CN102277381A - 一种重组蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组蛋白TNFR2-Fc-IL-1ra，其制备方法是：1、将TNFR2-Fc基因与IL-1ra基因重组成TNFR2-Fc-IL-1ra基因，并将构建到表达载体质粒，将构建好的含TNFR2-Fc-IL-1ra基因表达质粒经过线性化处理后，通过电转仪转染入CHO细胞中，经筛选获得单一稳定表达细胞株，将筛选获得的表达细胞株悬浮驯化培养；2、产物的分离纯化和鉴定：培养后的丰收液经过4750g/min，4℃离心10min，取上清，经过0.22μm过滤后，进行Mabselect亲和层析，收集洗脱峰进一步进行S-sepharose阳离子交换层析(SPSFF)，收集活性峰进行HPLC分析纯化产物的纯度，获得TNFR2-Fc-IL-1ra蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及使用重组蛋白TNFR2-Fc-IL-1ra用于治疗骨性关节炎疾病。
背景技术
骨性关节炎(osteo arthrosis, OA)从关节软骨起病,影响整个关节结构，包括软骨下骨、韧带、滑膜、关节囊及关节外肌肉，最终因关节软骨全部脱失而导致关节畸形和功能丧失的一种疾病。骨性关节炎是世界上最常见的关节病,随年龄增大，患病率迅速上升，大于65岁人群中50%以上有骨性关节炎的X线片表现。骨性关节炎是老年人关节疼痛和致残的主要原因。据世界卫生组织(WHO)统计，骨性关节炎在女性患病率中占第四位，在男性患病率中占第八位，我国60岁以上者膝骨关节炎发病率高达49%。该疾病所导致的疼痛、关节功能障碍，严重降低了中老年人的生活质量，且增加了患者的医疗费用,因而备受重视。
骨性关节炎又称退行性关节炎，是由于关节组织发生了一系列生化变化, 导致其组织正常降解与生成紊乱。近年来的研究表明，这些变化归因于一个复杂的细胞因子网络。当关节内存在炎性损伤时，会引起滑膜炎，继而刺激滑膜和软骨细胞产生细胞因子，如白介素-1( IL-1) ，肿瘤坏死因子-α( T NF-α) ，一氧化氮( NO) ，这些细胞因子会促使基质金属蛋白酶( matr ix metallo proteinases,MMPs) 和纤维蛋白溶酶原激活物( PA) 增多，从而作用在关节软骨上， 使之被破坏, 继发性地引起胶原合成增多、软骨细胞增殖以及前列腺素( PG) 合成增多。而以上这三种改变都可由一些细胞因子如胰岛素样生长因子( IGF-1) , 转化生长因-β( TGF-β) 通过一系列途径引起。这些细胞因子相互调控, 形成复杂网络, 参与着OA 软骨的损伤与修复。在分解代谢层面, MMP 的合成增加, 而其抑制物和细胞外基质成分因炎性介质( 如IL-1, IL-17, IL-18, T NF-α) 而减少。另一方面，合成性细胞因子IGF-1，转化生长因子TGF-β和骨形态发生蛋白( BMPs) 可刺激细胞外基质的合成。现就选择其中几种主要的细胞因子作一综述。
Wood等在1983 年首先报道了关节滑液中有IL-1 存在，并且随之发现了类风湿性关节炎和骨性关节炎关节滑液中可检测到高水平的IL-1。IL-1 通过诱导MMP基因表达从而刺激软骨细胞和骨膜产生MMPs，而MMPs 是参与关节组织损伤的主要因素，可以促进骨基质的降解，抑制软骨细胞合成具有透明软骨特性的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原促进生成有纤维母细胞特性的Ⅰ型胶原，从而使软骨细胞变性，引起软骨缺损和软骨的生物力学改变。IL-1 还可以促进成骨细胞样细胞的增殖和骨吸收，参与骨质增生和软骨下骨囊形变的形成； 刺激软骨细胞和滑膜细胞产生NO，诱导关节软骨细胞的凋亡； 促进软骨细胞和滑膜细胞产生PGE2，参与炎症反应。IL-1β刺激产生的MMP 和PGE2 还可促进滑膜成纤维细胞合成Ⅰ型胶原，增加OA 滑液中纤维素的含量。IL-1协同TNF-α还可促进血浆酶原激活物的产生。引起软骨基质破坏和滑液微晶体的产生，加重关节滑膜的炎症反应。
TNF-α来源于巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞等。TNF-α和IL-1一样通过抑制软骨基质合成、诱导MMP产生而在OA 的软骨破坏中发挥重要作用。实验证实TNF-α能抑制软骨降解。OA的软骨细胞表达表达大量的p55TNF-α受体，后者能使OA软骨对TNF-α刺激的敏感性增强。而且OA软骨要比正常软骨产生更多的TNF-α和TNF-α转化酶( TACE)mRNA。由此推之，p55 TNF-α的抑制剂可以使TNF诱导的软骨细胞外基质降解减少。
肿瘤坏死因子(TNF)是炎症性和自身免疫疾病的重要致病因素，抗体Fc片段融合的可溶性蛋白TNFR2-Fc(商品名为Enbrel)是治疗类风湿性关节炎和牛皮癣的重大药物。目前，针对TNF引起疾病的已上市药物中Enbrel(Amgen公司)、Humira(ABT公司)和Remicade(J&G公司)都具有治疗类风湿性关节炎和牛皮癣的作用，但三者的疗效差异较大，Remicade还具有治疗溃疡性结肠炎的作用。导致这样治疗效果差异的原因最主要在于几种药物的组织分布区域和浓度的差异。
白细胞介素-1受体在炎症区高表达和密集分布，白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra，商品名为Kineret)不但和炎症区的白细胞介素-1受体高亲和力结合，还是治疗各种炎症疾病特别是关节炎的重要药物。已知Kineret在炎症治疗方面优于Enbrel，二者在药物半衰期、组织分布等方面完全不同，其原因主要是Kineret的靶向作用要明显优于Enbrel。药物TNFR2-Fc和IL-1ra在氨基酸组成和结构上存在一定的差异，二者分布在一起发挥作用的几率小。因此开发出利用IL-1ra特异性将Enbrel分布到不同组织的靶向性药物对于治疗TNF 和IL-1引起的不同组织中自身免疫疾病和炎症性疾病，特别是骨性关节炎疾病，将具有十分重要的意义。
发明内容
鉴于以上的在治疗骨性关节炎中的局限性，本发明的目的是提供一种将TNFR2-Fc基因与IL-1ra基因的重组TNFR2-Fc-IL-1ra基因并构建到GC-rich高效表达载体，转化至CHO细胞中进行表达，并对表达的产物进行分离纯化和鉴定；通过对膝关节局部注射TNFR2-Fc-IL-1ra，在IL-1ra特异性作用下，将TNFR2-Fc分布到目标组织，起到治疗骨性关节炎疾病的效果。
含目标基因TNFR2-Fc-IL-1ra的GC-rich高效表达载体的构建方法是：
用Not I和EcoR I双酶切已有质粒pMH4-TNFR2-Fc-IL 1ra和载体pMH3(GC-rich高表达载体)，65 ℃热失活内切酶后，纯化回收TFI目的片段和pMH3载体片段，30 μl连接体系用T4 DNA连接酶室温放置2-3 h后，4 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒酶切和测序验证连接是否正确。
TNFR2-Fc-IL-1ra蛋白的表达与药效研究方法：
1、CHO细胞转染、筛选及评价
将构建好的含目标基因TNFR2-Fc-IL-1ra高表达质粒pMH3-TNFR2-Fc-IL-1ra经过线性化处理后，通过电转仪转染入CHO-KSD细胞中，高表达细胞株通过斑点印迹法(dot-blot)或酶联免疫法(ELISA)进行筛选，经三轮筛选获得单一稳定高表达细胞株，作为研究对象。将筛选的细胞株在无血清培养基B001(购自美国安普公司)中悬浮驯化，并在安普公司50L激流反应器中进行大规模培养。
用Not I和EcoR I双酶切，获得载体和目的基因片段，转染CHO细胞进行表达。在高GC DNA含量的表达载体pMH3中，TNFR2-Fc-IL 1ra在6小时内表达量达到30mg/l，在对照载体pcDNA 3.1中表达量很低或不表达。在我们以前的研究中证实，非编码的富含GC 的DNA 片段(包括内含子)是一种超级“染色质开放元件”，在哺乳动物细胞基因表达中起关键作用，认为GC含量越高，基因的表达水平越高。而且对于分子量较大或者小肽很难在哺乳动物细胞中表达，本研究中利用高GC含量的pMH3载体成功实现了大分子量TNFR2-Fc-IL 1ra蛋白(200kDa)在CHO细胞中的高表达，为生物药物的大规模生产提供了很好的条件。
筛选的稳定高表达克隆经过悬浮驯化后，在安普公司独有的激流式反应器上进行放大培养，在连续培养13天过程中，第5天细胞密度最大达到1×107 cells/ml；随着时间延长细胞密度逐渐下降，细胞活率降低，ELISA检测TNFR2-Fc-IL 1ra融合蛋白的表达量逐渐增加，积累，第13天的表达量为176.8 mg/l。后期由于细胞活率的降低，影响产物的质量，因此培养停止在此阶段，收液，进行产物的纯化和鉴定。
2、产物的分离纯化和鉴定
大规模培养后的丰收液经过4750 g/min，4 ℃离心10 min，取上清，经过0.22 μm过滤后，进行Mabselect(GE公司)亲和层析，收集洗脱峰进一步进行S-sepharose阳离子交换层析(SP SFF)，收集活性峰进行HPLC分析纯化产物的纯度。分离纯化的产物经过SDS-PAGE/PAGE和Western印迹进行鉴定验证。
TFI细胞表达上清液经过Mabselect亲和层析后，蛋白纯度约为86.4%，主要杂蛋白为TFI的聚体形式(13.6%)；再经过SP SFF阳离子交换层析后，去除聚体杂蛋白，SDS-PAGE结果显示为单一条带，与Western blot检测结果相符，单体蛋白分子量约为100 kDa，分离纯化的产物经HPLC分析，纯度在99%以上。
3、TNFR2-Fc-IL-1ra的体内组织分布和药效
用131I标记的方法对TNFR2-Fc-IL-1ra和对照药物TNFR2-Fc进行标记，以相同摩尔剂量静脉注射入SD大白鼠体内，研究二者不同时间内在各个组织的分布情况，每个组织重复5次。
在患有前爪炎症水肿的大白鼠体内相同摩尔剂量皮下注射TNFR2-Fc-IL-1ra和TNFR2-Fc后，测定体内的血药浓度，研究其对炎症的治疗作用。
放射性同位素131-I标记的TNFR2-Fc在大白鼠体内组织分布情况。放射性同位素131-I标记的TNFR2-Fc-IL 1ra在大白鼠体内组织分布情况。这两个实验结果表明TNFR2-Fc(Enbrel)主要分布于血液中，其它组织中分布很少，而TNFR2-Fc-IL 1ra与TNFR2-Fc(Enbrel)完全不同(PKa的差异)，分布在不同组织中，这其中主要原因是IL-1ra特异性与不同组织中的IL-1结合，将TNFR2-Fc(Enbrel)靶向性带到这些组织中。TNFR2-Fc-IL 1ra和TNFR2-Fc在大白鼠体内相同摩尔剂量皮下注射后，有效治疗前爪炎症水肿的血药浓度测定结果，结果表明TNFR2-Fc-IL 1ra静脉注射后在血液中分布远远比TNFR2-Fc在血液中分布少，但药效相当，这在很大程度上减少了副作用。这些结果提示TNFR2-Fc-IL 1ra的IL 1ra部分可能和结缔组织，尤其是皮下结缔组织结合，带动TNFR2-Fc到结缔组织起治疗效果。这说明将TNFR2-Fc与IL 1ra融合在一起，克服了二者在氨基酸组成和结构上差异导致的组织分布不同的弊端，实现了利用IL 1ra靶向性的将TNFR2-Fc带到不同组织中。同时，二者联合使用可能有双重阻断的效果，将其融合在一起将形成联合或协同效应。
具体实施方式
应当理解，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
含目标基因TNFR2-Fc-IL-1ra的GC-rich高效表达载体的构建方法是：
用Not I和EcoR I双酶切已有质粒pMH4-TNFR2-Fc-IL 1ra和载体pMH3(GC-rich高表达载体)，65 ℃热失活内切酶后，纯化回收TFI目的片段和pMH3载体片段，30 μl连接体系用T4 DNA连接酶室温放置2-3 h后，4 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒酶切和测序验证连接是否正确。
TNFR2-Fc-IL-1ra蛋白的表达与药效研究方法：
1、CHO细胞转染、筛选及评价
将构建好的含目标基因TNFR2-Fc-IL-1ra高表达质粒pMH3-TNFR2-Fc-IL-1ra经过线性化处理后，通过电转仪转染入CHO-KSD细胞中，高表达细胞株通过斑点印迹法(dot-blot)或酶联免疫法(ELISA)进行筛选，经三轮筛选获得单一稳定高表达细胞株，作为研究对象。将筛选的细胞株在无血清培养基B001(购自美国安普公司)中悬浮驯化，并在安普公司50L激流反应器中进行大规模培养。
2、产物的分离纯化和鉴定
大规模培养后的丰收液经过4750 g/min，4 ℃离心10 min，取上清，经过0.22 μm过滤后，进行Mabselect(GE公司)亲和层析，收集洗脱峰进一步进行S-sepharose阳离子交换层析(SP SFF)，收集活性峰进行HPLC分析纯化产物的纯度。分离纯化的产物经过SDS-PAGE/PAGE和Western印迹进行鉴定验证。
3、TNFR2-Fc-IL-1ra的体内组织分布和药效
用131I标记的方法对TNFR2-Fc-IL-1ra和对照药物TNFR2-Fc进行标记，以相同摩尔剂量静脉注射入SD大白鼠体内，研究二者不同时间内在各个组织的分布情况，每个组织重复5次。
在患有前爪炎症水肿的大白鼠体内相同摩尔剂量皮下注射TNFR2-Fc-IL-1ra和TNFR2-Fc后，测定体内的血药浓度，研究其对炎症的治疗作用。
Claims (2)
1.一种重组蛋白TNFR2-Fc-IL-1ra，其制备方法是：
1、将TNFR2-Fc基因与IL-1ra基因重组成TNFR2-Fc-IL-1ra基因，并将构建到表达载体质粒，将构建好的含TNFR2-Fc-IL-1ra基因表达质粒经过线性化处理后，通过电转仪转染入CHO细胞中，经筛选获得单一稳定表达细胞株，将筛选获得的表达细胞株悬浮驯化培养；
2、产物的分离纯化和鉴定
培养后的丰收液经过4750 g/min，4 ℃离心10 min，取上清，经过0.22 μm过滤后，进行Mabselect亲和层析，收集洗脱峰进一步进行S-sepharose阳离子交换层析(SP SFF)，收集活性峰进行HPLC分析纯化产物的纯度，获得TNFR2-Fc-IL-1ra蛋白。
2.根据专利要求1所述的重组蛋白TNFR2-Fc-IL-1ra，其特征在于：TNFR2-Fc-IL-1ra蛋白可用于治疗骨性关节炎疾病。
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| CN2011101235208A CN102277381A (zh) | 2011-05-13 | 2011-05-13 | 一种重组蛋白的制备方法及其应用 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468662A (zh) * | 2013-09-29 | 2013-12-25 | 惠觅宙 | 一种重组人透明质酸酶、其生产纯化方法、制剂及使用方法与应用 |
| CN104342420A (zh) * | 2013-07-30 | 2015-02-11 | 惠觅宙 | 一种重组长效人透明质酸酶、其编码基因、生产方法及应用 |
| CN106872713A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-06-20 | 许洋 | 一种微量蛋白质原位检测的免疫质谱试剂盒及制备方法 |
| CN112553252A (zh) * | 2019-09-06 | 2021-03-26 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | Tnfr2基因人源化的非人动物的构建方法和应用 |
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2011
- 2011-05-13 CN CN2011101235208A patent/CN102277381A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20111214 |