CN103468662A - 一种重组人透明质酸酶、其生产纯化方法、制剂及使用方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人透明质酸酶、其生产纯化方法、制剂及使用方法与应用，所述重组人透明质酸酶采用重组人透明质酸酶PH20或人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc，用于粘膜或皮肤表面。所述人透明质酸酶制剂可制成膜片剂、喷剂、洗剂、冻干粉喷雾剂等形式，用于美容营养物质皮肤促渗、表面麻醉剂皮肤粘膜促渗、皮肤病治疗药物的促渗、生物安定药粘膜促渗、生长因子粘膜皮肤促渗、降糖药粘膜促渗、中枢神经营养物质粘膜鼻腔促渗等。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人透明质酸酶、其生产纯化方法、制剂及使用方法与应用。
背景技术
透明质酸是真皮中主要的粘多糖形式，是由重复的二糖单元D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的线性多糖。透明质酸能够保持超过自身重量500倍的水分，形成非常粘稠的溶液，填充在胞外基质胶原蛋白纤维骨架之内，影响胞外基质的传质特征。胞外基质是许多药物进行皮下注射的主要障碍。胶原蛋白纤维构成的固态基架与嵌入富含透明质酸的黏性凝胶，造成一定的传质阻力，限制了药物代谢动力学以及能够从同一位点进行皮下注射的液体体积，以及到达血管的速度和数量。透明质酸酶是最有效的组织药物渗透和药物扩散剂，自然界中毒蛇昆虫咬人都是利用透明质酸酶快速促进毒物渗透和攻击猎物。
透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族，通过催化透明质酸的水解，透明质酸酶降低透明质酸的黏度，可逆性地改变真皮的结构，由此提高组织的通透性。透明质酸半衰期15-20h，在体内更新时间短，皮肤能够快速修复。基于透明质酸酶的打通胞外基质屏障给药是一种新型高效给药平台。根据作用机理与降解产物的不同，可将透明质酸酶分为三类。第一类包括β-D-乙酰-D-己糖胺酶，将高分子量底物降解成四糖作为主要的终产物。睾丸透明质酸酶是这一种类的原型，它能够催化转糖基作用，因此，在水解HA的过程中也会形成六碳糖、二糖以及八碳糖。第二类，以水蛭透明质酸酶为代表的透明质酸酶。第三类，细菌透明质酸酶，是裂解酶。
自1940s以来，动物组织中提取的含透明质酸酶活性的扩散因子已作为促扩散剂用于临床给药。但是其应用范围一直限定于紧急情况，主要是因为对成分不完全明确的酶制剂中其他杂质成分的顾虑。动物组织提取透明质酸酶制剂中有效成分小于1%，绝大部分为异源杂质蛋白。
继中性人透明质酸酶基因发现之后（现专利已过期），美国Hylozyme公司采用DNA来源的重组人源透明质酸酶（PH20）取代动物源纯化的透明质酸酶，降低免疫原性、提升安全性，扩大应用范围。重组人透明质酸酶PH20有六个糖化点和五个二硫键，工业上难于高表达和生产，除美国Hylozyme公司采用基因拷贝扩增技术和CHO细胞成功表达和生产了重组人透明质酸酶PH20外，到目前为止还没有其它报道使用非基因拷贝扩增技术和新型CHO细胞（CHO-S）成功表达和生产了糖化完整比活性和Hylozyme公司表达和生产的重组人透明质酸酶PH20比活性相似的重组人透明质酸酶PH20的案例。
重组人透明质酸酶（PH20）半衰期短，已有人使用聚乙二醇化学偶联PH20，生产了长效人透明质酸酶，已用于人类临床实验治疗肿瘤。
透明质酸酶主要用于皮下输液、眼周手术麻醉、化药和生物药促渗、尿路造影术中造影剂的吸收，其中和生物药制成复方注射剂的药物有胰岛素、抗体和免疫球蛋白。
透明质酸广泛分布于皮肤、口腔、舌下粘膜、牙龈表面组织、鼻粘膜和肠道粘膜（如肛肠）等。由于舌下粘膜、牙龈表面组织、鼻粘膜和肠道粘膜上皮细胞没有角化，有利于粘膜局部直接使用透明质酸酶促进其他药物（化药、生物药）的渗透。目前还没有使用人透明质酸酶膜片剂、喷剂或洗剂等促进面部美容营养品、麻醉药、化药、生物药经皮肤和粘膜（舌下粘膜、颊粘膜、软腭粘膜、硬腭粘膜、牙龈粘膜）渗透的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种促渗效果好的重组人透明质酸酶。
本发明的第二个目的是提供一种重组人透明质酸酶生产纯化方法。
本发明的第三个目的是提供一种重组人透明质酸酶制剂。
本发明的第四个目的是提供一种重组人透明质酸酶制剂的使用方法。
本发明的第五个目的是提供一种重组人透明质酸酶的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组人透明质酸酶，用于粘膜或皮肤表面，采用重组人透明质酸酶PH20或人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc；其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PH20-IgFc的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述重组人透明质酸酶的生产纯化方法，使用富含GC基因表达载体pMH3、pMH4或pMH5载体、新型CHO-S细胞进行生产，再采用Q琼脂糖离子交换层析-苯基琼脂糖疏水相互作用层析-羟基磷灰石层析-SP琼脂糖离子交换层析四步纯化方法进行纯化。
一种重组人透明质酸酶制剂，包含上述的重组人透明质酸酶，所述制剂采用膜片剂、洗剂、液体喷剂或冻干粉喷雾剂形式，所述膜片剂是以吸水膜为承载基础。
进一步地，包括150-1500IU/ml的重组人透明质酸酶，5-15mM Na2HPO4，0.01-0.06%CaCl2，0.05-0.2%EDTA-Na2，100-200mM NaCl，0.05-0.2%HSA，且pH值为5.5-7.5。
进一步地，包括500IU/ml的重组人透明质酸酶，10mM Na2HPO4，0.03%CaCl2，0.1%EDTA-Na2，145mM NaCl，0.1%HSA，且pH值为5.5-7.5。
进一步地，所述液体喷剂或冻干粉喷雾剂形式的制剂包括：胰岛素20-160单位/ml、200-1000单位PH20或PH20-HAS或PH20-IgFc/ml。
进一步地，所述胰岛素可替换为神经生长因子或神经保护肽NAP。
上述的重组人透明质酸酶制剂的使用方法，先使用重组人透明质酸酶制剂促进皮肤或粘膜的渗透性，使其作为配合给药的促渗剂，再针对皮肤或粘膜进行给药，或者将药物与所述制剂预先混合后再针对皮肤或粘膜使用。
上述的重组人透明质酸酶制剂的使用方法，将所述制剂喷入鼻腔粘膜。
一种重组人透明质酸酶的应用，作为促渗剂配合给药，用于粘膜或皮肤表面。
进一步地，所述重组人透明质酸酶包括重组人透明质酸酶PH20或人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc；其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PH20-IgFc的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述透明质酸酶用于美容营养物质的皮肤促渗、表面麻醉剂的皮肤粘膜促渗、皮肤病治疗药物的皮肤促渗、生物安定药粘膜促渗、生长因子粘膜促渗、降糖药粘膜促渗、心血管药粘膜促渗、中枢神经营养物质粘膜鼻腔促渗，或其他不同生物活性物质和药物的皮肤或粘膜促渗。
进一步地，所述美容营养物质包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、胶原或透明质酸；所述麻醉剂包括利多卡因、复方利多卡因或丁卡因；所述皮肤病治疗药物包括维生素A酸、抗菌素、糖皮质激素、抗菌素或消毒剂；所述生物安定药包括褪黑色素或胰岛素；所述生长因子包括生长激素、生长激素促释放激素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胶原或透明质酸；所述降糖药包括胰岛素、Extendin-4、GLP1或Leptin；所述心血管药包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸异山梨酯或速效救心丸；所述中枢神经营养物质包括神经保护肽NAP、神经生长因子或胰岛素；所述其他不同生物活性物质和药物包括盐酸纳洛酮、盐酸阿扑吗啡、睡眠康宁（脑部睡眠因子MT）、阿莫沙平、尼古丁、肝素、盐酸丁丙诺非、复方丹参、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定（异丙肾上腺素）、盐酸克伦特罗、干扰素、白介素2、肿瘤坏死因子、红细胞生成素、白细胞生成素、心钠素、生长抑素、降钙素、甲状旁腺激素、蜂皇浆、生长激素促释放激素、催产素、抗利尿激素、ddAVP、金刚烷肽、阿昔洛韦、利托那韦或茚地那韦。
由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
本发明的重组人透明质酸酶可制成膜片剂、洗剂、液体喷剂或冻干粉喷雾剂，在配合给药中预先使用可促进皮肤、粘膜等的渗透性，增强皮肤、粘膜对美容营养物质、表面麻醉剂、皮肤病治疗药物、生物安定药、生长因子、降糖药、心血管药、中枢神经营养物质或其他不同生物活性物质或药物的吸收；也可以预先与特定药物混合或制成复方制剂使用。
具体实施方式
本发明主要是利用富含GC动物细胞表达技术(WO/2008/091276)和动物细胞反应器（WO2006/138143和WO2007/142664）生产重组人透明质酸酶PH20、人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白（PH20-HSA）和人透明质酸酶人免疫球白蛋IgG2Fc片段融合蛋白（PH20-IgFc），制造重组人透明质酸酶膜片剂、液体喷剂、洗剂和冻干粉喷雾剂等，用于美容营养物质皮肤促渗、表面麻醉剂皮肤粘膜促渗、皮肤病治疗药物的促渗、生物安定药粘膜促渗、生长因子粘膜促渗、降糖药粘膜促渗、心血管药粘膜促渗、中枢神经营养物质粘膜鼻腔促渗，或其他不同生物活性物质和药物的皮肤或粘膜促渗等。
本发明的一种重组人透明质酸酶，用于粘膜或皮肤表面，采用重组人透明质酸酶PH20或人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc；其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PH20-IgFc的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述重组人透明质酸酶的生产纯化方法，使用富含GC基因表达载体pMH3、pMH4或pMH5载体、新型CHO-S细胞进行生产，再采用Q琼脂糖离子交换层析-苯基琼脂糖疏水相互作用层析-羟基磷灰石层析-SP琼脂糖离子交换层析四步纯化方法进行纯化。
包含上述重组人透明质酸酶的制剂，可以采用膜片剂、洗剂、液体喷剂或冻干粉喷雾剂形式，膜片剂可以吸水膜为承载基础，如纱布、无纺布等。
所述制剂包括150-1500IU/ml的重组人透明质酸酶，5-15mM Na2HPO4，0.01-0.06%CaCl2，0.05-0.2%EDTA-Na2，100-200mM NaCl，0.05-0.2%HSA，且pH值为5.5-7.5。优选地，所述制剂包括500IU/ml的重组人透明质酸酶，10mM Na2HPO4，0.03%CaCl2，0.1%EDTA-Na2，145mM NaCl，0.1%HSA，且pH值为5.5-7.5。使用时可以先使用重组人透明质酸酶制剂促进皮肤或粘膜的渗透性，使其作为配合给药的促渗剂，再针对皮肤或粘膜进行给药，或者将药物与所述制剂预先混合后再针对皮肤或粘膜使用。
液体喷剂或冻干粉喷雾剂形式的制剂包括：胰岛素20-160单位/ml、200-1000单位PH20或PH20-HAS或PH20-IgFc/ml。其中，胰岛素可替换为神经生长因子或神经保护肽NAP。使用时将所述制剂喷入鼻腔粘膜即可。
上述重组人透明质酸酶的应用，作为促渗剂配合给药，用于粘膜或皮肤表面。可用于美容营养物质的皮肤促渗、表面麻醉剂的皮肤粘膜促渗、皮肤病治疗药物的皮肤促渗、生物安定药粘膜促渗、生长因子粘膜促渗、降糖药粘膜促渗、心血管药粘膜促渗、中枢神经营养物质粘膜鼻腔促渗，或其他不同生物活性物质和药物的皮肤或粘膜促渗。
其中，所述美容营养物质包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、胶原或透明质酸；所述麻醉剂包括利多卡因、复方利多卡因或丁卡因；所述皮肤病治疗药物包括维生素A酸、抗菌素、糖皮质激素、抗菌素或消毒剂；所述生物安定药包括褪黑色素或胰岛素；所述生长因子包括生长激素、生长激素促释放激素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胶原或透明质酸；所述降糖药包括胰岛素、Extendin-4、GLP1或Leptin；所述心血管药包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸异山梨酯或速效救心丸；所述中枢神经营养物质包括神经保护肽NAP、神经生长因子或胰岛素；所述其他不同生物活性物质和药物包括盐酸纳洛酮、盐酸阿扑吗啡、睡眠康宁（脑部睡眠因子MT）、阿莫沙平、尼古丁、肝素、盐酸丁丙诺非、复方丹参、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定（异丙肾上腺素）、盐酸克伦特罗、干扰素、白介素2、肿瘤坏死因子、红细胞生成素、白细胞生成素、心钠素、生长抑素、降钙素、甲状旁腺激素、蜂皇浆、生长激素促释放激素、催产素、抗利尿激素、ddAVP、金刚烷肽、阿昔洛韦、利托那韦或茚地那韦等。
以下结合优选实施例进行说明，应当理解此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。由于人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白（PH20-HSA），以及人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白（PH20-IgFc）的生产原理、方法及应用与重组人透明质酸酶（PH20）相同或类似，因此以下实施例中仅以PH20为例进行具体说明。
实施例1
目的：重组人透明质酸酶PH20的基因构建、表达、免疫学检测、活性检测和反应器生产。
研究背景：重组人透明质酸酶PH20有六个糖化点和五个二硫键，工业上难于高表达和生产。除美国Hylozyme公司采用基因拷贝扩增技术成功表达和生产了重组人透明质酸酶PH20外，到目前为止还没有其它报道使用非基因拷贝扩增技术和新型CHO细胞（CHO-S）成功表达和生产了糖化完整比活性和Hylozyme公司表达和生产的重组人透明质酸酶PH20比活性相似的重组人透明质酸酶PH20的案例。
本发明利用我们有自主知识产权的非基因拷贝扩增技术，即富含GC动物细胞表达技术(WO/2008/091276)和动物细胞反应器（WO2006/138143和WO2007/142664）技术，使用新型CHO细胞（CHO-S）生产出高质量可商业化的重组人透明质酸酶PH20。
方法：通过PCR的方法将表达PH20氨基酸顺序（SEQ ID No.1）的结构基因（SEQ ID No.4）合成，并构建到富含GC的动物细胞表达载体pMH3、pMH4、pMH5（SEQ ID No.5、6、7）中，小量制备这几种表达质粒后，稳定转染到无血清悬浮培养的新型CHO细胞（CHO-S）中。通过G418筛选，用枪头手动挑取稳定克隆到96孔板中。当细胞汇合度大于50%时，更换无血清新鲜培养基；3-6小时后，收集培养基样品，通过检测透明质酸酶生物活性，选出表达量最高的克隆多个。在40ml摇瓶悬浮流加培养13天，活性单位呈增长趋势，最高收液培养液中活性单位为2000U/ml。继续在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定性研究；选出传代稳定的克隆在5L激流式反应器内进行扩增。PH20在AP20SC（5L）反应器上的大规模培养工艺开发：接种密度：2×106个cells/ml；参数工艺：T：生长期37℃，表达期34℃；DO：5-10%PH：6.8-7.2；生长期培养基：B001，流加培养基：F001+糖；培养进入表达期后，每天调一次PH至6.8，然后关闭加碱泵；培养周期16天，最高活性为3522U/ml。
结果：（1）重组人透明质酸酶PH20在新型CHO细胞（CHO-S）中成功表达，western blot结果表明筛选到重组人透明质酸酶PH20稳定高表达克隆所产生的条带分子量大小正确；（2）高表达克隆在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定；（3）稳定的高表达克隆在5L激流式反应器内进行流加培养扩增，各批次丰收液中透明质酸酶活性达到1800-3500活性单位/毫升，达到了工业化生产水平。
结论：使用富含GC的动物细胞表达载体pMH3、4、5，重组人透明质酸酶PH20在新型CHO细胞（CHO-S）中成功表达，各批次丰收液中透明质酸酶活性达到1800-3500活性单位/毫升，即每毫升培养液可以生产150单位的注射用重组人透明质酸酶5-10支，满足工业化生产要求。
实施例2
目的：重组人透明质酸酶PH20的分离纯化。
方法：发酵液前处理：将所得5L激流式反应器所得发酵液使用固液分离装置（离心机、膜包、中空纤维柱、套筒等）获得上清，在10mM Tris pH7.5中切向流透析，然后通过Q琼脂糖离子交换层析、苯基琼脂糖疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析和SP琼脂糖离子交换层析，纯化人重组透明质酸酶。
层析：用10mM Tris+50mM NaCl pH7.5缓冲液冲洗10个柱体积，将人重组透明质酸酶结合到Q琼脂糖柱上，再用含有400mM NaCL的同样的缓冲液洗脱。将洗脱峰用2M硫酸铵稀释至最终浓度为500mM，并流穿通过苯基琼脂糖柱。补加10mM K3PO4至10mM，pH7.4，流穿通过羟基磷灰石柱。将上一步收集流穿液以切向流设备缓冲液置换除盐，电导为5ms/cm，pH5.4，再用含有140mM NaCl的同样缓冲液洗脱。
将用20mM His+100mM NaCl pH7.0浓缩换液上述洗脱峰至浓度为1mg/ml，置于-20度保存。
结果：通过SDS-PAGE电泳显示其纯度大于95%；通过分子筛HPLC检测显示其纯度为99%；蛋白总收率约为40%；
结论：重组人透明质酸酶PH20经分离纯化后，纯度符合要求；每毫克重组人透明质酸酶活性13-16万单位，内毒素远低于国家药监局要求。
实施例3
目的：重组人透明质酸酶PH20的活性和稳定性研究
方法：重组人透明质酸酶PH20液体制剂配方和稳定性研究方法如下：
制剂配方：1500IU PH20+10mM Na2HPO4+0.03%CaCl2+0.1%EDTA-Na2+145mM NaCl+0.1%HSA pH5.5-7.5
稳定性研究：将500U/ml PH20过滤后的溶液分装至2ml安培瓶中，将25瓶溶液置于37℃，湿度为75±5%的加速试验培养箱中。分别在第0、7、14、21、28、35、42天取样，按照2010版药典附录玻璃酸酶活性检测。
结果：
表1、重组人透明质酸酶PH20稳定性研究
| 时间（d） | 1 | 2 | 3 | 平均值（U/ml） | 偏差 | CV |
| 0 | 468 | 512 | 491 | 490.33 | 22.01 | 4.49 |
| 7 | 544 | 420 | 520 | 494.67 | 65.77 | 13.30 |
| 14 | 496 | 447 | 507 | 483.33 | 31.94 | 6.61 |
| 21 | 575 | 489 | 443 | 502.33 | 67.00 | 13.34 |
| 28 | 426 | 444 | 435 | 435.00 | 9.00 | 2.07 |
| 35 | 485 | 449 | 437 | 457.00 | 24.98 | 5.47 |
| 42 | 447 | 361 | 448 | 418.67 | 49.94 | 11.93 |
体外试管内制剂稳定性实验结果表明，重组人透明质酸酶PH20的活性在以上制剂中37度活性损失小于10%，从第28天开始活性出现显著性下降（约15%）。
活性研究：使用非基因拷贝扩增技术和新型CHO细胞（CHO-S）生产的重组人透明质酸酶PH20小鼠台盼蓝(Trypan Blue)皮下扩散实验，阴性对照组为无透明质酸酶小鼠台盼蓝(Trypan Blue)皮下注射，阳性对照组为提取的透明质酸酶0.5单位小鼠台盼蓝(Trypan Blue)皮下注射，实验组为使用非基因拷贝扩增技术和新型CHO细胞（CHO-S）生产的重组人透明质酸酶0.5单位小鼠台盼蓝(Trypan Blue)皮下注射。
使用实施例2的纯化方法，测定用非基因拷贝扩增技术和新型CHO细胞（CHO-S）生产的＞99%纯度的重组人透明质酸酶PH20每毫克为13万单位。
结论：人透明质酸酶PH20在以上制剂中37度的稳定性大于28天，活性损失小于10%，有多个糖化点和二硫键，适用于和多种药物做稳定复方制剂。
实施例4
目的：研究含透明质酸面膜和重组人透明质酸酶皮肤粘膜促渗片的互相间作用。
原料：透明质酸原液，外观粘稠，分子量在200-1000KD；重组人透明质酸酶皮肤粘膜促渗片，7x7厘米无纺布，内含重组人透明质酸酶1000单位/2毫升；
方法：将外观粘稠分子量在200-1000KD的透明质酸原液2毫升加入0.5毫升PBS，做为对照组，将外观粘稠，分子量在200-1000KD的透明质酸原液2毫升加入从重组人透明质酸酶皮肤粘膜促渗片挤出的0.5毫升透明质酸酶溶液，做为实验组。测定面部皮肤表面温度为34度，将对照组和实验组34度培育两个小时，观察对照组和实验组液体粘稠状态。
结果：见表2。
表2、为对照组和实验组液体外观粘稠状态
| 对照组 | 实验组 | |
| 液体外观和粘稠状态 | 粘液状 | 水状 |
结论：99%纯度的重组人透明质酸酶可在皮肤温度条件下，将呈粘液状（分子量在200-1000KD）的大分子透明质酸原液消化成水状的分子量在5-20KD的小分子透明质酸，有助于小分子透明质酸的形成和吸收。使用重组人透明质酸酶皮肤粘膜促渗片涂擦皮肤，再使用含有透明质酸面膜，不但可以促进皮肤粘膜对皮肤美容营养物质的渗透性，还可以促进小分子透明质酸的形成、吸收和实现与受体结合的小分子透明质酸生理功能。
实施例5
目的：研究重组人透明质酸酶促渗片面部皮肤涂擦后再涂擦复方利多卡因乳膏对激光皮肤治疗的镇痛效果。
方法：面部皮肤涂擦复方利多卡因乳膏一直是激光皮肤治疗的镇痛方法，但镇痛效果不完全，不能完全缓解病人的疼痛。我们使用重组人透明质酸酶面部皮肤促渗片涂擦皮肤后再涂擦复方利多卡因乳膏，研究了七例病人对激光皮肤治疗的镇痛促进作用。具体方法为，先将病人脸的右半部使用重组人透明质酸酶面部皮肤促渗片涂擦，再将复方利多卡因乳膏涂擦病人脸的左半部和右半部，十分钟后做病人全脸的激光皮肤治疗和除斑治疗。
结果：见表3。
表3、重组人透明质酸酶促渗片面部皮肤涂擦皮肤后再涂擦复方利多卡因乳膏对激光皮肤治疗的镇痛促进作用
| 面部处理 | 促渗片+复方利多卡因 | 复方利多卡因 |
| 病人感觉 | 无痛 | 可忍受微痛 |
结论：重组人透明质酸酶促渗片面部皮肤涂擦后再涂擦复方利多卡因，对激光皮肤治疗有完全的镇痛作用，重组人透明质酸酶面部皮肤促渗片涂擦皮肤促进了复方利多卡因乳膏的皮肤吸收。
实施例6
目的：研究重组人透明质酸酶促渗片牙龈粘膜涂擦后再涂擦利多卡因对超声洁牙治疗的镇痛效果。
方法：牙龈粘膜涂擦利多卡因一直是超声洁牙治疗的镇痛方法，但镇痛效果不完全、不迅速。我们使用重组人透明质酸酶促渗片牙龈粘膜涂擦后再涂擦利多卡因，研究了三例病人对超声洁牙治疗治疗的镇痛作用。具体方法为，先将病人口腔的右半部牙龈粘膜使用重组人透明质酸酶促渗片涂擦，再将利多卡因涂擦病人口腔的左右两半部的牙龈粘膜，立即开始超声洁牙治疗。
结果：见表4。
表4、重组人透明质酸酶促渗片涂擦后再涂擦利多卡因对超声洁牙治疗的镇痛促进效果
| 牙龈粘膜处理 | 促渗片+利多卡因 | 利多卡因 |
| 病人感觉 | 无痛 | 微痛 |
结论：重组人透明质酸酶促渗片涂擦后再涂擦利多卡因对超声洁牙治疗的镇痛促进效果明显，重组人透明质酸酶促渗片涂擦促进了利多卡因的牙龈粘膜吸收。
实施例7
目的：研究重组人透明质酸酶促渗片牙龈粘膜涂擦后再涂擦重组人成纤维细胞因子的效果。
方法：面部皮肤使用重组人成纤维细胞因子一直美容微针疗法一个主要方法，主要缺点是使用的对皮肤有创伤的微针，容易造成皮肤炎症和感染，急需使用无创的生物促渗剂来取代有创的微针。我们使用重组人透明质酸酶促渗片面部皮肤涂擦后再涂擦重组人成纤维细胞因子或重组人成纤维细胞因子面膜，研究了重组人透明质酸酶促渗片对重组人成纤维细胞因子的促渗作用。具体方法为，先将右半面部使用重组人透明质酸酶促渗片涂擦，再将重组人成纤维细胞因子乳膏涂擦左右两半面部皮肤，4小时后询问左右两侧面部紧凑感，治疗每天一次两天后观察左右两边面部的皮肤情况。
结果：见表5。
表5、重组人透明质酸酶促渗片涂擦后再涂擦重组人成纤维细胞因子的效果
| 面部处理方法 | 促渗片+成纤维细胞因子 | 成纤维细胞因子 |
| 4小时后面部紧凑感 | 有 | 无 |
| 治疗两天后面部的皮肤 | 明显好转 | 好转 |
结论：重组人透明质酸酶促渗片涂擦后再涂擦重组人成纤维细胞因子效果比涂擦重组人成纤维细胞因子效果明显，重组人透明质酸酶促渗片涂擦促进了重组人成纤维细胞因子的皮肤吸收，有可能成为取代有创微针的无创方法。
实施例8
目的：研究重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再在滴入合成胰岛素样生长因子的吸收效果。
方法：生长激素对人体的作用是通过促进体内细胞分泌胰岛素样生长因子，直接使用胰岛素样生长因子可以达到使用生长激素的效果。我们研究了重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再在滴入合成胰岛素样生长因子的吸收效果，对照组（N=3）直接口腔内舌下滴入合成胰岛素样生长因子120微克，实验组（N=3）将先将重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后，再在滴入合成胰岛素样生长因子120微克，每天一次2天后询问病人的食欲，7天后观察病人的肌肉情况。
结果：见表6。
表6、重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再滴入合成胰岛素样生长因子的吸收效果
| 面部处理方法 | 促渗片+胰岛素样生长因子 | 胰岛素样生长因子 |
| 2天后病人的食欲 | 明显提升 | 无提升 |
| 7天后病人的肌肉情况 | 转硬和稍增大 | 无明显变化 |
结论：重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再在滴入合成胰岛素样生长因子的吸收效果明显，重组人透明质酸酶促渗片涂擦促进了合成胰岛素样生长因子的吸收，有可能成为取代皮下注射的口腔粘膜给药方法。
实施例9
目的：研究重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再在滴入合成胰岛素的吸收效果。
方法：两例体重超重的二型糖尿病人（对胰岛素不敏感型），采用自身对照的方法，研究了重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再在滴入合成胰岛素的吸收效果。具体方案为，同一病人第一天测定空腹血糖后，皮下注射胰岛素10个单位，30分钟后测定末梢血血糖浓度；同一病人第二天测定空腹血糖后，先使用重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦，再在舌下滴入合成胰岛素20单位，30分钟后测定末梢血血糖浓度。
结果：见表7。
表7、重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再在滴入合成胰岛素的吸收效果
| 给药方法 | 促渗片+胰岛素口腔粘膜 | 胰岛素皮下注射 |
| 给药前血糖浓度（毫摩） | 7.6 | 7.7 |
| 30分钟后血糖浓度（毫摩） | 6.8 | 6.5 |
结论：重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再在滴入合成胰岛素明显有效，而且效果可以重复，重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦促进了合成胰岛素吸收，估计在胰岛素20单位口腔粘膜给药时的生物利用率为30%-50%之间，有可能成为取代皮下注射的口腔粘膜给药方法。
实施例10
目的：研究重组人透明质酸酶鼻喷剂促进胰岛素鼻腔粘膜吸收的治疗应用。
背景：胰岛素鼻腔粘膜给药可以通过嗅神经周围的细胞间液直接进入中枢神经系统，有可能成为治疗老年轻中度老年痴呆的治疗方法。
方法：重组人透明质酸酶鼻喷剂可以促进胰岛素鼻腔粘膜，增加胰岛素鼻腔粘膜给药效果。本实验设四个实验组，每组5人，均为记忆力差的轻度老年痴呆病人。第一组在中餐后30分钟，仰卧和头稍后仰，用重组人透明质酸酶鼻喷剂1000单位喷或滴入鼻孔，要求病人吸鼻，再将胰岛素20单位喷或滴入鼻孔，要求病人吸鼻，30分钟后测定了末梢血血糖浓度，每天二次，共治疗7天，最后三天治疗30分后询问病人记忆力和注意力的改善情况；第二组在中餐后30分钟，仰卧和头稍后仰，使用胰岛素20单位加入重组人透明质酸酶1000单位，混合后喷或滴入鼻孔，要求病人吸鼻，30分钟后测定了末梢血血糖浓度，每天二次，共治疗7天，最后三天治疗30分后询问病人记忆力和注意力的改善情况；第三组在中餐后30分钟，仰卧和头稍后仰，使用胰岛素20单位冻干粉加入重组人透明质酸酶1000单位冻干粉混合后吸入鼻孔，要求病人吸鼻，30分钟后测定了末梢血血糖浓度，每天二次，共治疗7天，最后三天治疗30分后询问病人记忆力和注意力的改善情况；第四组为生理盐水对照组。记忆力和注意力检查包括文字陈述的记忆力Story Recall and Hopkins Verbal Learning Test和选择注意力Stroop Color-Word test。文字陈述的记忆力检查是让病人听简单44字叙述，立即或在10分后要求病人回忆。
结果：见表8。
表8、重组人透明质酸酶鼻喷剂对胰岛素鼻腔粘膜吸收的效果
| 注意力改善病人数 | 记忆力改善病人数 | |
| 第一组 | 2 | 3 |
| 第二组 | 3 | 3 |
| 第三组 | 2 | 3 |
| 第四组 | 0 | 0 |
结果还表明，餐后30分钟鼻腔粘膜胰岛素治疗后，血糖浓度均大于9毫摩尔。
结论：1、餐后通过鼻腔粘膜联合使用重组人透明质酸酶1000单位和胰岛素30单位明显改善了病人的注意力和记忆力；2、重组人透明质酸酶也可以和胰岛素做成复方重组人透明质酸酶胰岛素液体鼻喷或滴剂；3、类似胰岛素的生物活性物质神经保护肽NAP、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子也可以使用重组人透明质酸酶1000单位通过鼻腔粘膜给药。
实施例11
目的：研究重组人透明质酸酶鼻喷剂促进胰岛素鼻腔粘膜吸收的健康人健脑应用。
背景：胰岛素鼻腔粘膜给药可以通过嗅神经周围的细胞间液直接进入中枢神经系统，成为增强人类记忆力和神经安定的有效方法。
方法：重组人透明质酸酶鼻喷剂可以促进胰岛素鼻腔粘膜，增加胰岛素鼻腔粘膜给药效果。本实验设三个实验组，每组10人，均为健康受试人。第一组在中餐后30分钟，仰卧和头稍后仰，用重组人透明质酸酶鼻喷剂1000单位喷或滴入鼻孔，要求受试人吸鼻，再将胰岛素20单位喷或滴入鼻孔，要求受试人吸鼻，30分钟后测定了末梢血血糖浓度，每天二次，共7天，最后三天治疗30分后询问受试人记忆力、注意力和心烦发脾气的改善情况；第二组在中餐后30分钟，仰卧和头稍后仰，使用胰岛素20单位加入重组人透明质酸酶1000单位，混合后喷或滴入鼻孔，要求受试人吸鼻，30分钟后测定了末梢血血糖浓度，每天二次，共治疗7天，最后三天治疗30分后询问受试人记忆力、注意力和心烦发脾气的改善情况；第三组在中餐后30分钟，仰卧和头稍后仰，使用胰岛素20单位冻干粉加入重组人透明质酸酶1000单位冻干粉混合后吸入鼻孔，要求受试人吸鼻，30分钟后测定了末梢血血糖浓度，每天二次，共治疗7天，最后三天治疗30分后询问病人记忆力和注意力的改善情况；第四组为生理盐水对照组。记忆力和注意力检查包括文字陈述的记忆力Story Recall and Hopkins Verbal Learning Test和选择注意力Stroop Color-Word test。文字陈述的记忆力检查是让病人听简单叙述，立即或在10分后要求受试人回忆。
结果：见表9。
表9、重组人透明质酸酶鼻喷剂对胰岛素鼻腔粘膜吸收的健康人健脑效果。
结果还表明，餐后30分钟鼻腔粘膜胰岛素治疗后，血糖浓度均大于9毫摩尔。
结论：1、餐后通过鼻腔粘膜联合使用重组人透明质酸酶1000单位和胰岛素30单位明显改善了受试人记忆力、注意力和心烦发脾气的情况；2、重组人透明质酸酶也可以和胰岛素做成复方重组人透明质酸酶胰岛素液体鼻喷或滴剂；3、类似胰岛素的生物活性物质神经保护肽NAP、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子也可以使用重组人透明质酸酶1000单位通过鼻腔粘膜给药。
实施例12
目的：研究重组人透明质酸酶鼻喷剂对胰岛素鼻腔粘膜吸收的应用。
背景：胰岛素鼻腔粘膜给药可以通过嗅神经周围的细胞间液直接进入中枢神经系统，有可能成为增强人类记忆力和神经安定的有效方法，还可能成为治疗老年轻中度老年痴呆的治疗方法。
方法：重组人透明质酸酶鼻喷剂可以促进胰岛素鼻腔粘膜，增加胰岛素鼻腔粘膜给药效果。本实验在餐后30分钟，使用重组人透明质酸酶鼻喷剂1000单位处理鼻腔粘膜，再将胰岛素30单位喷入鼻腔粘膜，治疗完成后60分钟后询问病人清醒程度和记忆力的改善情况，并测定了末梢血血糖浓度；本实验还在餐后30分钟使用胰岛素30单位加入重组人透明质酸酶1000单位混合后喷入鼻腔粘膜的方法，治疗完成60分钟后询问病人清醒程度和记忆力的改善情况，并测定了末梢血血糖浓度。
结果：见表10。
表10、重组人透明质酸酶鼻喷剂对胰岛素鼻腔粘膜吸收的效果
结果还表明，餐后30分钟鼻腔粘膜胰岛素治疗后，末梢血糖浓度均远大于6毫摩尔，无低血糖。
结论：餐后通过鼻腔粘膜联合使用重组人透明质酸酶1000单位和胰岛素30单位没有发生低血糖，治疗60分钟后，受试病人主观感觉清醒度和记忆力改善。
实施例13
目的：研究重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再舌下含褪黑素片的效果。
方法：工作负担重精神紧张病人二例，采用自身对照的方法，研究了重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再舌下含褪黑素片的效果。具体方案为，同一病人第一天睡前舌下含服褪黑素片一片，同一病人第二天睡前先使用重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦，在舌下含服褪黑素片半片，反复6天，记录病人用药后的入睡和起床情况。
结果：见表11。
表11、重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再舌下含褪黑素片的效果
| 给药方法 | 促渗片+褪黑素半片 | 褪黑素一片 |
| 入睡情况 | 没出现难以入睡 | 没出现难以入睡 |
| 起床情况 | 起床后感觉睡眠良好 | 起床后感觉睡眠良好 |
结论：重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦后再舌下含褪黑素半片和单用褪黑素一片效效果相当，可以重复，提示重组人透明质酸酶促渗片口腔内咀嚼涂擦促进了褪黑素吸收，为生产重组人透明质酸酶褪黑素复方含片提供了实验支持。
实施例14
目的：研究重组人透明质酸酶促渗片面部皮肤涂擦后再涂擦复方曲安奈德乳膏（Henacomb）的效果。
方法：复方曲安奈德乳膏（Henacomb）含有抗炎的皮质激素、抗真菌药物和抗菌药物，对脂溢性皮炎和神经皮炎有明显效果。我们使用重组人透明质酸酶面部皮肤促渗片涂擦皮肤后再涂擦复方曲安奈德乳膏，研究了一例面部脂溢性皮炎的病人的治疗效果，具体方法为，先将病人脸的右半部使用重组人透明质酸酶面部皮肤促渗片涂擦，再将复方曲安奈德乳膏涂擦病人脸的左半部和右半部，三天后检查病人面部皮肤情况。
结果：见表12。
表12、重组人透明质酸酶促渗片面部皮肤涂擦后再涂擦复方曲安奈德乳膏（Henacomb）的效果
结论：重组人透明质酸酶促渗片面部皮肤涂擦后再涂擦复方曲安奈德乳膏明显比单独使用复方曲安奈德乳膏有效，重组人透明质酸酶面部皮肤促渗片涂擦皮肤促进了复方曲安奈德乳膏的皮肤吸收。
实施例15
目的：研究生物促渗剂重组人透明质酸酶、促渗片、喷冲滴剂和其它药物的联合或复方应用。
方法：根据已有实施例的结果，研究生物促渗剂重组人透明质酸酶和其它药物的联合或复方应用。
结果：生物促渗剂重组人透明质酸酶和其它药物的联合和复方应用，包括但不限于盐酸纳洛酮、盐酸阿扑吗啡、睡眠康宁（脑部睡眠因子MT）、阿莫沙平（asenapine）、尼古丁、肝素、盐酸丁丙诺非、硝酸甘油、硝苯地平、硝酸异山梨酯、复方丹参、速效救心丸、硝苯吡啶、唑吡坦（Edluar）、表皮生长因子、喘息定（异丙肾上腺素）、盐酸克伦特罗、干扰素、白介素2、肿瘤坏死因子、红细胞生成素、白细胞生成素、心钠素、生长抑素、降钙素、甲状旁腺激素、GLP-1、Extendin-4、蜂皇浆、生长激素促释放激素、催产素、抗利尿激素、ddAVP、金刚烷肽、阿昔洛韦、利托那韦、茚地那韦等各种活性肽的促渗。
结论：生物促渗剂重组人透明质酸酶可以和多种其它药物联合或复方应用。
最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种重组人透明质酸酶，其特征在于，用于粘膜或皮肤表面，采用重组人透明质酸酶PH20或人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc；
其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PH20-IgFc的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
2.根据权利要求1所述的重组人透明质酸酶的生产纯化方法，其特征在于，使用富含GC基因表达载体pMH3、pMH4或pMH5载体、新型CHO-S细胞进行生产，再采用Q琼脂糖离子交换层析-苯基琼脂糖疏水相互作用层析-羟基磷灰石层析-SP琼脂糖离子交换层析四步纯化方法进行纯化。
3.一种重组人透明质酸酶制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的重组人透明质酸酶，所述制剂采用膜片剂、洗剂、液体喷剂或冻干粉喷雾剂形式，所述膜片剂是以吸水膜为承载基础。
4.根据权利要求3所述的重组人透明质酸酶制剂，其特征在于，包括150-1500IU/ml的重组人透明质酸酶，5-15mM Na2HPO4，0.01-0.06%CaCl2，0.05-0.2%EDTA-Na2，100-200mM NaCl，0.05-0.2%HSA，且pH值为5.5-7.5。
5.根据权利要求4所述的重组人透明质酸酶制剂，其特征在于，包括500IU/ml的重组人透明质酸酶，10mM Na2HPO4，0.03%CaCl2，0.1%EDTA-Na2，145mM NaCl，0.1%HSA，且pH值为5.5-7.5。
6.根据权利要求3所述的重组人透明质酸酶制剂，其特征在于，所述液体喷剂或冻干粉喷雾剂形式的制剂包括：胰岛素20-160单位/ml、200-1000单位PH20或PH20-HAS或PH20-IgFc/ml。
7.根据权利要求6所述的重组人透明质酸酶制剂，其特征在于，所述胰岛素可替换为神经生长因子或神经保护肽NAP。
8.根据权利要求3-5任一项所述的重组人透明质酸酶制剂的使用方法，其特征在于，先使用重组人透明质酸酶制剂促进皮肤或粘膜的渗透性，使其作为配合给药的促渗剂，再针对皮肤或粘膜进行给药，或者将药物与所述制剂预先混合后再针对皮肤或粘膜使用。
9.根据权利要求6或7所述的重组人透明质酸酶制剂的使用方法，其特征在于，将所述制剂喷入鼻腔粘膜。
10.一种重组人透明质酸酶的应用，其特征在于，作为促渗剂配合给药，用于粘膜或皮肤表面。
11.根据权利要求10所述的重组人透明质酸酶的应用，其特征在于，所述重组人透明质酸酶包括重组人透明质酸酶PH20或人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc；
其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述PH20-IgFc的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
12.根据权利要求10或11所述的重组人透明质酸酶的应用，其特征在于，所述透明质酸酶用于美容营养物质的皮肤促渗、表面麻醉剂的皮肤粘膜促渗、皮肤病治疗药物的皮肤促渗、生物安定药粘膜促渗、生长因子粘膜促渗、降糖药粘膜促渗、心血管药粘膜促渗、中枢神经营养物质粘膜鼻腔促渗，或其他不同生物活性物质和药物的皮肤或粘膜促渗。
13.根据权利要求12所述的重组人透明质酸酶的应用，其特征在于，所述美容营养物质包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、胶原或透明质酸；
所述麻醉剂包括利多卡因、复方利多卡因或丁卡因；
所述皮肤病治疗药物包括维生素A酸、抗菌素、糖皮质激素、抗菌素或消毒剂；
所述生物安定药包括褪黑色素或胰岛素；
所述生长因子包括生长激素、生长激素促释放激素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胶原或透明质酸；
所述降糖药包括胰岛素、Extendin-4、GLP1或Leptin；
所述心血管药包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸异山梨酯或速效救心丸；
所述中枢神经营养物质包括神经保护肽NAP、神经生长因子或胰岛素；
所述其他不同生物活性物质和药物包括盐酸纳洛酮、盐酸阿扑吗啡、睡眠康宁（脑部睡眠因子MT）、阿莫沙平、尼古丁、肝素、盐酸丁丙诺非、复方丹参、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定（异丙肾上腺素）、盐酸克伦特罗、干扰素、白介素2、肿瘤坏死因子、红细胞生成素、白细胞生成素、心钠素、生长抑素、降钙素、甲状旁腺激素、蜂皇浆、生长激素促释放激素、催产素、抗利尿激素、ddAVP、金刚烷肽、阿昔洛韦、利托那韦或茚地那韦。
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