PT983084E - Utilização de hialuronidase na fabricação de uma preparação oftálmica para liquefacção do humor vítreo no tratamento de pertubações oculares - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Utilização de hialuronidase na fabricação de uma preparação oftálmica para liquefacção do humor vítreo no tratamento de perturbações oculares"

Campo do invento O presente invento refere-se em geral a preparações de enzima para administração terapêutica aos olhos de humanos ou doutros animais e, mais particularmente, a um método para a utilização de uma ou mais enzimas para tratar perturbações do olho que afectam a retina e/ou o corpo vítreo do olho de mamífero.

Antecedentes do invento

Anatomia do olho humano

Nos seres humanos, a anatomia do olho inclui um "corpo vítreo" que ocupa aproximadamente quatro quintos da cavidade do globo ocular, por detrás do cristalino. O corpo vítreo é formado de um material gelatinoso, conhecido por humor vítreo. Tipicamente, o humor vítreo de um olho humano normal contém aproximadamente 99% de água conjuntamente com 1% de macromoléculas incluindo: colagénio, ácido hialurónico, glicoproteínas solúveis, açúcares e outros metabolitos de peso molecular baixo. A retina é essencialmente uma camada de tecido nervoso formada sobre a superfície posterior interna do globo ocular. A retina está rodeada por uma camada de células conhecida como a camada coróide. A retina pode ser dividida numa porção óptica que participa no mecanismo visual, e numa porção não óptica que não participa no mecanismo visual. A porção óptica da retina contém os bastonetes e cones, que são os órgãos eficazes da visão, várias artérias e veias entram na retina pelo seu centro, e distribuem-se para fora para proporcionar circulação sanguínea à retina. A parte posterior do corpo vítreo está em contacto directo com a retina. Redes de cordões fibrilares prolongam-se a partir da retina e permeiam ou inserem-se no interior do corpo vítreo de modo a fixar o corpo vítreo à retina. 2 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

As causas, tratamentos e sequelas clínicas de hemorragias vítreas A retinopatia diabética, o trauma e outras desordens oftalmológicas resultam por vezes em ruptura ou derrame de vasos sanguíneos retinianos com hemorragia resultante para o interior do humor vítreo do olho (i.e., "hemorragia vítrea"). Esta hemorragia vítrea manifesta-se tipicamente como uma turvação ou opacificação do humor vítreo. A hemorragia vítrea é por vezes, mas não sempre, acompanhada por rasgão ou descolamento da retina. Nos casos em que a hemorragia vítrea é acompanhada por um rasgão ou descolamento retiniano, é importante que este rasgão ou descolamento retiniano seja prontamente diagnosticado e reparado cirurgicamente. A falha em diagnosticar e reparar prontamente o rasgão ou descolamento retiniano pode permitir que as células fotorreceptoras da retina, na região do rasgão ou do descolamento, se tornem necróticas. Esta necrose das células fotorreceptoras da retina pode resultar em perda de visão. Para além disso, deixar que o descolamento retiniano permaneça não reparado durante um período de tempo prolongado pode resultar em mais hemorragia vítrea e/ou na formação de tecido fibroso no local da hemorragia. Esta formação de tecido fibroso pode resultar na formação de uma ligação fibrosa permanente indesejável entre o corpo vítreo e a retina. O procedimento cirúrgico típico utilizado para reparação de rasgões ou descolamentos retinianos requer que o cirurgião seja capaz de olhar através do humor vítreo, para visualizar as regiões danificadas da retina (i.e., "observação transvítrea da retina"). Quando a hemorragia vítrea ocorre, a presença do sangue hemorrágico dentro do vítreo pode fazer com que o vítreo se torne tão turvo que o cirurgião é impedido de visualizar a retina através do vítreo. Esta turvação hemorrágica do vítreo pode demorar de 6-12 meses, ou mais, a clarificar o suficiente para permitir a observação transvítrea da retina. Contudo, em face das potenciais complicações que podem resultar do diagnóstico ou tratamento tardios de um rasgão ou descolamento retiniano, não é geralmente desejável esperar que ocorra esta depuração natural do sangue hemorrágico.

Adicionalmente, mesmo quando a hemorragia vítrea não é acompanhada por rasgão ou descolamento retiniano, é muitas 3 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ difícil verificar que ο rasgão ou descolamento retiniano não ocorreu, porque o vítreo turvo impede o médico de realizar o exame fundoscópico da retina. Para além disso, a presença de sangue hemorrágico dentro do vítreo pode prejudicar significativamente ou obscurecer completamente a visão do paciente através do olho afectado, e continuará a fazê-lo até o sangue hemorrágico ter sido substancialmente ou completamente eliminado.

Assim, a presença de sangue hemorrágico dentro do corpo vítreo provoca múltiplos problemas clínicos incluindo a) incapacidade para examinar visualmente e diagnosticar o local e a causa da hemorragia e/ou qualquer rasgão ou descolamento da retina associado, b) insuficiência visual total ou parcial no olho afectado, e c) insuficiência ou impedimento da realização de procedimentos cirúrgicos transvítreo do tipo de tratamento tipicamente utilizado para reparar o local de hemorragia e/ou reparar qualquer rasgão ou descolamento retiniano associado.

Nos casos em que a hemorragia vítrea resultou em turvação ou opacificação substanciais do vítreo, o médico assistente pode ter a opção de realizar um procedimento conhecido por vitrectomia, onde a totalidade (ou uma parte) do corpo vítreo é removida do interior do olho, e substituída por um líquido límpido. O desempenho deste procedimento de vitrectomia destina-se a permitir ao cirurgião realizar o exame retiniano necessário e/ou a reparação cirúrgica da hemorragia e de qualquer rasgão ou descolamento retiniano associado. Estes procedimentos de vitrectomia requerem uma elevada perícia, e estão associados a vários inconvenientes, riscos e complicações significativos. Entre estes inconvenientes, riscos e complicações estão o potencial para que o acto de remover o vítreo provoque mais descolamento ou rasgão da retina e/ou para que essa remoção do vítreo cause hemorragia adicional a partir dos já enfraquecidos vasos sanguíneos retinianos.

Aplicações oftálmicas anteriores de hialuronidase e outras enzimas

Num esforço para minimizar o potencial para causar mais descolamento ou rasgão da retina durante a realização da vitrectomia, foi anteriormente proposto na Patente dos E.U.A. n.° 5 292 509 (Hageman) injectar certas enzimas 4 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ glicosaminoglicanase isentas de proteases para o interior do corpo vítreo, para fazer com que o corpo vítreo fosse desprendido ou "desinserido" da retina, antes da remoção do corpo vítreo. Esta desinserção ou desprendimento do corpo vítreo pretende minimizar a probabilidade de ocorrência de mais rasgão ou descolamento da retina à medida que o corpo vítreo é removido. Exemplos de enzimas específicas de glicosaminoglicanase isentas de protease, que podem ser utilizadas para efectuar esta desinserção vítrea, incluem alegadamente: condroitinase ABC, condroitinase AC, condroitinase B, condroitina-4-sulfatase, condroitina-6-sulfatase, hialuronidase e B-glucuronidase.

Ainda que a enzima hialuronidase seja conhecida como utilizável para várias aplicações oftálmicas, incluindo a aplicação auxiliar de vitrectomia descrita na Patente dos E.U.A. n.° 5 292 509 (Hageman), estudos anteriormente publicados têm mostrado que a hialuronidase é tóxica para retina e/ou outras estruturas anatómicas do olho, quando administrada intravítreo em doses superiores a 1 UI, isto é, de 15, 30, 50 e 150 UI de hialuronidase. Ver, The Safety of Intravitreal Hyaluronidase; Gottlieb, J.L.; Antoszyk, A.N., Hatchell, D.L. e Soloupis, P., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 31:11, 2345-52 (1990) . A toxicidade oftálmica de algumas preparações de hialuronidase tem sido confirmada por outros investigadores, que têm proposto que estas preparações de hialuronidase sejam utilizadas como um irritante tóxico para causar neovascularização do olho induzida experimentalmente, em modelos de toxicidade em animais. Ver, An Experimental Model of Preretinal Neovascularization in the Rabbit: Antoszyk, A.N., Gottlieb; J.L., Casey, R.C., Hatchell, D.L. e Machemer, R.; Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 32: 1, 46-51 (1991). A WO 97/18835 refere-se a uma preparação de hialuronidase para administração oftálmica, em particular para fragmentação e remoção de sangue a partir do humor vítreo.

Infelizmente, não era anteriormente conhecido se as toxicidades e actividades terapêuticas reportadas da hialuronidase eram ou não aplicáveis universalmente a todas as preparações de hialuronidase, ou se estas eficácias e/ou toxicidades eram ou não aplicáveis apenas a preparações de hialuronidase contendo certos materiais excipientes ou a 5 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ enzimas de hialuronidase obtidas a partir de fontes especificas. Este é um aspecto importante atendendo ao facto de a pureza e caracterização (e.g., distribuição de pesos moleculares) das várias preparações de hialuronidase, utilizadas na especialidade anterior, poderem variar, dependendo da fonte da hialuronidase e dos solventes e/ou doutros componentes de formulação com os quais a hialuronidase está combinada.

Pureza e caracterização de preparações de hialuronidase anteriormente utilizadas para administração oftálmica O termo "hialuronidase" é vulgarmente utilizado para descrever um grupo de enzimas de endo-B-glucuronidase que despolimerizam certos mucopolissacáridos, tais como o ácido hialurónico. Myer, K. et al., The-Enzymes Vol. 4, 2.a Ed., págs. 447, Academic Press, Inc., New York (1960). A hialuronidase provoca hidrólise das ligações endo-N-acetil-hexosaminicas do ácido hialurónico e dos ácidos de sulfato de condroitina A e C, principalmente em resíduos de tetrassacárido.

Evidência significativa indica que as enzimas de hialuronidase, obtidas a partir de diferentes fontes, diferem em distribuição de pesos moleculares de enzima e em actividades enzimáticas específicas. Esta variabilidade em distribuição de pesos moleculares e em actividade enzimática específica são considerações dignas de nota atendendo ao facto de as enzimas de hialuronidase poderem ser isoladas a partir de uma variedade de fontes, incluindo testículos de bovino, testículos de ovino, certas bactérias tais como Streptomyces e certos animais invertebrados tais como sanguessugas. A preparação de hialuronidase Wydase® é conhecida por ter sido anteriormente administrada aos olhos de mamíferos para várias aplicações clinicas e experimentais, incluindo o tratamento de glaucoma e a promoção da liquefacção do corpo vítreo durante procedimentos de vitrectomia, nos quais o corpo vítreo é retirado do olho.

Ainda que tenha sido noticiado que algumas preparações de hialuronidase exibem efeitos terapêuticos desejáveis, quando injectadas no interior ou administradas topicamente ao olho, as toxicidades potenciais de hialuronidase e/ou do conservante 6 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ timerosal são causa de preocupação no que se refere à segurança da administração clinica de rotina de tais preparações por injecção intra-ocular.

Por conseguinte, existe uma necessidade na especialidade para a formulação e desenvolvimento de uma nova preparação de hialuronidase que possa ser administrada ao olho para niveis de dosagem que são suficientes para conseguir efeitos terapêuticos óptimos, mas que não causam toxicidade ocular.

Adicionalmente, atendendo aos problemas anteriormente descritos associados à lentidão da depuração natural do sangue hemorrágico a partir do corpo vitreo, existe uma necessidade na especialidade para a elucidação e desenvolvimento de novos métodos e procedimentos para acelerar a depuração de sangue hemorrágico a partir do corpo vitreo do olho, de modo a permitir a observação transvitrea do aspecto posterior do olho, incluindo a retina, sem a necessidade de remover o corpo vitreo (i.e.f vitrectomia total ou parcial).

Adicionalmente, existe uma necessidade para prevenção e tratamento de várias perturbações do olho de mamífero que resultam de lesão ou de patologia da vascularização da retina ou que resultam em lesões da barreira hemato-retiniana.

Sumário do invento

Utilização de uma hialuronidase conforme definida nas reivindicações 1 a 18 na preparação de um medicamento para induzir a liquefacção de um humor vítreo para tratar uma perturbação de um olho de mamífero por administração intravítrea a um humor vítreo isento de sangue hemorrágico que permite a observação de uma retina do olho de mamífero não como auxiliar da vitrectomia. É definida como causando hidrólise das ligações endo-N-acetil-hexosamínicas de ácido hialurónico. A hialuronidase está: isenta de timerosal, e essencialmente desprovida de fracções de hialuronidase de pesos moleculares acima de 100 000, entre 50 000 e 60 000, e abaixo de 20 000 conforme determinado por electroforese SDS PAGE gradiente de 4-20%.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 mostra um gel de electroforese com pistas 1-6, as referidas pistas indicando 1) padrões de peso molecular de 7 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ 31 000 a 200 000, 2) hialuronidase de ovino ACS, 3) hialuronidase de bovino tipo Vl-S, 4) hialuronidase de ovino tipo V, 5) hialuronidase de bovino tipo IV-S e 6) hialuronidase de bovino tipo I-S. A Figura 2 é uma tabela que resume a lise de ácido hialurónico determinada zimograficamente, as actividades gelatinoliticas e caseinoliticas da hialuronidase ACS do presente invento, em comparação com hialuronidases de bovino de tipos VI-S, IV-S e I-S e hialuronidase de ovino do tipo V. A Figura 3 é uma tabela que resume os efeitos tóxicos de injecções intravitreo de uma única dose de BSS, BSS + timerosal, hialuronidase ACS e hialuronidase Wydase® em coelhos, de acordo com o Exemplo 1 a seguir. A Figura 4 é uma tabela que resume a eficácia de uma única dose de hialuronidase ACS intravitrea em coelhos, de acordo com Exemplo 2 a seguir. A Figura 5 é uma tabela que resume a segurança e a eficácia de múltiplas doses de hialuronidase ACS intravitrea em coelhos, de acordo com o Exemplo 2 a seguir. A Figura 6 é uma tabela que resume a eficácia da eliminação hemorrágica de uma dose única de hialuronidase ACS em pacientes humanos com retinopatia diabética, de acordo com Exemplo 9 a seguir.

Descrição detalhada do invento A descrição detalhada seguinte e os exemplos que a acompanham são apresentados apenas para efeitos de descrever e explicar certas concretizações preferidas do invento, e não se pretende que limitem de modo algum o âmbito do invento. Método enzimático para aceleração da depuração de sangue hemorrágico a partir do vítreo do olho

De acordo com o invento, a requerente determinou que certos tipos de enzimas, quando postas em contacto com o humor vítreo, após uma hemorragia para o seu interior, acelerarão a velocidade à qual o sangue hemorrágico é eliminado a partir do humor vítreo. 8 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ A este respeito, a requerente concebeu um método para acelerar a depuração de sangue hemorrágico a partir do vítreo do olho, o referido método compreendendo geralmente o passo de pôr em contacto, com o humor vítreo, uma quantidade de hialuronidase numa dose que é suficiente para acelerar a depuração de sangue hemorrágico a partir do vítreo sem causar lesões na retina ou noutros tecidos do olho. Preferivelmente, a hialuronidase é seleccionada para ter uma distribuição de pesos moleculares que permite que a hialuronidase seja administrada intravítreo em doses acima de 1 UI, e preferivelmente acima de 15 UI, e vantajosamente acima de 75 UI, na ausência de timerosal, sem causar danos tóxicos à retina ou a outros tecidos do olho. Este método de eliminação de hemorragia do presente invento pode ser realizado sem qualquer vitrectomia ou outra manipulação cirúrgica ou remoção do humor vítreo, evitando desse modo os riscos e complicações potenciais associadas a estes procedimentos de vitrectomia. A via de administração preferida destas enzimas de eliminação de hemorragia é por injecção intra-ocular directamente no interior do corpo vítreo. Alternativamente, porém, a(s) enzima(s) de eliminação de hemorragia do presente invento podem ser administradas por qualquer outra via de administração adequada (e.g., topicamente) que resulte em distribuição suficiente da(s) enzimas(s) no corpo vítreo para causar o efeito desejado de eliminação de hemorragia. A solução injectável preferida pode conter uma hialuronidase que tenha uma distribuição de pesos moleculares que permite que esta seja administrada intravítreo em doses acima de 1 UI, e preferivelmente acima de 15 UI, e vantajosamente acima de 75 UI, sem causar danos tóxicos ao olho, conjuntamente com ingredientes inactivos que fazem com que a solução seja substancialmente isotónica, e com um pH que é adequado para injecção no olho. Esta preparação preferida de hialuronidase está preferivelmente desprovida de timerosal. Uma tal solução para injecção pode ser inicialmente liofilizada até um estado seco e, depois, pode ser reconstituída antes da utilização. 9 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Uma preparação preferida de hialuronidase para administração oftálmica

Na Tabela 1 mostra-se uma formulação geral para uma preparação de hialuronidase injectável, isenta de timerosal, do presente invento:

Tabela 1

Formulação geral

Ingrediente Quantidade Hialuronidase ACS até 8000 Unidades Internacionais Lactose USP 5,0 mg - 130,0 mg Fosfato USP 0,01 - 100 mmol

Estes ingredientes de formulação são inicialmente dissolvidos em água estéril, sujeitos a filtração asséptica e subsequentemente liofilizados até se obter uma composição seca. A composição liofilizada é embalada para reconstituição subsequente antes da utilização, num solvente adequado tal como solução salina isotónica estéril ou solução salina equilibrada. Esta solução salina equilibrada contém tipicamente: 0,64% de cloreto de sódio, 0,075% de cloreto de potássio, 0,048% de cloreto de cálcio desidratado, 0,03% de cloreto de magnésio hexa-hidratado, 0,39% de acetato de sódio tri-hidratado, 0,17% de citrato de sódio di-hidratado, hidróxido de sódio/ácido clorídrico para ajustar o pH, e tanta água quanta necessária (q.s.) para levar a solução até ao volume final para injecção. O termo "hialuronidase ACS" conforme aqui utilizado descreve uma solução de hialuronidase preferida para injecção intravítrea que está desprovida de timerosal e que está desprovida de fracções de hialuronidase de peso molecular acima de 100 000, entre 50 000-60 000 e abaixo de 20 000. Uma tal hialuronidase está disponível comercialmente na Calbiochem Biochemicals, P.O. Box 12087, La Jolla, CA 92039-2087 (fabricada por Biozyme, San Diego, CA). Os requerentes determinaram que esta distribuição específica de pesos moleculares da hialuronidase ACS resulta em menos toxicidade oftálmica do que outras preparações de hialuronidase, exibindo ao mesmo tempo eficácia terapêutica desejável num certo número de aplicações oftálmicas. 10 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ A Figura 1 mostra um gel de electroforese (SDS-PAGE, gradiente de 4-20%) que demonstra a distribuição de pesos moleculares da hialuronidase ACS preferida, em comparação com a distribuição de pesos moleculares de hialuronidases de bovino tipo vi-s, iv-S e i-S e de ovino tipo v, obtidas na SIGMA Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178. Carregaram-se quantidades padrão (i.e., unidades equivalentes de actividade de hialuronidase) de cada enzima em cada pista (pista 2-6) do gel de electroforese apresentado na Figura 1. A pista 1 do gel de electroforese apresentado na Figura 1 contém marcadores de peso molecular a 200 000, 116 000, 97 400, 66 000, 45 000 e 31 000, respectivamente. As pistas 2-6 do gel de electroforese apresentado na Figura 1 contêm as preparações de hialuronidase respectivas testadas, como se segue:

PISTA 0 QUE ESTÁ NA PISTA 2 Hialuronidase ACS 3 Hialuronidase de bovino tipo VI-S 4 Hialuronidase de ovino tipo V 5 Hialuronidase de bovino tipo IV-S 6 Hialuronidase de bovino tipo I-S A pista 2 mostra que a distribuição de pesos moleculares da hialuronidase ACS inclui fracções de peso molecular de 97 400, 50 000 (aprox.) e 45 000 (aprox.), mas está claramente desprovida de fracções de peso molecular acima de 100 000, entre 50 000-60 000 e abaixo de 20 000.

As pistas 3, 4, 5 e 6 do gel de electroforese da Figura 1 mostram que todas as hialuronidases testiculares de bovino dos tipos VI-S, IV-S e I-S e a hialuronidase testicular de ovino do tipo V testadas diferem da hialuronidase ACS do presente invento por incluírem fracções de peso molecular entre 50 000-60 000 e abaixo de 20 000. Também, três (3) das quatro (4) hialuronidases testiculares testadas (i.e., tipos Vl-S, IV-S e I-S) incluíram fracções de hialuronidase de peso molecular que excediam os 100 000.

Adicionalmente, foram realizados zimogramas para comparar as actividades líticas relativas de quantidades padrão (i.e., unidades equivalentes de actividade de hialuronidase) das 11 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ anteriormente descritas hialuronidase ACS, hialuronidase tipo VI-S, V, IV-S e I-S sobre ácido hialurónico, gelatina e caseina. Em relação à Figura 2, os métodos específicos pelos quais foi realizado cada um destes zimogramas são como se segue:

Zimograma para actividade gelatinolítica GELATINA - 1 mg/ml de gelatina; poliacrilamida a 10%; tampão de um dia para o outro = Tris HC1 50 mM, CaCl2 5 mM, 0,05% de Triton X-100, pH 7,5; coloração azul de Coomassie; descoloração ácido acético a 10%/metanol a 50%.

Zimograma para actividade caseinolítica CASEINA - 4 mg/ml; poliacrilamida a 15%; tampão de um dia para o outro = Tris HC1 50 mM, CaCl2 5 mM, 0,05% de Triton X-100, pH 7,5; coloração azul de Coomassie; descoloração ácido acético a 10%/metanol a 50%.

Zimograma para actividade de lise de ácido hialurónico ÁCIDO HIALURÓNICO - 2 mg/ml; poliacrilamida a 10%; tampão de um dia para o outro = solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4; coloração 0,5% de azul Alcian em ácido acético a 3%; descoloração ácido acético a 10%/metanol a 50%.

Os resultados destes zimogramas de ácido hialurónico, gelatina e caseína estão resumidos na tabela da Figura 2. Notavelmente, a hialuronidase ACS preferida do presente invento está desprovida de fracções de lise de ácido hialurónico de peso molecular acima de aproximadamente 100 000, conforme determinado por electroforese SDS PAGE a 10%, enquanto que cada uma das hialuronidases testiculares testadas (i.e., tipos Vl-S, V, IV-S e I-S) continha fracções de lise de ácido hialurónico de peso molecular acima de 100 000.

Similarmente, a hialuronidase ACS do presente invento estava desprovida de fracções gelatinolíticas de peso molecular entre aproximadamente 60 000-100 000, enquanto que cada uma das hialuronidases testiculares testadas incluía fracções gelatinolíticas de peso molecular entre aproximadamente 60 000-100 000 000, conforme determinado por electroforese SDS PAGE a 10%. 12 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Também, a hialuronidase ACS do presente invento estava desprovida de fracções caseinolíticas de peso molecular acima de aproximadamente 45 000, enquanto que cada uma das hialuronidases testiculares (í.e., tipos VI-S, V, iv-S e I-S) testadas continha realmente fracções caseinoliticas de peso molecular acima de aproximadamente 45 000, conforme determinado por electroforese SDS PAGE a 10%. A distribuição especifica de pesos moleculares e o perfil especifico de actividade enzimática da hialuronidase ACS preferida do presente invento, e/ou a exclusão do timerosal da sua formulação, proporcionam uma preparação de hialuronidase que é não tóxica para o olho quando administrada em niveis de dosagem para os quais outras preparações de hialuronidase causariam efeitos tóxicos.

Para utilização nos exemplos aqui a seguir apresentados, a hialuronidase ACS preferida é preparada numa formulação isenta de timerosal pelo método e fórmula geral aqui a seguir descritos e que se mostram na Tabela 1. Mais especificamente, a hialuronidase ACS utilizada nos exemplos seguintes é preparada de acordo com a formulação especifica que aqui se apresenta na Tabela 2 a seguir:

Tabela 2

Formulação específica A

Ingrediente Quantidade Hialuronidase ACS 7 200 UI Lactose USP 5,0 mg Fosfato USP 0,02 mmol

Alternativamente, outra formulação específica utilizável para aplicações de dose unitária é apresentada na Tabela 3 como se segue:

Tabela 3

Formulação específica B

Ingrediente Quantidade Hialuronidase ACS 500-1000 UI Lactose USP 5,0-10,0 mg Fosfato USP 0,01-10,0 mmol 13 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Ainda noutra formulação específica alternativa, a hialuronidase ACS é fornecida numa forma liofilizada e os componentes são apresentados na Tabela 4 como se segue:

Tabela 4

Formulação específica C

Ingrediente Quantidade Hialuronidase ACS 450 UI Lactose USP 10,0 mg Fosfato de potássio monobásico USP 0,098 mg Fosfato de potássio dibásico USP 10,0 mg Quantidade de diluente (NaCl a 0,9%) 0,3 ml ou 0,18 ml Volume de injecção 0,5 ml ou 0,03 ml

As quantidades de diluente e os volumes de injecção são anteriormente listados para uma dose de 75 UI. As quantidades de diluente podem ser alteradas para fazer variar a dosagem.

Ainda noutra formulação específica alternativa, a hialuronidase ACS é fornecida numa forma líquida e é apresentada na Tabela 5 como se segue:

Tabela 5

Formulação específica C

Ingrediente Quantidade Hialuronidase ACS 1 500 UI Lactose USP 1,25 mg Fosfato de potássio monobásico USP 0,305 mg Fosfato de potássio dibásico USP 0,48 mg Volume de injecção 0,05 ml Dose 75 UI É contemplado que todos os ingredientes possam ser reduzidos proporcionalmente para conseguir dosagens, inferiores com o mesmo volume de injecção. Também, a quantidade de lactose pode ser reduzida de metade ou de um quarto.

Tabela 6

Formulação específica D

Ingrediente Quantidade Hialuronidase ACS 6 500 UI Lactose USP 5,0 mg Fosfato USP 0,02 mmol 14 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Conforme descrito nos exemplos seguintes, a formulação especifica A da hialuronidase ACS apresentada na Tabela 2 (anterior) pode ser injectada directamente no interior da câmara posterior do olho para niveis de dosagem que realizam os efeitos terapêuticos desejáveis, incluindo mas não necessariamente limitados ao efeito de eliminação da hemorragia vitrea do presente invento, sem causar toxicidade significativa ao olho ou a estruturas anatómicas associadas. Alternativamente, as formulações especificas B ou C de hialuronidase ACS podem também ser injectadas. Ainda outra alternativa proporciona a utilização da formulação especifica D de hialuronidase ACS apresentada na Tabela 6 nos métodos do presente invento.

Toxicidades oftálmicas de timerosal, hialuronidase ACS e hialuronidase (Wydase®) em coelhos

Exemplo 1

Cinquenta e dois (52) coelhos saudáveis da variedade New Zealand Cross (26 machos, 26 fêmeas) pesando 1,5 kg a 2,5 kg, foram marcados individualmente para identificação e alojados individualmente em jaulas suspensas. Os animais receberam uma ração granulada para coelho disponível comercialmente numa base diária, com água da torneira disponível ad libitum.

Dividiram-se os animais em treze grupos de 4 animais cada (2 machos, 2 fêmeas). Seleccionaram-se dois animais em cada grupo (1 macho, 1 fêmea) para fotografia de fundo e angiografia com fluoresceína de pré-tratamento. A fotografia de fundo foi realizada imobilizando os animais e visualizando o nervo óptico, arcadas retinianas com fundos, com uma KOWA® RC-3 Fundus Camera carregada com película Kodak Gold de 200 ASA. A angiografia com fluoresceína envolveu uma injecção de 1,5 ml de solução de fluoresceína a 2% estéril através da veia marginal do ouvido. Aproximadamente 30 segundos pós-injecção, a fluoresceína foi visualizada nas localizações do nervo óptico, vasos retinianos e fundo.

No dia seguinte, cada animal foi anestesiado por administração intravenosa de uma combinação de 34 mg/kg de cloridrato de cetamina e 5 mg/kg de xilazina. As pálpebras 15 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ foram retraídas utilizando um espéculo de pálpebra, e os olhos foram desinfectados com um banho de iodopovidona.

Administraram-se por injecção tratamentos experimentais de solução salina equilibrada (BSS), BSS + timerosal, hialuronidase (Wydase®) ou hialuronidase ACS, utilizando uma seringa de tuberculina de 1 cm3 com uma agulha de calibre 30, 0,5 polegada ligada a esta. A solução de hialuronidase ACS utilizada neste exemplo estava isenta de timerosal e constituiu a formulação de hialuronidase ACS específica aqui anteriormente apresentada na Tabela 2.

Os tratamentos experimentais administrados a cada grupo de animais foram como se segue:

Grupo # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Tratamento BSS BSS + 0,0075 mg de Timerosal BSS + 0,025 mg de Timerosal

Hialuronidase Hialuronidase (Wydase) (Wydase)

1 UI 15 UI

Hialuronidase (Wydase) 30 UI Hialuronidase (Wydase) 50 UI Hialuronidase (Wydase) 150 UI Hialuronidase ACS 1 UI Hialuronidase ACS 15 UI Hialuronidase ACS 30 UI Hialuronidase ACS 50 UI Hialuronidase ACS 150 UI

No dia após as injecções (Dia 1), os 26 animais, que foram submetidos à fotografia de fundo e à angiografia com fluoresceína, foram observados pelos mesmos métodos utilizados para o mesmo exame pré-dose.

No Dia 2 após as injecções, os 13 coelhos machos que tinham sido submetidos a fotografia de fundo e a angiografia com fluoresceína pré-dose e no Dia 1, bem como os 13 coelhos fêmeas que não foram seleccionados para fotografia, foram submetidos a eutanásia com um fármaco à base de pentobarbital sódico. Os olhos foram depois removidos cirurgicamente e colocados numa solução de fixação de glutaraldeído a 2,5% com solução salina 0,1 M tamponada com fosfato a pH 7,37. 16 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Alternativamente, um coelho seleccionado aleatoriamente foi submetido a eutanásia por injecção de pentobarbital mas depois fixado por injecção intracardiaca da solução de glutaraldeido, no interior do ventrículo esquerdo, para determinar o efeito do procedimento de fixação nas constatações histológicas nos olhos enucleados.

No Dia 7, os 13 coelhos fêmeas que tinham sido anteriormente fotografados e com angiografia realizada foram submetidos às mesmas observações seguindo os métodos anteriormente descritos.

Os restantes 26 animais foram submetidos a eutanásia conforme anteriormente descrito, 7 dias após a dosagem. Os olhos foram fixados do mesmo modo tal como os fixados no Dia 2. Um coelho seleccionado aleatoriamente foi também submetido ao mesmo procedimento de fixação com glutaraldeido intracardíaco aqui anteriormente descrito, para o animal anteriormente seleccionado de modo aleatório.

Neste exemplo, os olhos dos animais tratados foram examinados grosseiramente e microscopicamente quanto a evidência de toxicidades relacionadas com o tratamento. Na Figura 3, apresenta-se uma tabela mostrando um resumo da evidência histológica de toxicidade ou não toxicidade em cada grupo de tratamento.

Em resumo, os olhos do grupo de controlo tratados com BSS estavam isentos de toxicidade nos dias 2 e 7 pós-dose.

Os olhos dos animais do Grupo n.° 2 tratados com BSS + timerosal (0,0075 mg) estavam isentos de toxicidade no Dia 2, mas exibiram evidência de que existiu uma ruptura da barreira hemato-retiniana no dia 7.

Os animais do Grupo n.° 3 tratados com BSS + timerosal (0,025 mg) exibiram graves efeitos tóxicos relacionados com o tratamento, nos dias 2 e 7 pós-dose.

Os animais do Grupo n.° 4 tratados com Wydase® para a dose de 1 UI estavam isentos de toxicidade nos dias 2 e 7, contudo, os olhos dos animais nos Grupos n.os 5-8 tratados com Wydase®, para dosagens na gama de 15 UI-150 UI, exibiram geralmente efeitos tóxicos relacionados com a dose nos dias 2 e 7 pós-dose. 17 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Os olhos dos animais nos grupos de tratamento n.os 9-13 tratados com hialuronidase ACS, para dosagens na gama de 1 UI a 150 UI, não evidenciaram geralmente efeitos tóxicos nos dias 2 e 7 pós-dose. Apesar disso, observou-se algum derrame de fluoresceina em animais tratados com as doses de 150 Ui.

Deste modo, conclui-se que o timerosal e a formulação de Wydase® contendo timerosal causam mesmo efeitos tóxicos nos olhos de coelhos nas dosagens testadas, contudo, a hialuronidase ACS não causou quaisquer efeitos tóxicos nestes animais nas dosagens testadas.

Na Figura 3 resumem-se os resultados das avaliações conduzidas no dia 7. Como se mostra, Figura 3, observaram-se efeitos tóxicos significativos no dia 7 nos olhos de coelhos tratados com BSS mais timerosal (0,0075 mg) e hialuronidase (Wydase) para todas as doses entre 1 UI-150 UI. Em contraste, não se observaram quaisquer efeitos tóxicos nos olhos de animais tratados com hialuronidase ACS para doses de 1-150 UI.

Segurança e eficácia de hialuronidase ACS injectada intravitreo em olhos de coelho

Exemplo 2

Neste exemplo, 12 coelhos saudáveis da variedade New Zealand Cross foram marcados para identificação e alojados individualmente em jaulas suspensas. Os animais receberam uma ração para coelho granulada disponível comercialmente numa base diária, com água da torneira disponível ad libitum.

Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro (4) grupos de tratamento de três (3) animais cada.

Inicialmente, os olhos de cada animal foram examinados por dilatação com 1-2 gotas de tropicamida a 10%, seguindo-se exame grosseiro, oftalmoscopia indirecta utilizando uma lente de 20 dioptrias, e exame através de lâmpada de fenda da anatomia anterior do olho.

Após o exame inicial dos olhos dos animais, injectaram-se intravitreo 100 II ou 10 II de sangue no interior de cada olho de cada animal. 18 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

No dia 2, os animais de cada grupo de tratamento receberam uma única injecção intravitrea quer de BSS quer de hialuronidase ACS no interior do olho direito, de acordo com o programa de tratamento seguinte:

Grupo # Tratamento

A B C D

Olho esquerdo Olho direito Nenhum BSS (30 :i)xl

Nenhum 25 UI de hialuronidase ACS em 30 Ilxl Nenhum 50 UI de hialuronidase ACS em 30 Ilxl Nenhum 75 UI de hialuronidase ACS em 30 Ilxl A preparação de hialuronidase ACS utilizada nesta experiência foi a formulação aqui anteriormente descrita e apresentada na Tabela 2.

Nos dias 3, 5, 7, 14 e 21 os olhos de cada animal foram de novo examinados por lâmpada de fenda para avaliar a córnea, a câmara anterior e a iris. Para além disso, os olhos de cada animal foram dilatados com solução de tropicamida a 10% e a retina foi examinada por oftalmoscopia indirecta com uma lente de 20 dioptrias.

Na Figura 4 resume-se a eficácia observada de eliminação da hemorragia de hialuronidase ACS. Em geral, o olho esquerdo (não tratado) de cada animal em cada grupo de tratamento continha um vitreo enevoado e alguns coágulos sanguíneos, devido à quantidade de sangue que tinha sido ai injectada. Os olhos direitos dos animais tratados com BSS (controlo) do Grupo A continham também vitreo enevoado e alguns coágulos sanguíneos, enquanto que todos os olhos direitos de todos os animais tratados com hialuronidase nos Grupos de tratamento B-D continham vitreo que estava limpido e através do qual era possivel a visualização transvítrea da retina. Adicionalmente, as retinas dos olhos direitos de todos os animais nos Grupos de tratamento B-D pareceram normais e isentas de toxicidade relacionada com o tratamento. 19 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Os resultados desta experiência indicam que a hialuronidase ACS, administrada intravitreo, era eficaz para doses únicas de 25, 50 e 75 UI, para acelerar a velocidade a que o sangue era eliminado, a partir dos olhos dos animais tratados, e ainda que estas doses únicas de hialuronidase ACS, administradas nesta experiência, não causaram efeitos tóxicos observáveis nos olhos dos coelhos tratados nesta experiência.

Numa variação, o exemplo foi realizado exactamente como anteriormente excepto que, em vez da administração de uma dose única, foram administradas múltiplas doses na quantidade de quatro (4) doses consecutivas de hialuronidase ACS, com intervalos de 2 semanas. As observações após cada dose eram consistentes e estão resumidas na Figura 5. Em geral, o olho esquerdo (não tratado) de cada animal, em cada grupo de tratamento, continha humor vítreo enevoado e alguns coágulos sanguíneos, devido à quantidade de sangue que tinha sido aí injectada. Os olhos direitos dos animais tratados com BSS (controlo) do Grupo A continham também vítreo enevoado e alguns coágulos sanguíneos, enquanto que os olhos direitos de todos os animais nos grupos de tratamento B-D (i.e., os animais tratados com hialuronidase ACS) continham vítreo límpido através do qual era possível a visualização transvítrea da retina. Adicionalmente, as retinas dos olhos direitos de todos os animais nos grupos de tratamento B-D pareceram estar normais e isentas de toxicidade relacionada com o tratamento, mesmo após múltiplas doses da hialuronidase ACS.

Os resultados desta experiência indicam que a hialuronidase ACS, administrada intravitreo, era eficaz para doses únicas de 25, 50 e 75 UI χ 4, para acelerar a velocidade a que o sangue era eliminado, a partir dos olhos de coelhos, e ainda que essas doses de hialuronidase ACS não causaram efeitos tóxicos observáveis nos olhos dos coelhos tratados, mesmo após quatro (4) doses consecutivas de hialuronidase ACS, administradas com intervalos de 2 semanas. 20 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Segurança e eficácia de hialuronidase ACS injectada intravítreo em olhos humanos

Exemplo 3 O principal objectivo deste estudo era determinar se uma solução salina equilibrada contendo um extracto de hialuronidase, altamente purificado, a partir de tecido testicular de ovino, podia ser injectada no vítreo de olhos visualmente diminuídos sem induzir quaisquer efeitos oculares adversos graves.

Materiais e métodos

Utilizou-se solução salina equilibrada (BSS) como o controlo de placebo, e esta foi obtida na Allergan Pharmaceuticals (Irvine, CA). A BSS continha 0,64% de cloreto de sódio, 0,075% de cloreto de potássio, 0,048% de cloreto de cálcio di-hidratado, 0,03% de cloreto de magnésio hexa-hidratado, 0,39% de acetato de sódio tri-hidratado, 0,17% de citrato de sódio di-hidratado, suficiente hidróxido de sódio/ácido clorídrico para ajustamento do pH a 7,1-7,2, e água para injecção (q.s. 100%). Carregaram-se alíquotas de trinta microlitros de BSS ou hialuronidase específica formulação D (Tabela 6) numa micro-seringa de 300 μΐ provida com uma agulha de calibre 29 de 0,5 polegada de comprimento. As micro-seringas carregadas foram depois utilizadas para injectar o material no interior do vítreo do olho do paciente.

Inicialmente, oito sujeitos humanos com pelo menos um olho visualmente debilitado foram designados aleatoriamente para receberem, intravítreo, quer 50 μΐ de 50 UI de hialuronidase ACS em BSS quer BSS sozinho (proporção 3:1). Após um mês de seguimento para assegurar que a dosagem de 50 UI era bem tolerada, um segundo grupo de seis sujeitos visualmente debilitados foi arrolado no estudo e os sujeitos designados aleatoriamente para um grupo de dosagem de hialuronidase ACS mais elevada (100 UI) ou para o controlo de BSS numa proporção de 2:1.

Os procedimentos utilizados para avaliar a segurança dos artigos de teste foram concluídos em vários intervalos ao longo do estudo, e incluíram oftalmoscopia indirecta, fotografia de fundo, angiografia com fluoresceína, electrorretinografia, exame ocular externo, biomicroscopia de 21 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ lâmpada de fenda, tonometria de aplanação, paquimetria e auto-refracção.

Um grupo de controlo de placebo concorrente foi incluído no estudo tal que eventos adversos, peculiarmente relacionados com a hialuronidase ACS, se pudessem distinguir dos atribuíveis ao veículo (BSS)/procedimento de injecção. Apenas foram tratados olhos visualmente debilitados, além do mais dado que os artigos de teste foram injectados na proximidade da retina e quaisquer respostas inconvenientes de natureza grave podiam ter sido ameaçadoras para a visão. Os pacientes foram designados para tratamento utilizando um esquema de randomização gerado por computador, iniciando-se com o número 601 para a primeira fase do estudo, e com o 701 para a segunda. Nem pacientes nem investigadores estavam informados sobre se era veículo BSS ou solução de hialuronidase ACS/BSS que estava a ser injectada intravítreo.

Após estabelecimento de uma linha de base para cada paciente, os sujeitos foram injectados quer com a enzima quer com o controlo de placebo. Os pacientes foram colocados numa posição sentada, numa cadeira confortável. Instilaram-se topicamente uma ou duas gotas de um anestésico local no olho que se pretendia tratar, após o que se pediu ao paciente para olhar para baixo e aplicou-se uma cotonete de algodão esterilizada, impregnada em solução oftálmica de cloridrato de proparacaína, durante 10 segundos, numa área sobre a esclerótica aproximadamente 4-5 mm por cima da córnea (posição superior/meridiano 12:00). O artigo de teste foi depois injectado no interior do vítreo através de uma agulha de calibre 29, fixada a uma micro-seringa de 200 μΐ, que foi inserida até ao comprimento total da agulha no local de aplicação do segundo anestésico.

Resultados

Ainda que atingindo, apenas raramente, significância estatística, os dados de biomicroscopia de lâmpada de fenda sugeriram que uma proporção substancialmente mais elevada de pacientes, tratados com preparações de hialuronidase ACS/BSS em contraste com BSS sozinha, exibiam alterações patológicas no segmento anterior, a mais proeminente sendo a presença de células e de cintilação na câmara anterior. No entanto, após a sexta visita (um mês pós-tratamento), não se observaram 22 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ quaisquer diferenças inter-grupos para qualquer das variáveis avaliadas com a lâmpada de fenda.

As respostas retinianas/corticais, conforme medidas por electrorretinografia/potencial visual evocado, deterioraram-se com o tempo num paciente tratado com BSS e em dois a quem foram administradas 50 UI de hialuronidase ACS/BSS. Contudo, as alterações nos padrões electrorretinográficos foram sempre bilaterais e não ocorreram em qualquer dos olhos tratados ou não tratados dos pacientes designados para a dose elevada (100 UI) de hialuronidase ACS/BSS, nem os resultados do teste angiográfico de fluoresceina indicaram que estava presente isquemia retiniana em qualquer olho, independentemente do tratamento.

Os exames oftalmoscópicos indirectos revelaram liquefacção e o estabelecimento de descolamento vítreo posterior (DVP, "descolamento vítreo posterior") nos olhos dos sujeitos de teste. O vitreo foi caracterizado como exibindo um elevado grau de mobilidade e/ou liquefacção logo após injecção dos artigos de teste, o que era de esperar para as preparações contendo hialuronidase ACS. Certos olhos de teste injectados com o controlo de BSS exibiram liquefacção e DVP, que estava provavelmente presente antes do tratamento, uma vez que esta última não possui qualquer actividade enzimática e foi administrada num volume muito pequeno (30 μΐ).

Em relação ao DVP, no primeiro grupo de pacientes, quatro dos seis pacientes a tratar com hialuronidase ACS exibiram ausência de DVP por biomicroscopia de lâmpada de fenda (i.e., 601, 602, 604 e 606) (Ver Tabela 6 a seguir). Após tratamento, cada um destes sujeitos evidenciou a presença de DVP. Os resultados do segundo grupo de pacientes foram menos claros, devido a dificuldades na imagética do vítreo utilizando microscopia de lâmpada de fenda. 23 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Tabela 6

Estudo de segurança em humanos com injecção intravítrea de hialuronidase ACS 50 11 e 100 II

Número Dose de enzima Olho tratado Biomicroscopia de lâmpada de fenda da presença de DVP Linha de Tratados base Dias até ao DVP Mobilidade vítrea 601 50 OD NÃO SIM 2 Dias +3/ + 4 602 50 OD NÃO SIM 1 Dia + 4 603 BSS OD SIM SIM - + 3 604 50 OD NÃO SIM 1 Dia + 3 605 BSS OS SIM SIM - +3/ + 4 606 50 OD NÃO SIM 14 Dias +3/ + 4 607 50 OD SIM SIM - +3/ + 4 608 50 OD SIM SIM - + 3 701 100 OS NÃO 7 - + 2 702 100 OD NÃO 7 + 4 703 BSS OD SIM SIM 704 100 OS NÃO 7 705 100 OD NÃO SIM 1 Dia 706 BSS OS NÃO NÃO

Considerando os resultados do Exemplo 2, onde a injecção de hialuronidase ACS no interior do vitreo de coelhos, para várias doses até 150 UI, não resultou em quaisquer alterações histopatológicas significativas num estudo pré-clinico anterior, era de esperar que doses abaixo de 150 UI fossem bem toleradas em humanos. Consistente com esta expectativa, a administração intravítrea de hialuronidase ACS/BSS no interior de olhos visualmente debilitados, no corrente ensaio clinico, induziu poucos sintomas, que se pensou serem todos atribuíveis ao próprio procedimento de injecção, dado que ocorreram com frequência comparável em cada um dos grupos de estudo, e as sequelas adversas relacionadas com o tratamento eram relativamente suaves e de curta duração.

Adicionalmente, observou-se que o tratamento de olhos humanos com hialuronidase ACS aumentava a incidência do 24 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ descolamento vítreo posterior observado. O aumento observado em DVP, em pacientes injectados intravítreo com hialuronidase ACS, mostra que os métodos do presente invento são eficazes em induzir a liquefacção e o descolamento do humor vítreo. Deste modo, os resultados do presente estudo indicam que a hialuronidase ACS pode ser injectada no interior do vítreo de humanos sem induzir quaisquer complicações oculares graves ou de longo prazo.

Utilização de hialuronidase para acelerar a depuração de sangue hemorrágico a partir do vítreo do olho O Exemplo 4 aqui a seguir apresentado descreve casos em que se utilizou hialuronidase ACS intravítrea para acelerar a depuração de sangue hemorrágico a partir do vítreo do olho. No Exemplo 4, a hialuronidase utilizada foi a formulação de hialuronidase ACS isenta de timerosal, anteriormente descrita e mostrada na Tabela 2.

Exemplo 4

Depuração acelerada de hemorragia após hialuronidase intravítrea

Nesta experiência, seis (6) pacientes humanos (5 fêmeas, 1 macho), que apresentavam hemorragia vítrea, foram tratados com injecções intravítreo únicas de hialuronidase ACS para dosagens de 50-200 UI. A hialuronidase ACS administrada nesta experiência foi preparada pela formulação, aqui anteriormente descrita e apresentada na Tabela 2.

Nesta experiência, todos os pacientes tratados tinham uma história de retinopatia diabética, e verificou-se que tinham hemorragias vítreas de duração variável. Em cada paciente, a quantidade de sangue presente no vítreo era suficiente para impedir a observação da retina por meios fundoscópicos convencionais.

Cada paciente recebeu uma única injecção intravítrea de hialuronidase ACS. Quatro (4) pacientes receberam uma dose de 50 UI, um (1) paciente recebeu uma dose de 70 UI, e um (1) paciente recebeu uma dose de 200 UI. 25 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Na Figura 6 resumem-se os resultados observados nesta experiência.

Neste exemplo, nos seis (6) pacientes tratados o vitreo hemorrágico tornou-se suficientemente limpido para permitir a observação transvítrea da retina em 6-16 dias desde a injecção intravitrea única de hialuronidase ACS. Esta depuração do vitreo foi determinada subjectivamente como tendo ocorrido significativamente mais rápida do que seria de esperar que ocorresse nestes pacientes, sem tratamento com hialuronidase.

Será de notar que, contrariamente ao derrame de fluoresceina, observado para doses mais elevadas de hialuronidase ACS em coelhos, não se observou qualquer toxicidade no presente estudo baseado em humanos.

Utilização de hialuronidase para tratar outras desordens oftalmológicas

Os requerentes observaram adicionalmente a eficácia de uma única administração intravitrea de hialuronidase ACS, numa dose experimental, no tratamento de certas desordens oftalmológicas. Pacientes que sofriam de perturbações do olho previamente diagnosticadas, incluindo retinopatia diabética proliferativa, degenerescência macular relacionada com a idade, ampliaria, retinite pigmentosa, buracos maculares, exsudados maculares e edema macular cistóide, exibiram melhoria nos sintomas clinicos destas perturbações após tratamento com hialuronidase ACS.

Os requerentes determinaram também que a formulação de hialuronidase ACS do presente invento é susceptivel de ser administrada intravitreo em doses iguais ou superiores a 1 UI, sem causar danos tóxicos no olho, e assim é utilizável para efectuar a pronta liquefacção do corpo vitreo e concomitantemente a separação ou descolamento do corpo vitreo da retina e doutros tecidos (e.g., membranas epi-retinianas, mácula). Como resultado desta liquefacção vitrea e descolamento vitreo, as forças de tracção física do vítreo sobre a retina e outros tecidos são minimizadas e a velocidade de renovação natural de fluidos no vitreo é acelerada. Por conseguinte, a formulação de hialuronidase ACS dos requerentes é particularmente adequada para o tratamento de muitas perturbações (e.g., retinopatia diabética proliferativa, degenerescência macular relacionada com a idade, ambliopia, 26 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ retinite pigmentosa, buracos maculares, exsudados maculares e edema macular cistóide) que beneficiariam da liquefacção/separação do vitreo e/ou eliminação acelerada de toxinas ou doutras substâncias nocivas (e.g., factores angiogénicos, fluidos de edema, etc.) a partir da câmara posterior do olho e/ou a partir de tecidos adjacentes à câmara posterior (e.g., a retina ou a mácula). Além disso, crê-se também que a liquefacção do vitreo remove a matriz, na forma do vitreo polimerizado, o que é necessário para suportar a neovascularização. Assim, o presente invento é útil na prevenção ou redução da incidência de neovascularização retiniana.

Adicionalmente, muitas perturbações oftálmicas têm, como componente causador, uma desestabilização da membrana hemato-retiniana. Esta desestabilização permite que vários componentes (e.g., componentes do soro, lipidos, proteínas) dos coriocapilares entrem na câmara vítrea e danifiquem a superfície retiniana. Esta desestabilização é também um precursor da infiltração vascular da câmara vítrea, conhecida como neovascularização.

Por conseguinte, concretizações do presente invento são dirigidas à prevenção e tratamento de várias perturbações do olho de mamífero que resultam de lesão ou de patologia da vascularização do olho ou que resultam em lesão da barreira hemato-retiniana. Exemplos de tais doenças incluem mas não estão limitadas a retinopatia diabética proliferativa, degenerescência macular relacionada com a idade, ambliopia, retinite pigmentosa, buracos maculares, exsudados maculares, e edema macular cistóide, e outras em que os sintomas clínicos destas perturbações respondem ao tratamento com hialuronidase ACS do presente invento.

Os exemplos seguintes são exemplos de aplicação utilizando a preparação de hialuronidase ACS aqui anteriormente descrita, resultando em melhorias das desordens oftalmológicas descritas. No entanto, o presente invento contempla a utilização de outras enzimas que não a hialuronidase ACS para induzir a liquefacção vítrea. Exemplos de enzimas alternativas utilizáveis com o presente invento incluem: outras enzimas de glicosaminoglicanase tais como outras preparações de hialuronidase, condroitinase ABC, condroitinase AC, condroitinase B, condroitina-4-sulfatase, condroitina-6-sulfatase e B-glucuronidase. São também 27 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ contempladas as colagenases. As proteases estão adicionalmente previstas.

Um perito na especialidade que deseje utilizar uma outra enzima, que não hialuronidase ACS, para praticar os métodos do presente invento utilizará os presentes ensinamentos para seleccionar uma enzima e a sua dosagem apropriada. Especificamente, os exemplos discutindo as especificidades enzima-substrato e os estudos de não toxicidade seriam realizados com as enzimas candidatas alternativas, para estabelecer a sua eficácia quando utilizadas com o presente invento. Consequentemente, os ensinamentos aqui contidos são aplicáveis à identificação de uma enzima substancialmente não tóxica que promove a liquefacção do vítreo, sem no entanto causar lesões na retina ou noutras estruturas oculares.

Tratamento de retinopatia diabética proliferativa (RDP) com hialuronidase A retinopatia diabética é a principal causa de cegueira nos Americanos em idade activa. A incidência de retinopatia aumenta com a duração do estado de doença, desde um nível de uma manifestação de cerca de 50% em diabéticos há 7 anos com a doença até aproximadamente 90% daqueles com a doença há mais de 20 anos. Estima-se que a RDP afecte um número aproximado de 700 000 Americanos.

As consequências retinovasculares da diabetes consistem essencialmente, em parte, de derrame microvascular e em não perfusão capilar resultante de hiperglicemia crónica. Por sua vez, o derrame microvascular pode resultar em edema retiniano, exsudados lípidos e hemorragias intra-retinianas. A não perfusão capilar resulta na formação de anormalidades microvasculares intra-retinianas (IRMA, "intraretinal microvascular abnormalities") . Estas anormalidades são derivações arteriovenosas formadas para perfundir regiões retinianas privadas de vascularização por degenerescência arteriolar mediada pela diabetes.

Pensa-se que a expressão do factor de crescimento endotelial vascular a partir de uma retina hipóxica em áreas sem perfusão capilar resulta no desenvolvimento de neovascularização extra-retiniana. Esta neovascularização e os seus componentes fibrosos associados podem evoluir ou ser agravados por hemorragia vítrea ou descolamento retiniano de 28 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ tracção. A neovascularização pode ser facilmente observada no angiograma de fluoresceína pelo derrame profuso de corante a partir destes novos vasos, dado que a estes faltam as junções endoteliais estreitas da vasculatura retiniana. O fluxo axoplasmático reduzido em áreas de hipoxia retiniana resulta em pontos no algodão hidrófilo. A retinopatia diabética proliferativa (RDP) requer o rastreio cuidadoso dos diabéticos para a identificação e tratamento precoces, uma vez que a RDP permanece amplamente assintomática nas fases precoces. A retinopatia diabética proliferativa pode ser classificada em três subgrupos: (1) retinopatia não proliferativa; (2) retinopatia pré-proliferativa; (3) retinopatia proliferativa. Cada classificação tem certas caracteristicas morfológicas. Particularidades da retinopatia não proliferativa incluem microangiopatia capilar (obstruções microvasculares e alterações de permeabilidade, não perfusão de capilares, microaneurismas capilares retinianos, espessamento da membrana de base e anormalidades microvasculares internas (IRMA); hemorragias intra-retinianas; exsudados; e alterações maculares. A retinopatia pré-proliferativa é indicada por qualquer uma ou por todas as alterações descritas para a retinopatia não proliferativa e pelas seguintes: enchimento venoso significativo, exsudados sobre algodão hidrófilo, IRMA extensas e isquemia retiniana extensa. A retinopatia proliferativa é indicada por neovascularização extra-retiniana e proliferação de tecido fibroso, alterações vítreas e hemorragia, doença macular e descolamento retiniano. A criação de tecido fibrovascular é uma complicação especialmente importante da RDP uma vez que esta conduzirá frequentemente a lesões retinianas mediadas pelo vítreo. O tecido fibrovascular pode formar membranas pré-retinianas que criam adesões densas com a membrana hialóide posterior. Estas adesões são responsáveis pela transmissão das forças de tracção do vítreo para a retina, o que pode resultar em descolamentos retinianos. A base do vítreo está normalmente firmemente ligada à retina adjacente e à circunferência exterior da cabeça do nervo óptico, conhecida como o anel de Martegiani. A ligação do vítreo à retina em todos os outros sítios, entre o anel de Martegiani e a base do vítreo, é muito menos firme. A neovascularização a partir da retina conduz à formação de 29 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ cordões vasculares prolongando-se para o interior do vítreo a partir da cabeça do nervo ou para qualquer outro local no fundo. A contracção destes cordões pode causar descolamento retiniano parcial ou completo. O descolamento retiniano na mácula é uma complicação importante da RDP. A maior parte dos descolamentos retinianos resultantes da RDP começam como descolamentos de tracção sem buracos, mas estes podem-se tornar regmatógenos pela formação de buracos retinianos, num qualquer momento posterior da doença. Os descolamentos de tracção são causados por adesões vitreo-retinianas anormais ou por tracção vítrea com contracção subsequente das bandas fibrosas e elevação da retina. O presente invento contempla o tratamento da RDP nos estados pré-proliferativo e proliferativo utilizando injecções intravítreo de hialuronidase ACS. Sem estar limitado a um mecanismo particular, crê-se que o efeito da injecção intravítrea de hialuronidase ACS é o de promover a depuração da fase líquida do vítreo. A velocidade de transferência de água tratada injectada intravítreo, a partir do vítreo médio para a coróide, foi significativamente aumentada após despolimerização de ácido hialurónico vítreo por hialuronidase ACS injectada. O presente invento capitaliza esta observação para liquefazer o vítreo, por exemplo, de modo a promover a depuração de vários factores indutores do crescimento e doutros produtos de soro vazados para o interior do vítreo, devido à presença de RDP. É ainda contemplado que o tratamento com hialuronidase ACS do presente invento pode ser realizado sozinho ou em combinação com outros tratamentos da RDP.

Exemplo 5

Tratamento de retinopatia diabética pré-proliferativa

No Exemplo 5, um paciente diabético manifestando retinopatia diabética pré-proliferativa é tratado em relação a esta complicação de diabetes mellitus através da injecção intravítrea de hialuronidase ACS. O propósito deste tratamento é reduzir ou prevenir o desenvolvimento de retinopatia diabética proliferativa manifestada por neovascularização extra-retiniana e proliferação de tecido fibroso, alterações do vítreo e hemorragia, doença macular e descolamento retiniano. 30 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Após ο paciente ter sido diagnosticado com diabetes, é realizada uma vigilância oftálmica aumentada, dada a elevada percentagem de indivíduos sofrendo desta doença que desenvolvem mais tarde retinopatia diabética proliferativa (RDP). Esta vigilância aumentada deverá incluir exames retinianos e angiogramas de fluoresceína periódicos para monitorar a extensão do enchimento venoso, IRMA e isquemia retiniana.

Quando a retinopatia diabética pré-proliferativa começa a atingir o estado proliferativo, inicia-se o tratamento com hialuronidase ACS. Esta fase é definida como a presença de enchimento venoso em 2 ou mais quadrantes, IRMA em um ou mais quadrantes, e/ou microaneurisma e hemorragias de pontos em todos os quadrantes. Após estes indícios estarem presentes, inicia-se o método de tratamento com hialuronidase ACS do presente invento. O paciente é submetido a um exame oftálmico completo para estabelecer uma linha de base de saúde ocular. O exame oftálmico inclui oftalmoscopia indirecta, biomicroscopia de lâmpada de fenda, exame retiniano periférico, medições da pressão intra-ocular, sintomatologia de acuidade visual (sem ajuda e com a melhor correcção), fotografia de fundo, angiografia com fluoresceína, electrorretinografia e medições "A-scan".

Após o exame preliminar, administra-se uma injecção intravítrea de hialuronidase ACS ao olho afectado do paciente. Se ambos os olhos estiverem afectados, estes podem ser tratados separadamente. O olho a ser tratado é injectado intravítreo com 50 II de 50 UI da solução oftálmica de hialuronidase ACS anteriormente descrita para promover a despolimerização de ácido hialurónico vítreo, resultando na liquefacção do vítreo.

Após tratamento, os olhos dos pacientes são examinados nos dias um (1), dois (2), sete (7), quinze (15), trinta (30) e sessenta (60) . No dia de cada exame, o paciente é monitorado quanto à liquefacção vítrea. Adicionalmente, o paciente é monitorado quanto a descolamentos vítreos posteriores utilizando oftalmoscopia indirecta com depressão escalaram. Finalmente, a extensão da RDP apresentada pelo paciente é monitorada continuamente através de exames retinianos e de 31 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ angiogramas de fluoresceína periódicos para monitorar a extensão do enchimento venoso, IRMA e isquemia retiniana.

Exemplo 6

Tratamento de retinopatia proliferativa

Neste Exemplo, um paciente diabético manifestando retinopatia diabética proliferativa é tratado pela injecção intravitrea de hialuronidase ACS. O propósito deste tratamento é reduzir a extensão da retinopatia diabética proliferativa, para prevenir manifestações adicionais da doença após remoção de qualquer tecido neovascularizado extra-retiniano, e para reduzir a probabilidade de descolamento retiniano.

Um paciente apresentando retinopatia diabética proliferativa recebe o tratamento com hialuronidase ACS do presente invento em combinação com tratamento cirúrgico do tecido neovascularizado. A proliferação começa usualmente com a formação de novos vasos com muito pouco componente de tecido fibroso. Estes resultam de elementos mesenquimatosos primitivos que se diferenciam em células endoteliais vasculares. Os canais vasculares recentemente formados sofrem então metaplasia fibrosa; isto é, os rebentos angioblásticos são transformados em tecido fibroso.

Os novos vasos derramam fluoresceina, pelo que a presença de proliferação é especialmente perceptivel durante a angiografia. Os novos vasos e tecido fibroso irrompem através da membrana limitante interna e arborizam-se na interface entre a membrana limitante interna e a membrana hialóide posterior. 0 tecido fibrovascular tecido pode formar membranas pré-retinianas que criam adesões densas com a membrana hialóide posterior. Estas adesões são extremamente importantes porque são responsáveis pela transmissão das forças de tracção vitrea à retina durante a fase posterior de contracção vitrea. A fase proliferativo da RDP é definida como a presença de três ou mais das caracteristicas seguintes: novos vasos, novos vasos sobre ou dentro de um diâmetro de disco do nervo óptico, novos vasos simples (conforme definidos por neovascularização de uma área de um terço de disco no nervo óptico ou neovascularização de uma área de meio disco no nervo óptico ou neovascularização de uma área de meio disco em qualquer outro local), e hemorragia pré-retiniana ou vitrea. 32 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Uma vez diagnosticada como estando a entrar na fase proliferativa, o paciente é ser submetido a um exame oftálmico completo para estabelecer uma linha de base de saúde ocular. O exame oftálmico inclui oftalmoscopia indirecta, biomicroscopia de lâmpada de fenda, exame retiniano periférico, medições da pressão intra-ocular, sintomatologia de acuidade visual (acuidade visual sem ajuda e com a melhor correcção), fotografia de fundo, angiografia com fluoresceina, electrorretinografia e medições "A-scan".

Após o exame preliminar, administra-se ao paciente uma injecção intravitrea de hialuronidase ACS aos olhos afectados do paciente. Se ambos os olhos estiverem afectados, estes podem ser tratados separadamente. O olho é injectado intravitreo com 50 II de 50 UI da solução oftálmica de hialuronidase ACS para promover a despolimerização de ácido hialurónico vitreo, resultando na liquefacção do vitreo. Para além disso, para despolimerização do vitreo, o tecido neovascularizado é também tratado directamente para minimizar lesões subsequentes da retina utilizando fotocoagulação panretiniana. A fotocoagulação panretiniana (PRP, "panretinal photocoagulation") pode ser utilizada para tratar pacientes apresentando RDP conjuntamente com o tratamento com hialuronidase ACS do presente invento. A fotocoagulação panretiniana é uma forma de fotocoagulação a laser. Actualmente, para cirurgia retiniana, utilizam-se lasers tais como os lasers verde de árgon (614 nm), azul-verde de árgon (488 e 514 nm), vermelho de cripton (647 nm), de pigmento corante ajustável, de díodo e de arco de xénon. A energia do laser é absorvida predominantemente por tecidos contendo pigmento (melanina, xantofila ou hemoglobina), produzindo efeitos térmicos sobre estruturas adjacentes. Os lasers de vermelho de cripton são o método de tratamento preferido, na medida em que estes são melhor capazes de penetrar em cataratas escleróticas nucleares e hemorragias vítreas do que os lasers de árgon, o que requer mais energia para produzir iguais níveis de penetração.

Durante a cirurgia retiniana a laser, os parâmetros utilizados podem ser modificado dependendo do objectivo da fotocoagulação. Para uma regulação a potência mais baixa, utilizando durações de tratamento mais longas e produzindo 33 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ tamanhos de ponto maiores, o laser tem um efeito de coagulação sobre vasos pequenos. A fotocoagulação a laser focal é utilizada em diabetes para parar o derrame de microaneurismas. O ponto de laser é colocado directamente sobre o microaneurisma para conseguir um ligeiro branqueamento e fecho do aneurisma. Quando aplicado como uma grelha sobre uma área edematosa de retina, o laser pode reduzir o derrame microvascular. Para níveis de energia mais elevados, é possível a ablação de tecido por laser. Pensa-se que a fotocoagulação panretiniana é eficaz pela destruição de tecido retiniano, reduzindo a quantidade de tecido isquémico no olho. Podem-se utilizar pontos de laser confluentes sobre uma membrana neovascular para obliterar os vasos anormais.

Deverá ser entendido que o presente invento não requer uma ordem de tratamento particular. Numa concretização, o paciente é primeiro tratado com hialuronidase ACS e depois tratado a laser. Noutra concretização, o paciente é primeiro submetido a tratamento laser seguido pelo tratamento com hialuronidase ACS do presente invento.

Após tratamento, os olhos dos pacientes são examinados nos dias um (1), dois (2), sete (7), quinze (15), trinta (30) e sessenta (60) . No dia de cada exame, o paciente é monitorado quanto à liquefacção vítrea. Adicionalmente, o paciente é monitorado quanto a descolamentos vítreos posteriores utilizando oftalmoscopia indirecta com depressão escleral. Finalmente, a extensão da RDP apresentada pelo paciente é monitorada continuamente através de exames retinianos e de angiogramas de fluoresceína periódicos para monitorar a extensão do enchimento venoso, IRMA, isquemia retiniana, neovascularização e hemorragia vítrea. Evidência de nova neopolimerização ou despolimerização incompleta do vítreo justificaria um tratamento de repetição do paciente conforme anteriormente descrito.

Tratamento de degenerescência macular relacionada com a idade com hialuronidase O presente invento contempla também a utilidade no tratamento de degenerescência macular relacionada com a idade (DMRI). A degenerescência macular relacionada com a idade consiste de uma diminuição gradual de visão, frequentemente bilateral. É a causa mais comum de cegueira legal em adultos. É provavelmente causada por envelhecimento e doença vascular 34 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ nos coriocapilares ou nos vasos aferentes retinianos. Existem basicamente dois tipos morfológicos de DMRI: a "seca" e a "húmida". A anormalidade subjacente à DMRI é o desenvolvimento de alterações de involução ao nível da membrana de Bruch e do epitélio pigmentar retiniano (EPR). A lesão distintiva de tais alterações é a drusa. Clinicamente, as drusas (a forma plural de drusa) aparecem como pequenos depósitos, amarelo-esbranquiçado, ao nível do EPR. As drusas podem ser classificadas como drusas duras, moles ou basais laminares. O presente invento é dirigido tanto ao tratamento como à prevenção de formas de DMRI húmida e seca. Na forma húmida da doença, pensa-se que a condição afecta os coriocapilares. Os coriocapilares são um componente da coróide que servem para vascularizar o globo. Os coriocapilares consistem de uma rede rica em capilares que fornecem a maior parte da nutrição ao epitélio pigmentar e às camadas exteriores da retina. Pensa-se que a lesão dos coriocapilares resulta, em última instância, em complicações neovasculares, uma causa de degenerescência macular.

Na forma seca, a degenerescência macular não disciforme resulta de uma obliteração parcial ou total dos coriocapilares subjacentes. Oftalmoscopicamente, podem-se observar a degenerescência do epitélio pigmentar retiniano e a formação de buracos. Podem-se observar também depósitos de material epitelial subpigmentar, tais como quelatos de cálcio ou proteicos, e outros. Na DMRI seca, em geral, ocorrem gradualmente alterações retinianas secundárias, resultando na perda gradual de acuidade visual. No entanto, numa certa percentagem de pacientes, resulta uma perda grave da visão. O presente invento contempla a utilidade no tratamento de DMRI seca e na prevenção de degenerescência macular através de liquefacção do vítreo. É contemplado que a liquefacção do vítreo resulta num aumento da velocidade de depuração a partir da retina de material depositado que mais tarde resulta em degenerescência macular. A DMRI húmida resulta muito frequentemente de insuficiência coriocapilar, conduzindo à neovascularização epitelial subpigmentar subsequente. Pensa-se também que a neovascularização ocorre como uma adaptação da vascularização 35 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ retiniana a oxigenação inadequada, como resultado de lesões vesiculares. A neovascularização pode também causar várias outras perturbações, tais como descolamento do epitélio pigmentar e da retina sensorial. Tipicamente, a doença inicia-se usualmente após os 60 anos de idade, manifestando-se igualmente em ambos os sexos e em pacientes apresentando a doença, bilateralmente.

Talvez a complicação mais importante da degenerescência macular relacionada com a idade seja o desenvolvimento de defeitos em membranas de Bruch do globo através das quais crescem novos vasos. Esta neovascularização epitelial pode resultar na produção de depósitos exsudativos na e sob a retina. A neovascularização pode também conduzir a hemorragia no interior do vitreo, o que pode conduzir a degenerescência dos bastonetes e cones da retina, e a edema macular cistóide (a seguir discutido). Pode-se formar um buraco macular que resulta em perda visual irreversível.

Ainda que afectando apenas 10% de pacientes com DMRI, as complicações neovasculares da DMRI são responsáveis pela esmagadora maioria dos casos de perda visual grave. Os factores de risco incluem aumento de idade, drusas moles, atrofia não geográfica, história familiar, hiperopia e descolamentos epiteliais pigmentares retinianos. Os sintomas de neovascularização coroidal em DMRI incluem metamorfopsia, escotomas para-centrais ou visão central diminuída. As constatações oftalmoscópicas incluem fluido sub-retiniano, sangue, exsudados, descolamento de EPR, alterações retinianas císticas, ou a presença de membrana neovascular sub-retiniana verde acinzentada. Angiografia com fluoresceína é muitas vezes um método eficaz de diagnóstico. Durante este procedimento de diagnóstico, a acumulação progressiva do corante no espaço sub-retiniano, vista como desfocagem dos limites da lesão, ou o derrame a partir de fontes indeterminadas são indicadores da doença. Outros componentes de membranas neovasculares coroidais, conforme mostrados por angiografia com fluoresceína, incluem fluorescência bloqueada elevada, fluorescência bloqueada uniforme, sangue e cicatriz disciforme. O presente entendimento da DMRI neovascular sugere que a neovascularização coroidal clássica é o componente de lesão mais fortemente associado com uma rápida deterioração visual. Por conseguinte, o tratamento da DMRI tem de abranger todos os 36 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ componentes neovasculares e fibrovasculares da lesão. Presentemente, o tratamento apenas é indicado quando a neovascularização clássica tem fronteiras que estão bem demarcadas, e a fotocoagulação tem mostrado ser benéfica.

Em olhos com neovascularização coroidal extrafoveal (>= 200 micron desde o centro foveal), a fotocoagulação a laser de árgon diminuiu a incidência de perda visual grave, ($6 linhas) aos 5 anos de 64% para 46%. A neovascularização recorrente desenvolveu-se em metade dos olhos tratados a laser, usualmente no primeiro ano após tratamento. A neovascularização recorrente estava invariavelmente associada ao desenvolvimento de perda visual grave.

Em olhos com neovascularização coroidal justafoveal (1 a 199 micron desde o centro foveal), a fotocoagulação a laser de cripton diminuiu a incidência de perda visual grave de 45% para 31% a 1 ano, ainda que a diferença entre os grupos não tratados e tratados fosse menos acentuada aos 5 anos. O tratamento a laser continua a ser um método terapêutico essencial para o tratamento de DMRI, contudo, o presente invento incrementaria este método por redução da recorrência de neovascularização.

Exemplo 7

Tratamento de degenerescência macular relacionada com a idade

Neste Exemplo, um paciente manifestando degenerescência macular relacionada com a idade é tratado com uma injecção intravitrea de hialuronidase ACS. O propósito deste tratamento é reduzir ou impedir o desenvolvimento de neovascularização, doença macular e lesão retiniana.

Assim que um paciente atinge a idade dos 60, é realizada uma vigilância oftálmica aumentada para detectar a presença de DMRI. Esta vigilância aumentada deverá incluir exames retinianos e angiogramas de fluoresceina periódicos para monitorar a presença de fluido sub-retiniano, sangue, exsudados, descolamento de EPR, alterações retinianas cisticas, ou a presença de membrana neovascular sub-retiniana verde acinzentada. 37 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Quando é diagnosticada DMRI, inicia-se um regime de tratamento com hialuronidase ACS associado com ou sem outros tratamentos tais como fotocoagulação. Como o primeiro passo do tratamento, o paciente é submetido a um exame oftálmico completo para estabelecer uma linha de base de saúde ocular. O exame oftálmico inclui oftalmoscopia indirecta, biomicroscopia de lâmpada de fenda, exame retiniano periférico, medições da pressão intra-ocular, sintomatologia de acuidade visual (sem ajuda e com a melhor correcção), fotografia de fundo, angiografia com fluoresceina, electrorretinografia e medições "A-scan".

Após o exame preliminar, administra-se uma injecção intravitrea de hialuronidase ACS ao olho afectado do paciente manifestando DMRI. Se ambos os olhos estiverem afectados, estes podem ser tratados separadamente. O olho a ser tratado é injectado intravítreo com 50 II de 50 UI da solução oftálmica de hialuronidase ACS (anteriormente descrita) para promover a despolimerização de ácido hialurónico vítreo, resultando na liquefacção do vítreo.

Pode ser requerido o tratamento de fotocoagulação a laser dos olhos injectados com hialuronidase ACS. O protocolo de tratamento a laser descrito no Exemplo 5 e 6 deverá ser seguido quando se trata a DMRI. Numa concretização alternativa, o tratamento de fotocoagulação ocorre antes do tratamento com enzima do presente invento.

Após tratamento, os olhos dos pacientes são examinados nos dias um (1), dois (2), sete (7), quinze (15), trinta (30) e sessenta (60). Por causa da possibilidade de recorrência, o paciente deverá depois regressar para exames periódicos numa base mensal. No dia de cada exame, o paciente é monitorado quanto à liquefacção vítrea. Adicionalmente, o paciente é monitorado quanto a descolamentos vítreos posteriores utilizando oftalmoscopia indirecta com depressão escleral. Finalmente, a extensão da dmri apresentada pelo paciente é monitorada continuamente através de exames retinianos e de angiogramas de fluoresceína periódicos para monitorar a presença de fluido sub-retiniano, sangue, exsudados, descolamento de EPR, alterações retinianas císticas, ou a presença de membrana neovascular sub-retiniana verde acinzentada. Podem ser requeridos tratamentos adicionais de hialuronidase ACS e/ou laser se forem observados indícios de neovascularização recorrente. 38 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ Ο Exemplo seguinte demonstra a eficácia do presente invento, mesmo sem a utilização de fotocoagulação.

Exemplo 8

Melhoria nos sintomas de degenerescência macular após injecção intravitrea de hialuronidase

Um humano macho com mais de setenta e nove (79) anos de idade apresentava uma história de degenerescência macular relacionada com a idade, e uma visão não corrigida de 20:400 no seu olho direito. Injectou-se intravitreo uma única dose de 100 UI da hialuronidase ACS no seu olho direito. O outro olho permaneceu não tratado. O paciente foi examinado repetidamente pós-dose e a visão no seu olho esquerdo (não tratado) permaneceu inalterada, enquanto que se observou que a visão no seu olho direito (tratado) melhorou como se segue:

Tempo (pós-dose) visão (não corrigida) visão (corrigida) Linha de base 20:400 nada 3 dias cf @ lft. nada 1 semana 20:400 nada 2 semanas 20:400 nada 4 semanas 20:300 nada *cf designa contagem de dedos Não se observaram quaisquer efeitos adversos da hialuronidase ACS nesta experiência.

Tratamento de ambliopia com hialuronidase O termo ambliopia é derivado do Grego e significa visão lenta (amblys = lenta, ops = olho). A visão lenta é causada pelo desenvolvimento anormal em áreas visuais do cérebro, que por sua vez é causado por estimulação visual anormal durante o desenvolvimento visual precoce. A patologia associada à ambliopia não é especifica do olho, em vez disso, está localizada nas áreas visuais do cérebro incluindo o núcleo geniculado lateral do córtex estriado. Este desenvolvimento anormal é causado por três mecanismos: (1) imagem retiniana desfocada, denominada padrão de distorção; (2) supressão 39 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ cortical, ou (3) tanto supressão cortical como padrão de distorção. O presente invento está principalmente preocupado com padrões de distorção causados por opacidade dos meios. Mais especificamente, o presente invento dirige-se a aspectos de opacidade do vitreo. A visão ambliope é usualmente definida como uma diferença de pelo menos duas linhas Snellen de acuidade visual. Para o tratamento da ambliopia é critica a detecção precoce e a intervenção precoce. A estratégia para o tratamento de ambliopia causada pela opacidade do vitreo é proporcionar uma imagem retiniana límpida por alteração da opacidade do vitreo de modo a resultar uma visão límpida.

Neste Exemplo, um paciente manifestando ambliopia resultante de opacidade vítrea foi tratado com uma injecção intravítrea de hialuronidase ACS. O propósito deste tratamento foi reduzir a opacidade do vítreo aumentando a velocidade de renovação do líquido no vítreo.

Exemplo 9

Melhoria dos sintomas de ambliopia após tratamento intravítreo

com hialuronidase ACS

Um humano fêmea com quarenta (40) anos de idade com uma história de ambliopia, apresentava uma visão não corrigida de 20:400 no seu olho direito e uma visão corrigida nesse olho de 20:200. Injectou-se intravítreo uma única dose de 100 UI da hialuronidase ACS no seu olho direito. O outro olho permaneceu não tratado. O paciente foi examinado repetidamente pós-dose e a visão do seu olho esquerdo (não tratado) permaneceu inalterada, enquanto que se observou que a visão do seu olho direito (tratado) melhorou como se segue:

Tempo (pós-dose) Visão (não corrigida) Visão (corrigida) 4 semanas 20:200 20:70(-1) 8 semanas 20:200 20:60(-2) 12 semanas 20:200 20:60(-1) 52 semanas 20:200 20:60(-1) 40 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ Não se observaram quaisquer efeitos adversos da hialuronidase ACS neste paciente.

Tratamento de retinite pigmentosa com hialuronidase A retinite pigmentosa (RP) é o nome dado a um grupo de perturbações hereditárias de degenerescência retiniana progressiva caracterizada por campos visuais constringidos por nictalopia bilateral e anormalidade do electrorretinograma. Sintomas precoces incluem dificuldade de adaptação ao escuro e perda de campo visual periférico mediano. À medida que a doença progride, a perda de campo visual avança, deixando tipicamente um pequeno campo de visão central até eventualmente mesmo a visão central ser afectada. A acuidade central pode também ser afectada mais cedo no decurso da doença, quer por edema macular cistóide, atrofia macular, quer por desenvolvimento de uma catarata subcapsular posterior. A RP representa um grupo variado de doenças cujo fio comum é a produção anormal de pelo menos uma proteína em segmentos exteriores de fotorreceptor críticos para a transdução de luz.

Um resultado clínico da RP é a desestabilização da barreira hemato-retiniana dos capilares perifoveais e da cabeça do nervo óptico. Esta desestabilização resulta em derrame de corante fluoresceína observado por angiografia. Para além do derrame, pode ocorrer e pode-se observar a acumulação de fluido como microquistos na camada plexiforme exterior. Estes cistos cheios com fluido podem eventualmente rebentar, resultando em lesões da camada retiniana. O presente invento contempla o tratamento de lesões relacionadas com RP na retina promovendo a depuração acelerada do fluido de tecido que se acumula nos microquistos.

Exemplo 10

Melhoria dos sintomas de retinite pigmentosa após hialuronidase intravítrea

Um humano macho com cinquenta e nove (59) anos de idade apresentava uma história retinite pigmentosa. A visão não corrigida no seu olho esquerdo era 20:400 e com a correcção era também 20:400. Administrou-se uma única injecção intravítrea de 100 UI da hialuronidase ACS no olho esquerdo do paciente. O outro olho permaneceu não tratado. 41 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ Ο paciente foi examinado repetidamente após a dose de hialuronidase ACS e a visão no olho direito do paciente (não tratado) permaneceu inalterada, enquanto se observou que a visão no olho esquerdo do paciente (tratado) melhorou como se segue:

Tempo Pressão intra- ocular Acuidade visual sem ajuda Acuidade visual com a melhor correcção Linha de base 17 mm 20/400 20/400 1 dia após trat. 26 mm HMt / 1 ft HM / 1 ft 1 semanas HM / 1 ft HM / 1 ft 2 semanas 14 mm cf4 @ 3 ft cf@3ft. 3 semanas 14 mm 20:300 20:300 4 semanas 12 mm 20:200 20:80 8 semanas 15 mm 20:80 20:40 9 semanas 15 mm 20:60 20:40 10 semanas 18 mm 20:80 20:40 tHM indica "movimento da mão" 4cf indica "contagem de dedos"

Os resultados do estudo demonstram que existiram melhorias significativas no desempenho visual do sujeito, tanto no que se refere à acuidade visual sem ajuda (melhorando de 20:400 para 20:80) como à acuidade visual com a melhor correcção (melhorando de 20:400 para 20:40). Também, embora se tenham observado alterações na pressão intra-ocular do sujeito durante o periodo de tratamento, a pressão intra-ocular pareceu regressar aos níveis da linha de base aproximadamente duas semanas após o tempo de injecção. Ainda que estes resultados sejam de um único paciente, parecem ser suficientemente promissores para justificar outros estudos.

Tratamento de buracos maculares com hialuronidase

Uma ruptura ou abertura de rebentamento da mácula é conhecida por buraco macular. Interessantemente, esta condição ocorre usualmente em mulheres com idades na casa dos sessenta a oitenta, ou após trauma tal como lesão por luz, lesão solar, introflexão escleral, ou em olhos estafilomatosos. Os sintomas incluem metamorfopsia e acuidade visual diminuída.

Pensa-se que a formação de buraco macular resulta da tracção tangencial através da superfície retiniana, induzida pelo vítreo cortical posterior, com envolvimento de movimento de fluido numa cavidade de sinérese vítrea posterior. A 42 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ cavidade de sinérese vítrea posterior está presente na vasta maioria de pacientes que apresentam buracos maculares. Pensa-se que, à medida que gel vítreo posterior se afasta da superfície retiniana, o intervalo resultante entre as duas superfícies cria um espaço onde o movimento do humor vítreo pode interactuar negativamente com a superfície retiniana. Pensa-se que o movimento tangencial do humor vítreo dentro do espaço da cavidade de sinérese vítrea posterior promove rasgões da membrana retiniana, resultando na criação de buracos maculares. O presente invento contempla a utilização de hialuronidase ACS para despolimerizar o vítreo de modo a eliminar as condições que resultam na formação de buracos maculares. Com a despolimerização do vítreo, a cavidade de sinérese vítrea posterior é eliminada, como resultado da reorganização do vítreo mediada por hialuronidase ACS. A eliminação desta cavidade permite ao fluido entre o vítreo e a retina mover-se livremente dentro da câmara vítrea, dispersando quaisquer forças nocivas que de outro modo seriam dirigidas contra a superfície retiniana. O Exemplo seguinte discute o tratamento de um paciente apresentando os sintomas precoces da formação de buraco macular.

Exemplo 11

Tratamento de buracos maculares

Um paciente apresentando os sinais iniciais de formação de buraco macular é tratado com uma injecção intravítrea de hialuronidase ACS. O paciente a ser tratado apresenta os vários sinais de pré-formação de buraco macular. Estes incluem perda da depressão foveal associada a um ponto foveal amarelo ou anel. A fóvea começou a ficar mais fina na região de formação de buraco e a lesão pode adquirir um aspecto avermelhado. Nesta fase, a angiografia com fluoresceína pode parecer normal ou exibir uma hiper-fluorescência desmaiada. O aspecto de uma deiscência de espessura total excêntrica indica uma fase precoce avançada da doença. Ao observar estes sintomas, inicia-se o tratamento com hialuronidase ACS. O tratamento com hialuronidase ACS do presente invento é iniciado quando é diagnosticada a formação de um buraco 43 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ macular. Ο paciente é submetido a um exame oftálmico completo para estabelecer uma linha de base de saúde ocular. O exame oftálmico incluiu oftalmoscopia indirecta, biomicroscopia de lâmpada de fenda, exame retiniano periférico, medições da pressão intra-ocular, sintomatologia de acuidade visual (sem ajuda e com a melhor correcção), fotografia de fundo, angiografia com fluoresceina, electrorretinografia e medições "A-scan".

Após o exame preliminar, administra-se uma injecção intravitrea de hialuronidase ACS ao olho afectado do paciente. Se ambos os olhos estiverem afectados, estes podem ser tratados separadamente. O olho a ser tratado é injectado intravitreo com 50 II de 50 UI da solução oftálmica de hialuronidase ACS anteriormente descrita para promover a despolimerização de ácido hialurónico vítreo, resultando na liquefacção do vítreo.

Após tratamento, os olhos dos pacientes devem ser examinados nos dias um (1), dois (2), sete (7), quinze (15), trinta (30) e sessenta (60) . No dia de cada exame, o paciente é monitorado quanto à liquefacção vítrea. É também realizada angiografia com fluoresceina, considerada um método particularmente eficaz de monitorização do curso do tratamento. Adicionalmente, o paciente é monitorado quanto a descolamentos vítreos posteriores utilizando oftalmoscopia indirecta com depressão escleral.

Tratamento de exsudados maculares com hialuronidase

Os exsudados maculares são um material que penetra a barreira hemato-retiniana e se infiltra através da mácula para o interior da câmara vítrea. Existem dois tipos, exsudados moles e exsudados duros. Os exsudados moles não são realmente exsudados mas aglomerações de axónios de células ganglionares na camada de fibra nervosa que foi submetida a uma dilatação bulbosa num local de lesão isquémica ou enfarte. Os exsudados duros são vulgarmente exsudados como resultado de alterações microvasculares em retinopatia de fundo ("background"). Os exsudados duros aparecem amarelos e cerosos frequentemente depositados de um modo circular em torno da mácula. Consistem de material lípido e proteico derivado da exsudação de componentes de soro a partir de vasos com derramas ou a partir dos produtos lípidos de elementos neurais degenerescentes dentro da retina. A adsorção de exsudados duros é 44 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ principalmente mediada por ressorção macrofágica, porém, a velocidade deste processo pode ser lenta uma vez que a exsudação ocorre frequentemente na camada plexiforme exterior dentro da zona avascular da retina. O presente invento é particularmente útil na redução da extensão da acumulação exsudativa resultante da desestabilização da membrana retiniana, uma vez que a despolimerização do vítreo pela hialuronidase ACS promove uma velocidade de renovação acrescida dos componentes aquosos do vítreo.

Exemplo 12

Tratamento de exsudados maculares

Um paciente apresentando exsudados maculares é tratado com o método da injecção de hialuronidase ACS do presente invento. O paciente é submetido a um exame oftálmico completo para estabelecer uma linha de base de saúde ocular. O exame oftálmico incluiu oftalmoscopia indirecta, biomicroscopia de lâmpada de fenda, exame retiniano periférico, medições da pressão intra-ocular, sintomatologia de acuidade visual (sem ajuda e com a melhor correcção), fotografia de fundo, angiografia com fluoresceína, electrorretinografia e medições "A-scan".

Após o exame preliminar, administra-se uma injecção intravítrea de hialuronidase ACS ao olho afectado do paciente. Se ambos os olhos estiverem afectados, estes podem ser tratados separadamente. O olho a ser tratado é injectado intravítreo com 50 II de 50 UI da solução oftálmica de hialuronidase ACS anteriormente descrita para promover a despolimerização de ácido hialurónico vítreo, resultando na liquefacção do vítreo.

Após tratamento, os olhos dos pacientes são examinados nos dias um (1), dois (2), sete (7), quinze (15), trinta (30) e sessenta (60). No dia de cada exame, o paciente é monitorado quanto à liquefacção vítrea. É também realizada angiografia com fluoresceína, considerada um método particularmente eficaz de monitorização do curso do tratamento. Adicionalmente, o paciente é monitorado quanto a descolamentos vítreos posteriores utilizando oftalmoscopia indirecta com depressão escleral. 45 ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ

Tratamento de edema macular cistóide O edema macular cistóide é uma anormalidade ocular comum resultante de um grupo diverso de etiologias. A maioria das causas desta condição resultam de uma perturbação da barreira hemato-retiniana dos capilares perifoveais e da cabeça do nervo óptico, que resulta em derrame de fluido que se acumula em microquistos da camada plexiforme exterior. Esta região é uma zona relativamente fina e sub-vascularizada da retina. Clinicamente, um edema macular cistóide produz um aspecto tipo colmeia quando examinado com anqiografia com fluoresceina. À medida que o edema progride, a camada plexiforme exterior pode romper-se, produzindo um buraco lamelar. O buraco pode ficar confinado à camada interior da retina ou pode eventualmente progredir até um buraco macular completo. O presente invento contempla o tratamento de edema macular cistóide e a prevenção da formação de buraco macular através da despolimerização do vítreo mediada por hialuronidase ACS.

Exemplo 13

Tratamento de exsudados maculares

Um paciente apresentando os indícios de edema macular cistóide é tratado com uma injecção intravítrea de hialuronidase ACS conforme descrito nos Exemplos 11 e 12.

Será de notar pelos peritos na especialidade que o invento foi aqui anteriormente descrito por referência a certas concretizações e exemplos apenas presentemente preferidos, e não foi feito qualquer esforço para descrever exaustivamente todas as concretizações nas quais o invento pode tomar forma física ou ser praticado. De facto, podem ser feitas várias modificações às concretizações específicas e exemplos aqui anteriormente descritos, sem sair do espírito pretendido e do âmbito do presente invento. Assim, pretende-se que todas as modificações razoáveis ao anterior sejam incluídas dentro do âmbito das reivindicações seguintes.

Lisboa,

Claims (18)

1. ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma hialuronidase na preparação de um medicamento para induzir a liquefacção de um humor vítreo para tratar uma perturbação do olho de um mamífero por administração intravítreo a um humor vítreo isento de sangue hemorrágico que permite a observação de uma retina do referido olho de mamífero não como auxiliar da vitrectomia, caracterizada por ser definida como causando hidrólise das ligações endo-N-acetil-hexosamínicas de ácido hialurónico, a referida hialuronidase estando: isenta de timerosal, e essencialmente desprovida de fracções de hialuronidase de pesos moleculares acima de 100 000, entre 50 000 e 60 000, e abaixo de 20 000, conforme determinado por electroforese SDS-PAGE em gradiente de 4-20%.
2. 2. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de tratar retinopatia diabética proliferativa.
3. 3. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de tratar degenerescência macular relacionada com a idade.
4. 4. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de tratar ambliopia.
5. 5. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de tratar retinite pigmentosa.
6. 6. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de tratar buracos maculares.
7. 7. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de tratar exsudados maculares. ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ 2/3
8. 8. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de tratar edema macular cistóide.
9. 9. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a hialuronidase ser preparada numa solução para injecção.
10. 10. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a dose de hialuronidase ser 5-200 Unidades Internacionais.
11. 11. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a dose de hialuronidase ser 1 Unidade Internacional.
12. 12. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a hialuronidase estar numa forma de dose múltipla.
13. 13. Utilização de acordo com a Reivindicação 12, caracterizada por a ' hialuronidase estar num volume injectável inferior a 100 11.
14. 14. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a hialuronidase ser preparada numa solução para injecção e que tem a formulação: referida hialuronidase até 8000 UI; lactose de 5,0 - 130,0 mg; e fosfato de 0,01 - 100,0 mmol.
15. 15. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a hialuronidase ser preparada numa solução para injecção e que tem a formulação: referida hialuronidase de 6500 UI; lactose a 5,0 mg; e fosfato a 0,02 mmol.
16. 16. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a hialuronidase ser preparada numa solução para injecção e que tem a formulação: a referida hialuronidase de 500 - 1000 UI; ΕΡ Ο 983 084 /ΡΤ 3/3 lactose de 5,0 - 10,0 mg; e fosfato de 0,01 - 10,0 mmol.
17. 17. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a liquefacção ser realizada com o objectivo de induzir o descolamento vitreo posterior (DVP).
18. 18. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por a hialuronidase ser hialuronidase testicular de ovino. Lisboa,