSS를 사용하여 치료한 환자의 실질적으로 보다 높은 비율이 전실에 있어서 세포 및 플레어(flare)의 존재를 가장 현저하게하는 전실 구획 병리학적 변화를 나타냄을 제시했다. 그러나, 6번(치료 후 1달)의 방문 후, 군간의 어떠한 상이점도 슬릿 램프 평가된 변수에 대해 관찰되지 않았다.

망막전도법/시각에 의해 발생된 전위에 의해 측정된 바와 같이 망막/피질의 반응은 BSS로 치료한 환자 1명 및 50 IU의 히알루로니다제 ACS/BSS로 치료한 환자 중 2명에 있어서 시간에 따라 악화되었다. 그러나, 망막전도법 패턴에 있어서의 변화는 항상 양쪽성이고, 높은 투여량(100 IU)으로 히알루로니다제 ACS/BSS를 할당한 환자의 치료한 또는 치료하지 않는 안구에서는 발생하지 않았으며, 형광 혈관 조영 시험 결과는 망막 허혈이 치료에 상관없이 임의의 안구에서 나타난다는 것을 나타내지도 않는다.

간접 검안경 검사 실험은 시험 환자의 안구에 있어서 후부 초자체 분리(PVD)의 액화 및 확립을 나타냈다. 초자체는 시험 물질을 주사한 직후 운동성 및(또는) 액화의 높은 정도를 나타내는 것으로 특징지워지고, 이는 히알루로니다제 ACS를 함유한 제제에서 기대되었다. BSS 표준을 주사한 특정 시험 안구는 치료 이전에도 존재한 액화 및 PVD가 존재하고, 후자는 임의의 효소 활성을 갖지않으며, 매우 작은 용적으로 주어진다(30μl).

PVD에 관하여, 환자의 제1군에서 히알루로니다제 ACS로 치료한 6명의 환자 중 4명은 슬릿 램프 생체현미경법에 의해 PVD가 없는 것으로 나타났다(즉, 601, 602, 604 및 606, 표7을 참조). 치료 후, 이러한 환자들의 각각에서 PVD의 존재가 나타났다. 환자의 제2군으로부터의 결과는 슬릿 램프 현미경법을 사용하는 초자체의 화상화에 어려움으로 인하여 보다 덜 명확하다.

50:1 및 100:1의 히알루로니다제 ACS를 초자체내 주사한 사람의 안정성 연구

번호	효소 투여량	치료된 안구	PVD 존재하의 슬릿 램프 생체현미경법		PVD의 일수	초자체 운동성
			기준선 치료된
601	50	0D	없음	있음	2일	+3/+4
602	60	0D	없음	있음	1일	+4
603	BSS	0D	있음	있음		+3
604	50	0D	없음	있음	1일	+3
605	BSS	0S	있음	있음		+3/+4
606	50	0D	없음	있음	14일	+3/+4
607	50	0D	있음	있음		+3/+4
608	50	0D	있음	있음		+3
701	100	0S	없음	?		+2
702	100	0D	없음	?		+4
703	BSS	0D	있음	있음
704	100	0S	없음	?
705	100	0D	없음	있음	1일
706	BSS	0S	없음	없음

히알루로니다제 ACS를 150 IU 이하의 다양한 투여량으로 토끼의 초자체로 주사한 실시예 2가 초기 예비임상학적 연구에서의 임의의 현저한 조직병리학적 변화를 나타내지 않았다는 것을 고려하여, 150 IU 미만의 투여량이 인간에서 상당히 허용될 수 있을 것으로 예상되었다. 이러한 예상에 일치하게, 본 시험에 있어서 히알루로니다제 ACS/BSS를 시각적으로 손상된 안구에 초자체내 투여하는 것은 증상을 유도하지 않았으며, 그들 모두는 각 연구군에 비교가능한 빈도로 발생하는, 주사 방법 그자체에 의한 것으로 믿어지고, 치료에 관련된 부작용 후유증은 비교적 병세가 가볍고 지속 기간이 짧았다.

또한, 히알루로니다제 ACS를 사용한 사람 안구의 치료는 관찰된 후부 초자체 분리의 발생율을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 히알루로니다제 ACS를 사용하여 초자체내로 주사한 환자에 있어서 관찰된 PVD의 증가는 본 발명의 방법이 초자체액의 액화 및 분리를 유도하는데 유효함을 나타낸다. 따라서, 본 연구의 결과는 히알루로니다제 ACS가 임의의 심각한 또는 장기간의 안과 합병증을 유도하지 않고 사람의 초자체로 주사될 수 있음을 나타낸다.

안구의 초자체로부터 혈액의 제거를 가속화하기 위한 히알루로니다제의 용도

하기 실시예 4는 안구의 초자체로부터 혈액의 제거를 가속하기 위해 사용되는 초자체내 히알루로니다제 ACS의 경우를 기술한다. 실시예 4에서, 사용된 히알루로니다제는 상기 서술한 티메로살이 없는 히알루로니다제 ACS 제제이며 표2에 나타냈다.

<실시예 4>

초자체내 히알루로니다제 투여 후 가속된 혈액 제거

본 실험에서, 초자체 출혈을 나타내는 6명의 환자(여성 5명, 남성 1명)를 50 내지 200 IU의 투여량으로 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 1회 주사하여 치료하였다.

본 실험에서 투여된 히알루로니다제 ACS는 상기 기술된, 표2에 나타낸 제제에 의해 제조되었다.

본 실험에서 치료한 모든 환자는 당뇨병성 망막증의 병력이 있으며, 다양한 기간의 초자체 출혈이 있는 것으로 밝혀졌다. 각 환자에 있어서, 초자체내 존재하는 혈액의 양은 표준 안저검사 수단에 의해 망막의 조망을 방해할 정도로 충분하였다.

각 환자들에게 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 1회 주사하였다. 4명의 환자들은 50 IU, 1명의 환자는 70 IU, 1명은 200 IU의 투여량을 주사하였다.

본 실험의 관찰 결과를 도6에 요약하였다.

본 실시예에서 치료된 6명의 환자에게서, 출혈성 초자체는 히알루로니다제 ACS의 1회 주사 후 6 내지 16일 내에 망막을 통한 초자체 조망이 가능할 정도로 충분히 명료해졌다. 초자체의 그러한 혈액 제거는 히알루로니다제 치료없이 이러한 환자들에게 발생할 것으로 기대된 것보다 현저하게 신속히 발생하였다.

토끼에 있어서 보다 높은 투여량의 히알루로니다제 ACS에서 관찰된 형광 누출과는 다르게, 어떠한 독성도 사람에 기준한 본 연구에서는 관찰되지 않았음을 주목해야 한다.

기타 안과 질환을 치료하기 위한 히알루로니다제의 용도

출원인들은 특정 안과 질환의 치료에 있어서, 실험 투여량으로 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 1회 투여하여 효능을 추가로 관찰했다. 증식성 당뇨병성 망막증, 연령-관련된 황반 변성, 약시, 색소성 망막증, 황반 구멍, 황반 침출액 및 유양포 황반 부종을 포함하는 예비 진단된 안과 질환을 갖고 있는 환자들은 히알루로니다제 ACS로 치료한 경우 이러한 질환의 임상학적 증상에 있어서 개선을 나타냈다.

또한, 출원인들은 본 발명의 히알루로니다제 ACS 제제가 안구에 독성 손상을 주지않고 1 IU의 투여량 또는 과량으로 초자체내 투입될 수 있고, 따라서 초자체의 신속한 액화, 망막 및 기타 조직으로부터(예를 들면, 망막상막, 황반) 초자체의 동시 발생 단절 또는 분리를 달성할 수 있다. 이러한 초자체의 액화 및 분리의 결과로서, 망막 및 기타 조직상의 초자체의 물리적 인력은 최소화되고, 초자체내 액의 자연적인 턴오버 속도는 가속화된다. 따라서, 출원인의 히알루로니다제 ACS 제제은 초자체의 액화/단절 및(또는) 안구의 후실 및(또는) 후실에 인접한 조직(예를 들면, 망막 또는 황반)으로부터 독소 또는 기타 유독한 물질(예를 들면, 맥관형성 요인, 부종액 등)의 가속화된 제거에 의해 이익을 얻는, 다수의 질환(예를 들면, 증식성 당뇨병성 망막증, 연령-관련된 황반 변성, 약시, 색소성 망막증, 황반 구멍, 황반 침출액 및 유양포 황반 부종) 치료에 특히 적절하다. 또한, 초자체의 액화는 중합된 초자체의 형태인, 혈관신생의 보조에 필요한 매트릭스를 제거하는 것으로 믿어진다. 따라서, 본 발명은 망막 혈관신생의 발생을 예방하고 감소시키는데 유용하다.

추가로, 다수의 안과 질환은 혈액-망막의 불안정화가 질환의 원인이다. 불안정화는 맥락막모세혈관의 다양한 성분(예를 들면, 혈청 성분, 리피드, 단백질)이 초자체실에 들어가 망막 표면에 손상을 주게한다. 또한, 이러한 불안정화는 혈관신생으로 공지된 초자체실의 침윤에 대한 전조이다.

따라서, 본 발명의 실시양태는 안구의 혈관 분포에 대한 손상 또는 병의 상태로부터 야기되거나 혈액망막관문에 손상을 주는 포유류 안구의 다양한 질환을 예방 및 치료하는 것에 관한 것이다. 그러한 질환의 예로는 증식성 당뇨병성 망막증, 연령-관련된 황반 변성, 약시, 색소성 망막증, 황반 구멍, 황반 침출액, 유양포 황반 부종 및 이러한 질환의 임상학적 증상이 본 발명의 히알루로니다제 ACS의 치료에 반응하는 기타의 것들이 포함된다.

하기는 상기 기술한 히알루로니다제 ACS 제제를 사용하는 실시예이며, 기술된 안과 질환을 개선한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 초자체의 액화를 유도하는 히알루로니다제 ACS 이외의 다른 효소의 사용을 고려하고 있다. 본 발명에 사 용가능한 대체 효소의 예로는 기타 히알루로니다제 제제, 콘드로이티나제 ABC, 콘드로이티나제 AC, 콘드로이티나제 B, 콘드로이틴 4-술파타제, 콘드로이틴 6-술파타제 및 B-글루쿠로니다제와 같은 기타 글리코사미노글리카나제 효소가 포함된다. 콜라게나제 또한 고려하고 있다. 프로테아제도 추가로 계획하고 있다.

본 발명의 방법을 수행하여 히알루로니다제 ACS 이외의 다른 효소를 사용하기를 원하는 당분야의 숙련자는 적절한 효소 및 그의 투여량을 선택함에 있어 본원의 교시를 사용할 것이다. 구체적으로는, 효소-기질 특이성을 논의하는 실시예 및 비-독성 연구가 본 발명과 함께 사용될 경우 그들의 유효성을 확립하기위해, 대체 효소 후보자를 사용하여 수행될 것이다. 따라서, 본원에 포함된 교시는 망막 또는 기타 안구조에 손상을 일으키지 않으면서 초자체의 액화를 증진시키는 실질적으로 비-독성인 효소를 판별하기 위해 사용될 수 있다.

증식성 당뇨병성 망막증(PDR)의 히알루로니다제 치료

당뇨병성 망막증은 현역 세대에 있어서 시력 저하의 주된 원인이다. 망막증의 발생은 7년간 당뇨병을 앓아온 환자의 약 50%, 20년을 초과하여 질환을 앓아온 환자의 대략 90%에 달하며, 질환 상태의 시간에 따라서 증가한다. 미국인 중 700000명 정도가 PDR에 걸려있는 것으로 평가된다.

당뇨병의 망막혈관의 귀결은 본질적으로 미세혈관의 누출 및 만성 고혈당증에서 야기되는 모세관 비관류로 부분적으로 이루어진다. 미세혈관의 누출은 망막 부종, 리피드 침출액 및 망막내 출혈을 발생시킬 수 있다. 모세관 비관류는 망막내 미세혈관 비정상화(IRMA)의 형성을 발생시킨다. 이러한 비정상화는 당뇨병-중 개된 세동맥 변성에 의해 혈관 분포를 빼앗긴 망막 지역을 관류하여 형성되는 동정맥의 전환이다.

모세관 비관류의 지역에 있어서 저산소의 망막으로부터의 혈관 내피 성장 인자의 발현은 망막외부 혈관신생을 발생시키는 것으로 생각된다. 그러한 혈관신생 및 그의 연관된 섬유 성분은 자발적으로 관여하거나 초자체 출혈 또는 견인성 망막 분리에 의해 악화될 수 있다. 혈관신생은 망막 맥관구조의 조밀한 내피 접합부로 누출되기 때문에 이러한 새로운 혈관으로부터 염료의 다량 누출에 의해서 형광 조영도에 용이하게 나타낼 수 있다. 저산소 망막 영역에 있어서 손상된 축삭형질의 흐름은 면 양모 반을 발생시킨다.

증식성 당뇨병성 망막증(PDR)은 PDR이 초기 단계에서 대부분 증상을 나타내지 않기 때문에 초기 확인을 위하여 세심한 당뇨병 검사가 요구된다. 증식성 당뇨병성 망막증은 (1) 비증식성 망막증, (2) 예비증식성 망막증, (3) 증식성 망막증과 같은 3종의 부속군으로 분류될 수 있다. 각 분류는 특정한 형태적 특성을 갖는다. 비증식성 망막증의 특징에는 모세관 미세 맥관병(미세혈관 장애 및 투과성 변화, 모세관의 비관류, 망막 모세관 미세동맥류, 기준막 혼탁화 및 내부 미세혈관 비정상화(IRMA)), 망막내 출혈, 침출액 및 황반 변화가 포함된다. 예비증식성 망막증은 비증식성 망막증에 대해 기술한 임의의 또는 모든 변화 및 현저한 맥관 비딩(beading), 면-양모 침출액, 광범한 IRMA 및 광범한 망막 허혈에 관한 것이다. 증식성 망막증은 외부망막 혈관신생 및 섬유성 조직 증식, 초자체 변질 및 출혈, 황반 질환 및 망막 분리에 관한 것이다.

섬유혈관 조직의 생성은 초자체에 의해 중개된 망막 손상을 야기하기 때문에 PDR의 특히 중요한 합병증이다. 섬유혈관 조직은 후부 유리모양의 막과 단단하게 유착을 생성하는 예비망막의 막을 형성할 수 있다. 이러한 유착은 망막에 대한 초자체의 인력을 전송하는 책임이 있으며, 이는 망막 분리를 발생시킬 수 있다.

초자체 기재는 보통 인접한 망막 및 마르테지아니(Martegiani)의 고리라고 공지된 안신경 두부의 외부 주위에 단단히 부착된다. 마르테지아니의 고리와 초자체 기재간의 모든 디른 위치에 있어서의 망막에 대한 초자체의 부착은 보다 덜 단단하다. 망막으로부터의 혈관신생은 신경 두부로부터 초자체로 또는 안저의 다른 곳으로 연장되는 혈관 가닥을 형성한다. 이러한 가닥의 수축은 부분적 또는 완전한 망막 분리를 야기할 수 있다.

황반에서의 망막 분리는 PDR의 주된 합병증이다. PDR에 의해 야기되는 대부분의 망막 분리는 구멍없이 견인 분리로서 시작되지만, 질환에 있어서 이후의 시점에서 망막 구멍의 형성에 의해서 파열성이 될 수 있다. 견인 분리는 비정상의 초자체망막 접착 또는 섬유성 밴드의 수축 및 망막의 상승과 함께 초자체 견인에 의해서 야기된다.

본 발명은 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 주사하여 예비증식성 및 증식성 상태에 있어서 PDR의 치료에 관한 것이다. 특정한 메카니즘에 한정됨 없이, 초자체내로의 히알루로니다제 ACS의 주사는 초자체의 액상의 제거를 증진하는 것으로 믿어진다. 중앙 초자체로부터 맥락막으로의 초자체내로 주사된 삼중수소화된 물의 전달 속도는 주사된 히알루로니다제 ACS에 의해 초자체 히알루론산의 탈중합화 후 현저하게 증가하였다. 본 발명은 이러한 관찰을, 예를 들면, 다양한 성장 유도 요인 및 PDR의 존재에 의해 초자체로 누출된 기타 혈청 생성물의 제거를 증진하기 위해서 초자체를 액화하는데 사용한다. 또한, 본 발명의 히알루로니다제 ACS 치료는 그 단독 또는 기타 PDR의 치료와 조합하여 수행될 수 있다.

<실시예 5>

예비증식성 당뇨병성 망막증의 치료

실시예 5에서, 예비증식성 당뇨병성 망막증을 나타내는 당뇨병 환자에게 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 주사하여 이러한 당뇨병 합병증을 치료한다. 이러한 치료의 목적은 외부망막 혈관신생 및 섬유성 조직 증식, 초자체 변질 및 출혈, 황반 질환 및 망막분리에 의해 나타나는 증식성 당뇨병성 망막증의 발생을 감소시키고 예방하는 것이다.

일단 환자가 당뇨병으로 진단되면, 증가된 안과 관리정보조사를 수행하며, 이러한 질환을 앓아온 개인의 높은 비율이 후에 증식성 당뇨병성 망막증(PDR)으로 발전하였다. 이러한 증가된 관리정보조사에는 정맥 비딩, IRMA 및 망막 허혈의 정도를 검사하기 위한 주기적 망막 검사 및 형광 혈관 조영도가 포함된다.

예비증식성 당뇨병성 망막증이 증식 단계에 도달하기 시작한 경우, 히알루로니다제 ACS 치료가 시작된다. 이 단계는 2 이상의 4분원에서 정맥 비딩, 1 이상의 4분원에서 IRMA 및(또는) 모든 4분원에서 미세동맥류 및 반점 출혈의 존재로서 정의된다. 일단 이러한 징후가 존재하면, 본 발명의 히알루로니다제 ACS 치료 방법이 개시된다.

환자는 안구 건강의 기준선을 정하기 위해 완전한 안과 검사를 받는다. 안과 검사에는 간접 검안경 검사법, 슬릿-램프 생체 현미경법, 말초 망막 검사법, 안구내 압력 측정법, 시각 명료성(보조된 것 및 최고로 보정된 것) 증후학, 안저 검사법, 형광 혈관 조영법, 망막전도 검사법 및 A-스캔 측정법이 포함된다.

예비 검사후, 히알루로니다제 ACS를 환자의 영향받은 안구의 초자체내로 주사하였다. 안구 모두가 영향을 받은 경우, 개별적으로 치료할 수 있다. 치료받은 안구는 상기 기술된 50:1의 50 IU의 히알루로니다제 ACS 안약 용액을 초자체내로 주사하고 초자체 히알루론산의 탈중합화를 촉진시켜 초자체를 액화한다.

치료후, 환자의 안구를 1, 2, 7, 15, 30 및 60일 차에 검사한다. 각 검사일에 환자의 초자체 액화를 검사한다. 추가로, 환자는 공막의 감압을 사용하는 간접 검안경 검사법을 사용하여 후부 초자체 분리에 대하여 검사를 받는다. 최종적으로 환자에 의해 나타나는 PDR의 정도는 주기적인 망막 검사 및 정맥 비딩, IRMA 및 망막 허혈의 정도를 검사하기 위한 형광 혈관 조영도를 통해 연속적으로 검사된다.

<실시예 6>

증식성 망막증의 치료

본 실시예에서, 증식성 당뇨병성 망막증을 나타내는 당뇨병 환자에게 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 주사하여 이러한 당뇨병 합병증을 치료한다. 이러한 치료의 목적은 증식성 당뇨병성 망막증의 정도를 감소시키고, 추가로 임의의 외부망막 혈관신생 조직의 제거후 질환의 징후를 예방하며, 망막 분리의 가능성을 감소시키는 것이다.

증식성 당뇨병성 망막증을 나타내는 환자에게 본 발명의 히알루로니다제 ACS 치료를 혈관신생 조직의 수술 치료와 병행하여 수행한다. 증식은 대개 매우 작은 섬유성 조직 성분을 갖는 새로운 혈관의 형성으로 시작된다. 이들은 혈관의 외피세포로 분화되는 초생의 간엽 성분으로부터 기인한다. 새로 형성된 혈관 채널은 섬유성 화생, 즉 혈관아세포의 아체가 섬유성 조직으로 전환된다.

새로운 혈관은 형광을 누출하며, 증식의 존재는 혈관 조영법으로 특별히 인식가능하다. 새로운 혈관 및 섬유 조직은 내부 제한막을 통과하고, 내부 제한막과 후부 유리 모양막간의 계면에서 수지상 분기를 나타낸다. 유관 조직은 후부 유리 모양막과 밀집 유착을 생성하는 예비망막의 막을 형성할 수 있다. 이러한 유착은 이후 초자체 수축의 단계 중 망막에 초자체의 인력을 전송하는 책임이 있기 때문에 매우 중요하다.

PDR의 증식 단계는 신규 혈관, 안신경의 판상 또는 안신경 내의 신규 혈관, 심각한 신규 혈관(안신경에서 1/3의 판 영역의 혈관신생 또는 다른 경우에 안신경에서 1/2의 판 영역의 혈관신생에 의해 정의됨) 및 예비망막 또는 초자체 출혈과 같은 특징 중 3종 이상의 존재로서 정의된다.

증식 단계에 들어선 것으로 진단되면, 환자는 안구 건강의 기준선을 세우기 위해 완전한 안과 검사를 받는다. 안과 검사에는 간접 검안경 검사법, 슬릿-램프 생체 현미경법, 말초 망막 검사법, 안구내 압력 측정법, 시각 명료성(보조되지 않은 것 및 최고로 보정된 것) 증후학, 안저 검사법, 형광 혈관 조영법, 망막전도 검사법 및 A-스캔 측정법이 포함된다.

예비 검사후, 히알루로니다제 ACS를 환자의 영향받은 안구의 초자체내로 주사하였다. 안구 모두가 영향을 받은 경우, 개별적으로 치료할 수 있다. 치료받은 안구는 상기 기술된 50:1의 50 IU의 히알루로니다제 ACS 안약 용액을 초자체내로 주사하고 초자체 히알루론산의 탈중합화를 촉진시켜 초자체를 액화한다. 초자체의 탈중합화에 추가로, 혈관신생 조직 또한 전망막의 광선응고법을 사용하여 이후 망막에 손상을 최소화하기 위해 직접적으로 치료된다.

전망막 광선응고법(PRP)은 본 발명의 히알루로니다제 ACS 치료와 병행하여 PDR을 나타내는 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 전망막 광선응고법은 레이저 광선응고법의 형태이다. 현재 아르곤 녹색(614 nm), 아르곤 청색-녹색(488 및 514 nm), 크립톤 적색(647 nm), 조정가능한 염료, 다이오드 및 크세논 아크 레이저와 같은 레이저가 망막 수술에 사용되고 있다. 레이저의 에너지는 인접한 구조에 열효과를 생성하는 색소(멜라닌, 크산토필 또는 헤모글로빈)를 함유하는 조직에 의해서 주로 흡수된다. 크립톤 적색 레이저는 투과하기에 동일한 수준으로 생성하는데 보다 큰 에너지를 필요로하는 아르곤 레이저보다 핵의 공막 백내장 및 초자체 출혈을 보다 잘 통과하기 때문에 치료에 바람직한 방법이다.

레이저 망막 수술 중 사용되는 파라미터는 광선응고법의 목적에 따라 개질될 수 있다. 보다 낮은 출력 조절에서, 보다 긴 치료 지속시간을 사용하고 보다 큰 점의 크기를 생성하여, 레이저는 작은 혈관에 응고 효과를 갖는다. 초점 레이저 광선응고법이 미세동맥류의 누출을 막기위해 당뇨병에 사용된다. 레이저 점은 미 세동맥류 바로 위에 놓이고 약간의 백화 및 동맥류를 폐쇄시킨다. 망막의 부종 영역상에 격자상으로 사용될 경우, 레이저는 미세혈관 누출을 감소시킬 수 있다. 보다 높은 에너지 수준에서, 조직의 레이저 용융이 가능하다. 전망막 광선응고법은 망막 조직을 파괴하고, 안구의 허혈 조직의 양을 감소시킴으로써 유효한 것으로 생각된다. 융합 레이저 점은 혈관신생막상에 사용되어 비정상적인 혈관을 없앨 수 있다.

본 발명은 특별한 치료 순서를 필요로 하지 않음을 이해해야 한다. 한 실시양태에서, 환자를 우선 히알루로니다제 ACS로 치료한 후 레이저 치료를 수행한다. 다른 실시양태에서, 환자는 우선 레이저 치료를 받은 후, 본 발명의 히알루로니다제 ACS 치료를 수행한다.

치료후, 환자의 안구를 1, 2, 7, 15, 30 및 60일 차에 검사한다. 각 검사일에 환자의 초자체 액화를 검사한다. 추가로, 환자는 공막의 감압을 사용하는 간접 검안경 검사법을 사용하여 후부 초자체 분리에 대하여 검사를 받는다. 최종적으로 환자에 의해 나타나는 PDR의 정도는 주기적인 망막 검사 및 정맥 비딩, IRMA 및 망막 허혈의 정도를 검사하기 위한 형광 혈관 조영도를 통해 연속적으로 검사된다. 초자체의 신규 중합 또는 불완전한 탈중합화의 증거는 상기 기술된 바와 같이 환자의 반복 치료로 정당화 된다.

연령-관련된 황반 변성의 히알루로니다제 치료

또한, 본 발명은 연령-관련된 황반 변성(AMD)의 치료에 있어서의 유용성에 관한 것이다. 연령-관련된 황반 변성은 점진적인, 종종 좌우 양측 시력의 감소로 이루어진다. 이는 성인에게 있어서 시력 저하의 가장 일반적인 원인이다. 이는 노령화 및 맥락막모세혈관 및 구심성 망막 혈관에 있어서의 혈관 질환에 의해서 야기된다. AMD에는 기본적으로 "건식" 및 "습식"의 2종의 형태학적 형태가 있다.

AMD의 근원적인 비정상은 부르크(Bruch) 막 및 망막 색소 상피(RPE)의 수준에서의 복구 작용의 변화이다. 그러한 변화를 나타내는 장애는 드루즈(druse)이다. 임상학적으로, 초자소구안병(드루즈의 복합 형태)은 RPE의 수준에서 작고 황백색의 침착물로 나타난다. 초자소구안병은 경질, 연질 또는 판상의 초자소구안병으로 분류될 수 있다.

본 발명은 습식 및 건식 형태의 AMD의 치료 및 예방 모두에 관한 것이다. 습식 형태의 질환에서, 상태는 맥락막모세혈관에 영향을 주는 것으로 생각된다. 맥락막모세혈관은 안구에 혈관을 분포시키는 맥락막의 성분이다. 맥락막모세혈관은 색소 상피 및 망막의 외부층에 대부분의 영양분을 공급하는 풍부한 모세혈관의 망으로 이루어져 있다. 맥락막모세혈관의 손상은 궁극적으로 혈관신생 합병증, 황반 변성의 원인이 되는 것으로 생각된다.

건식 형태에서, 비원판형의 황반 변성은 근원적인 맥락막모세혈관의 부분적 또는 전체적인 소멸로부터 야기된다. 검안경 검사에 의해 망막 색소 상피의 변성 및 구멍 형성이 관찰될 수 있다. 또한, 칼슘 킬레이트 또는 단백성 및 기타 물질의 색소 상피하 침착물이 관찰될 수 있다. 건식 ADM에서, 제2 망막 변화는 일반적으로 점진적으로 발생하며, 점진적인 시각 명료도의 저하를 가져온다. 그럼에도 불구하고, 환자들의 일부에서, 심각한 시력의 저하가 나타났다.

본 발명은 건식 ADM을 치료하고 초자체의 액화를 통해 황반 변성을 예방하는 것에 관한 것이다. 초자체의 액화는 황반 변성을 일으키는 침착된 물질을 망막으로부터 제거하는 속도를 증가시킨다.

습식 ADM은 대부분 흔히 맥락막모세혈관의 부족으로 인해 야기되며, 색소 상피하 혈관신생을 야기한다. 또한, 혈관신생은 소낭성 손상의 결과로서 부적절한 산화에 대한 망막 혈관신생의 수용으로서 발생하는 것으로 생각된다. 혈관신생은 색소 상피 및 감각중추의 망막의 분리와 같은 다수의 기타 질환을 야기할 수 있다. 전형적으로 질환은 대개 60세 이후에 시작되고, 양쪽 성별에서 동등하게 질환을 나타내는 환자들의 양쪽 안구 모두에서 나타난다.

연령-관련된 황반 변성의 가장 중요한 합병증은 새로운 혈관이 성장을 통한 안구의 부루크 막에 있어 결함의 발생이다. 이러한 상피 혈관신생은 망막내 및 망막하의 침출 침착물의 생성을 발생한다. 또한 혈관신생은 초자체내로 출혈을 일으키고, 이는 망막의 간상체 및 추상체의 변성 및 유양포 황반 부종(하기에 논의함)을 야기할 수 있다. 황반 구멍은 비가역적인 시력 저하를 일으킬 수 있다.

비록 AMD 환자 중 단지 10%만이 영향을 받을지라도, AMD의 혈관신생 합병증은 심각한 시력 저하의 경우에 대해 압도적으로 대다수를 차지한다. 위험 요인에는 노령화, 연성 초자소구안병, 비지도상 수축, 가족의 병력, 원시 및 망막 색소 상피 분리가 포함된다. AMD에 있어서 맥락막의 혈관신생의 증상은 변시증, 부중심암점 또는 감소되는 중심시각이 포함된다. 검안경 검사의 조사 결과에는 망막하 액, 혈액, 침출액, RPE 분리, 포낭성 망막 변화 또는 회색이 도는 녹색의 망막하 혈관신생 막의 존재가 포함된다. 형광 혈관 조영법은 종종 유효한 진단 방법이다. 이 진단 과정 중에 손상 부분의 주변의 혼탁화 또는 미확인의 원천에서의 누출로 나타나는 망막하 공간에서의 염료의 진행성 고임은 질환의 지표이다. 형광 혈관 조영법에 의해 묘사되는 맥락막의 혈관신생 막의 기타 성분에는 증가 차단된 형광, 수평 차단된 형광, 혈액 및 원판형의 흉터가 포함된다.

혈관신생 AMD에 대한 본 이해는 전형적인 맥락막 혈관신생이 급속한 시력 저화와 가장 강하게 연관된 손상 성분임을 제시한다. 따라서, AMD의 치료는 손상의 모든 혈관신생 및 섬유혈관 성분으로 확장되어야 한다. 현재, 치료법은 단지 전형적인 혈관신생이 잘 구별된 경계를 갖는 경우에만 가능하고, 광선응고법이 유용한 것으로 나타났다. 외부중심와 맥관막의 혈관신생을 갖는 안구에서(중심와 중심으로부터 >= 200 마이크론), 아르곤 레이저 광선응고법은 5년차에서의 심각한 시력 저하의 발생을 64%에서 46%로 감소시켰다. 재발성 혈관신생은 대개 치료 후 최초 1년 내에 레이저-치료된 안구의 1/2에서 발병된다. 재발성 혈관신생은 변함없이 심각한 시력 저하의 발생에 연관된다.

근방중심와 맥관막의 혈관신생(중심와 중심으로부터 1 내지 199 마이크론)을 갖는 안구에서, 크립톤 레이저 광선응고법은 비록 치료되지 않은 군과 치료된 군의 차이가 5년차에서 보다 덜 현저하지만, 1년차에서의 심각한 시력 저하의 발생을 45%에서 31%로 감소시켰다.

그러나, 레이저 치료법은 AMD를 치료하는 필수적인 치료 방법이며, 본 발명은 혈관신생의 재발을 감소시킴으로써 이러한 방법을 증대시킨다.

<실시예 7>

연령-관련된 황반 변성의 치료

본 실시예에서, 연령-관련된 황반 변성의 징조가 나타난 환자에게 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 주사하여 치료하였다. 이러한 치료의 목적은 혈관신생, 황반 질환 및 망막 손상의 발생을 감소시키거나 예방하는 것이다.

환자가 60세가 되면, 증가된 안과 관리정보조사를 수행하여 ADM의 존재를 확인하였다. 이러한 증가된 관리정보조사에는 주기적 망막 검사 및 망막하 액, 혈액, 침출물, RPE 분리, 낭포성 망막 변화의 존재 또는 회색빛이 도는 녹색의 망막하 혈관신생막의 존재를 검사하기 위한 형광 혈관 조영도를 포함한다.

ADM이 진단되면, 히알루로니다제 ACS 치료의 사용법은 광선응고법과 같은 기타 치료법의 존재 또는 비존재하에 개시된다. 치료의 최초 단계에서, 환자는 안구 건강의 기준선을 정하기 위해 완전한 안과 검사를 받는다. 안과 검사에는 간접 검안경 검사법, 슬릿-램프 생체 현미경법, 말초 망막 검사법, 안구내 압력 측정법, 시각 명료성(보조되지 않은 것 및 최고로 보정된 것) 증후학, 안저 검사법, 형광 혈관 조영법, 망막전도 검사법 및 A-스캔 측정법이 포함된다.

예비 검사후, 히알루로니다제 ACS를 환자의 영향받은 안구의 초자체내로 주사하였다. 안구 모두가 영향을 받은 경우, 개별적으로 치료할 수 있다. 치료받은 안구는 상기 기술된 50:1의 50 IU의 히알루로니다제 ACS 안약 용액(상기한 바와 같음)을 초자체내로 주사하여 초자체 히알루론산의 탈중합화를 촉진시켜 초자체를 액화한다.

안구에 주사된 히알루로니다제 ACS의 레이저 광선응고법 치료가 요구될 수 있다. 실시예 5 및 6에 기술된 레이저 치료 프로토콜은 AMD 치료시 지켜져야만 한다. 별도의 실시양태에서, 광선응고법 치료는 본 발명의 효소 치료 이전에 수행된다.

치료후, 환자의 안구를 1, 2, 7, 15, 30 및 60일 차에 검사한다. 재발 가능성 때문에, 환자는 이후 개월 기준으로 주기적인 검사를 받아야만 한다. 각 검사일에 환자의 초자체 액화를 검사한다. 추가로, 환자는 공막의 감압을 사용하는 간접 검안경 검사법을 사용하여 후부 초자체 분리에 대하여 검사를 받는다. 최종적으로 환자에 의해 나타나는 ADM의 정도는 주기적인 망막 검사 및 망막하 액, 혈액, 침출물, RPE 분리, 낭포성 망막 변화의 존재 또는 회색이 도는 녹색의 망막하 혈관신생막의 존재를 검사하기 위한 형광 혈관 조영도를 통해 연속적으로 검사된다. 추가의 히알루로니다제 ACS 및(또는) 레이저 치료가 혈관신생의 재발 징후 또는 징후가 관찰되는 경우 필요할 수 있다.

하기 실시예는 광선응고법의 사용없이 본 발명의 효능을 보이고 있다.

<실시예 8>

초자체내 히알루로니다제 주사 후 황반의 변성 증상에 있어서의 개선

연령-관련된 황반 변성의 병력이 있는 79세를 넘은 노인 남성이 환자였다. 그의 우측 안구의 보정되지 않은 시력은 20:400 이었다. 100 IU의 히알루로니다제 ACS를 환자의 우측 안구의 초자체내로 1회 주사 투여하였다. 다른 쪽 안구는 치료하지 않은 채 놔두었다.

환자를 히알루로니다제 ACS 투약후 반복적으로 검사하고 환자의 좌측(치료되 지 않음) 안구가 시력은 변화가 없었으나, 환자의 우측(치료됨) 시력은 하기와 같이 개선됨이 관찰되었다.

시간(투약 후)	시력(보정되지 않음)	시력(보정됨)
기준선	20:400	없음
3일	cf@1ft	없음
1주	20:400	없음
2주	20:400	없음
4주	20:300	없음

*cf는 "손가락을 셈"을 의미함

히알루로니다제 ACS의 어떠한 부작용도 본 실험에서는 관찰되지 않았다.

약시의 히알루로니다제의 치료

용어 "약시"는 그리스어에서 유래되었으며 분명하지 않은 시력(amblys = 분명하지 않은, ops = 안구)을 의미한다. 나쁜 시력은 뇌의 시각 영역의 비정상적 발생에 의해 야기되고, 이는 초기 시각 발생 중 비정상적인 시각 자극 때문이다. 약시와 관련된 병의 상태는 안구에 특정적인 것이라기 보다는, 측면의 굽은 뉴클레우스 및 줄무늬 대뇌 피질을 포함하는 뇌의 시각 영역에 관한 것이다. 이러한 비정상적 발생은 (1) 원형 뒤틀림이라 불리는 혼탁해진 망막 화상, (2) 피질의 억압 또는 (3) 피질의 억압에 더해진 원형 뒤틀림 모두와 같은 세가지 메카니즘에 의해서 야기된다. 본 발명은 우선적으로 매체의 혼탁도에 의해 야기되는 원형 뒤틀림에 관련된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 초자체 혼탁도의 문제를 제기한다.

약시는 대개 시각 명료도의 2이상의 스넬른(Snellen) 선의 상이함으로서 정의된다. 약시 치료에 있어 중요한 것은 초기 발견 및 초기 개입이다. 초자체 혼탁화에 의한 약시를 치료하기 위한 방법은 초자체의 혼탁화를 대체하여 명료한 시 력을 얻도록 명료한 망막 화상을 제공하는 것이다.

이러한 실시예에서, 초자체 혼탁화에 의한 약시 환자에게 히알루로니다제 ACS를 초자체내로 주사하여 치료하였다. 본 치료의 목적은 초자체내의 액의 교환 속도를 증가시킴으로써 초자체의 혼탁도를 감소시키는 것이다.

<실시예 9>

히알루로니다제 ACS의 초자체내 투여 치료 후 약시 증상에 있어서의 개선

약시 병력이 있는 40세의 남성이 환자였다. 그의 우측 안구의 보정되지 않은 시력은 20:200 이었다. 1회의 100 IU의 히알루로니다제 ACS를 환자의 우측 안구에 초자체내로 주사 투여하였다. 다른 쪽 안구는 치료하지 않은 채 놔두었다.

환자를 히알루로니다제 ACS 투약후 반복적으로 검사하고 환자의 좌측(치료되지 않음) 안구가 시력은 변화가 없었으나, 환자의 우측(치료됨) 시력은 하기와 같이 개선됨이 관찰되었다.

시간(투약 후)	시력(보정되지 않음)	시력(보정됨)
4주	20:200	20:70(-1)
8주	20:200	20:60(-2)
12주	20:200	20:60(-1)
52주	20:200	20:60(-1)

히알루로니다제 ACS의 어떠한 부작용도 이 환자에게서 관찰되지 않았다.

색소성 망막증의 히알루로니다제 치료

색소성 망막증(RP)은 시각을 제한하는 좌우 양측의 야맹증 및 망막전도의 이상에 의해 특징지워지는 진행성 망막 분해의 유전성 질환을 갖는 사람들을 지칭한다. 초기 증상에는 어둠 적응의 어려움 및 망막중심 시각 손실이 포함된다. 질환이 진행됨에 따라, 시력 저하도 진행되고, 전형적으로 시각의 작은 중추 영역이 사 라지고, 결국에는 중심 시각에도 영향을 받게 된다. 또한, 중심의 명료도도 유양포 황반 부종, 황반 위축 또는 후부의 수정체피막하백내장의 발전에 의해 질환의 과정 중 초기에 영향을 받을 수 있다. RP는 빛의 변환에 중요한 광수용체의 외부 부분에 있어서 1종 이상의 단백질의 비정상적 생산이 일어나는 많은 질환의 집단을 나타낸다.

RP의 한 임상학적 결과는 주중심와 모세관 및 안신경 두부의 혈액망막관문의 불안정화이다. 이러한 불안정화는 혈관 조영법에 의해 관찰된 형광 누출을 발생시킨다. 누출에 추가로, 외부 그물망층 중 미세포낭으로서 액이 발생하고 관찰된다. 낭포를 채우는 이러한 액은 결과적으로 파열하여, 망막층에 손상을 준다. 본 발명은 미세포낭에 축적되는 조직액의 제거를 가속화함으로써 RP 관련된 망막 손상을 치료하는 것이다.

<실시예 10>

히알루로니다제의 초자체내 투여 후 색소성 망막증의 개선

색소성 망막증의 병력이 있는 59세의 노인 남성이 환자였다. 그의 좌측 안구의 보정되지 않은 시력은 20:400 이고 보정된 것 또한 20:400 이었다. 100 IU의 히알루로니다제 ACS를 환자의 좌측 안구의 초자체내로 1회 주사 투여하였다. 다른 쪽 안구는 치료하지 않은 채 놔두었다.

환자를 히알루로니다제 ACS 투약후 반복적으로 검사하고 환자의 우측(치료되지 않음) 안구가 시력은 변화가 없었으나, 환자의 좌측(치료됨) 시력은 하기와 같이 개선됨이 관찰되었다.

시간	안내 압	보조되지 않은 시각 명료도	최고로 보정된 시각 명료도
기준선	17 mm	20/400	20/400
치료 후 1일	26 mm	HM†/1ft	HM/1ft
1주	-----	HM/1ft	HM/1ft
2주	14 mm	cf‡@3ft	cf@3ft
3주	14 mm	20:300	20:300
4주	12 mm	20:200	20:80
8주	15 mm	20:80	20:40
9주	15 mm	20:60	20:40
10주	18 mm	20:80	20:40

†HM "손의 움직임"을 의미함

‡cf "손가락을 셈"을 의미함

연구 결과는 환자의 시력능에 있어서 보조되지 않은 시각 명료도(20:400에서 20:80으로 개선됨) 및 최고로 보정된 시각 명료도(20:400에서 20:40으로 개선됨) 모두에서 현저한 개선이 있음을 나타냈다. 또한, 치료 기간 중 환자의 안내 압에 있어서 변화가 관찰되었으나, 주사 후 대략 2주에 기준선 수준으로 되돌아감을 보였다. 비록 이러한 결과가 환자 1인에 의한 것일지라도, 추가 연구를 보장하기에 충분하게 가능성이 있음을 보였다.

황반 구멍의 히알루로니다제 치료

황반의 붕괴 또는 파열은 황반 구멍으로 공지되어 있다. 흥미롭게도, 이러한 상태는 대개 60세 내지 80세의 여성 또는 섬광에 의한 손상, 태양에 의한 손상, 공막의 비틀림과 같은 외상 후 또는 포도종의 안구에 발생한다. 증상에는 변시증 및 시각 명료도의 감퇴가 포함된다.

황반 구멍 형성은 후부 초자체의 시네레시스 공극 중 액의 움직임에 연루되어, 후부 피질의 초자체에 의해 유도되는, 망막 표면을 가로지르는 접선 수축으로 부터 야기되는 것으로 생각된다. 후부 초자체의 시네레시스 공극은 황반 구멍을 나타내는 대다수의 환자에 존재한다. 후부 초자체의 겔이 망막 표면으로부터 후퇴하고, 두 표면 사이에 생성된 틈새는 초자체액의 움직임이 망막 표면과 부정적으로 상호작용할 수 있는 영역을 생성한다. 후부 초자체의 시네레시스 공극의 공간내에서 초자체액의 접선 움직임은 망막의 막의 파열을 조장하고, 황반 구멍을 생성하는 것으로 생각된다.

본 발명은 황반 구멍을 형성하는 상태를 제거하기 위하여 초자체를 탈중합하는 히알루로니다제 ACS의 사용에 관한 것이다. 초자체의 탈중합화 중에, 후부 초자체의 시네레시스 공극은 히알루로니다제-중개된 초자체의 재조직화의 결과로서 제거된다. 이 공극의 제거는 초자체와 망막간의 액이 초자체실 주위를 자유롭게 이동하게하여, 망막 표면을 향하는 임의의 해로운 힘을 분산시킨다.

하기 실시예는 황반 구멍 형성의 초기 증상을 나타내는 환자의 치료에 대하여 논의한다.

<실시예 11>

황반 구멍의 치료

황반 구멍 형성의 초기 증상을 나타내는 환자에게 히알루로니다제 ACS를 초자체내 주사하여 치료하였다. 치료받는 환자는 예비 황반 구멍 형성의 다양한 징후를 나타냈다. 이러한 것에는 노란색 중심와 점 또는 고리와 관련된 중심와 기능 저하의 손실을 포함한다. 중심와는 구멍 형성의 지역에서 가늘어지기 시작하고, 손상은 붉은 빛을 띠는 형태로 나타난다. 이러한 단계에서 형광 혈관 조영술은 정 상적으로 나타나거나, 희미한 초형광을 나타낼 수 있다. 상궤를 벗어난 완전한 두께의 열개는 진행된 질환의 초기 단계를 의미한다. 이러한 증상이 관찰되면, 히알루로니다제 ACS 치료가 개시된다.

본 발명의 히알루로니다제 ACS 치료는 황반 구멍의 형성이 진단된 경우 개시된다. 환자는 안구 건강의 기준선을 세우기 위해 완전한 안과 검사를 받는다. 안과 검사에는 간접 검안경 검사법, 슬릿-램프 생체 현미경법, 말초 망막 검사법, 안구내 압력 측정법, 시각 명료성(보조되지 않은 것 및 최고로 보정된 것) 증후학, 안저 검사법, 형광 혈관 조영법, 망막전도 검사법 및 A-스캔 측정법이 포함된다.

예비 검사후, 히알루로니다제 ACS를 환자의 영향받은 안구의 초자체내로 주사하였다. 안구 모두가 영향을 받은 경우, 개별적으로 치료할 수 있다. 치료받은 안구는 상기 기술된 50:1의 50 IU의 히알루로니다제 ACS 안약 용액을 초자체내로 주사하고, 초자체 히알루론산의 탈중합화를 촉진시켜 초자체를 액화한다.

치료후, 환자의 안구를 1, 2, 7, 15, 30 및 60일 차에 검사한다. 각 검사일에 환자의 초자체 액화를 검사한다. 치료의 과정을 검사하기에 특히 효과적인 방법으로 여겨지는 형광 혈관 조영법 또한 수행한다. 추가로, 환자는 공막의 감압을 사용하는 간접 검안경 검사법을 사용하여 후부 초자체 분리에 대하여 검사를 받는다.

황반 침출액의 히알루로니다제 치료제

황반 침출액은 혈액망막관문을 침투하고, 초자체실로 황반을 통해 스며드는 물질이다. 이들에는 연화 및 경화 침출액 두종류가 있다. 연화 침출액은 실제적 으로 침출액이 아니고 허혈성 손상 또는 경색의 위치에서 구근성 팽창을 수행하는 신경 섬유층 중 신경절 세포 엑손의 집단이다. 경화 침출액은 통상 배경 망막 조영법에 있어서 미세혈관 변화의 결과로서 침출된다. 노란색 및 왁스형 경화 침출액은 종종 반점 주위에 고리형 양식으로 침착된다. 그들은 누출 혈관으로부터 혈청 성분의 침출 또는 망막 내의 신경 성분을 분해의 지질 산물로부터 유도된 지질 및 단백질과 같은 물질로 이루어진다. 경화 침출액의 흡수는 우선 대식 세포 흡수에 의해 조정되지만, 이 과정의 속도는 침출이 종종 망막의 비혈관 영역 내의 외부 그물 형태의 층에서 발생하기 때문에 느려질 수 있다. 본 발명은 특히 초자체의 히알루로니다제 ACS의 탈중합화가 증가된 초자체의 수성 성분의 재생 속도를 촉진하기 때문에, 망막의 불안정화에 의해 야기되는 침출 축적의 정도를 완화시키는데 유용하다.

<실시예 12>

황반 침출액의 치료

황반 침출액을 나타내는 환자를 본 발명의 히알루로니다제 ACS의 주사 방법으로 치료하였다. 환자는 안구 건강의 기준선을 정하기 위해 모든 안과 검사를 받았다. 안과 검사에는 간접 검안경 검사법, 슬릿-램프 생체 현미경법, 말초 망막 검사법, 안구내 압력 측정법, 시각 명료성(보조되지 않은 것 및 최고로 보정된 것) 증후학, 안저 검사법, 형광 혈관 조영법, 망막전도 검사법 및 A-스캔 측정법이 포함된다.

예비 검사후, 히알루로니다제 ACS를 환자의 영향받은 안구의 초자체내로 주 사하였다. 안구 모두가 영향을 받은 경우, 개별적으로 치료할 수 있다. 치료받은 안구는 상기 기술된 50:1의 50 IU의 히알루로니다제 ACS 안약 용액을 초자체내로 주사하여 초자체 히알루론산의 탈중합화를 촉진시켜 초자체를 액화한다.

치료후, 환자의 안구를 1, 2, 7, 15, 30 및 60일 차에 검사한다. 각 검사일에 환자의 초자체 액화를 검사한다. 치료의 과정을 검사하기에 특히 효과적인 방법으로 여겨지는 형광 혈관 조영법 또한 수행한다. 추가로, 환자는 공막의 감압을 사용하는 간접 검안경 검사법을 사용하여 후부 초자체 분리에 대하여 검사를 받는다.

유양포 황반 부종의 치료

유양포 황반 부종은 다양한 병인으로부터 유래되는 일반적인 안구 이상이다. 이러한 상태의 대부분의 원인은 주중심와 모세관의 혈액망막관문 및 안신경 두부의 장애로 인한 것이며, 액을 누출시켜 외부 그물망층의 미세낭종에 축적된다. 이 지역은 비교적 가늘고 혈관이 분포된 망막의 지역이다. 임상학적으로, 유양포 황반 부종은 형광 혈관 조영시 벌집 같은 형태를 생성한다. 부종이 진행됨에 따라, 외부 그물망층은 붕괴되며, 층판상의 구멍을 생성한다. 구멍은 망막의 내부층에 한정되거나 결국에는 완전한 황반 구멍으로 진행할 수도 있다.

본 발명은 유양포 황반 부종의 치료 및 히알루로니다제 ACS-중개에 의한 초자체의 탈중합을 통한 황반 구멍 형성의 예방에 관한 것이다.

<실시예 13>

황반 침출물의 치료

유양포 황반 부종 징후를 나타내는 환자에게 실시예 11 및 12에 기술한 바와 같이 히알루로니다제 ACS를 초자체내 주사하여 치료한다.

당분야의 숙련자들은 본 발명이 단지 목하 특정 바람직한 실시양태 및 실시예에 대한 참조로서 상기 기술되었으며, 본 발명을 유형의 형태로 인용하거나 수행할 수 있는 모든 실시양태를 남김없이 기술하는 수고를 행하지 않았음을 인정할 것이다. 실제로, 상기 기술된 특정 실시양태 및 실시예에 대한 다양한 변경이 본 발명이 의도한 진의 및 범위로부터 출발하지 않고서도 수행될 수 있다. 따라서, 상기에 대한 모든 그러한 타당한 변경은 하기 청구항의 범위내에 포함된다.

Claims (24)

1. 히알루론산의 엔도-N-아세틸 헥소사민 결합을 가수분해시키는 히알루로니다제를 포함하며, 상기 히알루로니다제가 티메로살이 없고, 4 내지 20% 구배 SDS PAGE 전기영동에 의해 측정할 때 100,000을 초과하는 히알루로니다제 분자량 분획, 50,000 내지 60,000의 히알루로니다제 분자량 분획 및 20,000 미만의 히알루로니다제 분자량 분획을 근본적으로 갖지 않는 것을 특징으로 하는, 초자체 액화를 유도하여 포유류의 안 질환을 치료하기 위해 초자체내로 투여되는 약제.
2. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 증식성 당뇨병성 망막증을 치료하기 위한 약제.
3. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 연령-관련된 황반 변성을 치료하기 위한 약제.
4. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 약시를 치료하기 위한 약제.
5. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 색소성 망막증을 치료하기 위한 약제.
6. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 황반 구멍(macular hole)을 치료하기 위한 약제.
7. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 황반 침출액(macular exudate)을 치료하기 위한 약제.
8. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 유양포 황반 부종을 치료하기 위한 약제.
9. 제1항에 있어서, 초자체 액화를 수행하여 후부 초자체 분리(PVD)를 유도하기 위한 약제.
10. 삭제
11. 제1항에 있어서, 주사 용액인 약제.
12. 삭제
13. 제1항에 있어서, 5-200 IU의 히알루로니다제를 포함하는 약제.
14. 삭제
15. 삭제
16. 제1항에 있어서, 1 IU의 히알루로니다제를 포함하는 약제.
17. 제1항에 있어서, 다수회 투여 형태인 약제.
18. 제17항에 있어서, 100:1 미만의 주사 용적을 갖는 약제.
19. 삭제
20. 삭제
21. 제1항에 있어서,

    8000 IU 이하의 히알루로니다제;

    5.0 내지 130.0 mg의 락토스; 및

    0.01 내지 100.0 mmol의 포스페이트의 조성을 갖는 주사 용액인 약제.
22. 제1항에 있어서,

    6500 IU의 히알루로니다제;

    5.0 mg의 락토스; 및

    0.02 mmol의 포스페이트의 조성을 갖는 주사 용액인 약제.
23. 제1항에 있어서,

    500 내지 1000 IU의 히알루로니다제;

    5.0 내지 10.0 mg의 락토스; 및

    0.01 내지 10.0 mmol의 포스페이트의 조성을 갖는 주사 용액인 약제.
24. 제1항에 있어서, 히알루로니다제가 양(ovine) 고환 히알루로니다제인 약제.

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